人巨細胞病毒核酸標準物質研制與應用

付岳 王瑞霞鄒迎曙李爾華高旭年王軍★

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人巨細胞病毒核酸標準物質研制與應用

付岳1王瑞霞1鄒迎曙1李爾華2高旭年2王軍1★

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是威脅人類健康的最重要病原之一。隨著分子生物學技術的發展，HCMV核酸水平的檢測逐漸得到了廣泛的認可，這也就需要研制HCMV核酸標準物質來保證檢驗數據的真實可靠。本文簡要介紹了國內外目前存在的HCMV核酸標準物質的研制情況，并對這些標準物質在應用中遇到的問題進行了闡述，旨在為人巨細胞病毒核酸檢測診斷試劑的標準化，以及為其質量控制提供參考。

人巨細胞病毒；核酸；標準物質

巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）屬于β皰疹病毒亞科，病毒基因組大約235 kb。病毒感染具有嚴格的宿主特異性，例如人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）只能感染人［1］。HCMV感染在人群中很普遍但都無任何感染癥狀［2］。孕婦感染HCMV可引起新生兒宮內感染，導致胎兒畸形等嚴重疾患［3?4］。另外，在免疫功能低下的人群中，例如在艾滋病、器官移植病人中若感染 HCMV 將引起嚴重的并發癥［5?6］。目前實驗室檢測HCMV感染的方法有病毒學檢測、血清學檢測與核酸檢測等［7］。其中血清學的檢測是應用最普遍的檢測方法，但是由于血清學檢測的局限性以及臨床應用的需要，HCMV核酸檢測逐步開始受到重視。然而最近有關HCMV檢測的能力驗證報告指出分子診斷缺乏重復性與可比性，究其原因主要是當前缺乏可用的國際標準物質［8］。在臨床實驗室檢驗中，采用可靠的標準物質是得到高質量檢測數據的前提和保證，也是作出完整科學結論的基礎。無論為體外診斷試劑制造商對產品進行量值溯源，還是實驗室間的能力驗證（室間質評），都離不開HCMV核酸標準物質。目前世界衛生組織（World Health Organization，WHO）、美國國家標準和技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）已經研制完成HCMV國際標準物質，國內也開展了相關的工作。本文對HCMV核酸標準物質的研制進展做簡要概述，旨在為人巨細胞病毒核酸檢測診斷試劑的標準化，以及為其質量控制提供參考。

1 HCMV核酸標準物質研制進展

1.1 WHO國際標準物質

目前WHO所研制的大部分核酸類國際標準物質都是用接近天然的生物材料制備而成。例如有些核酸類國際標準物質是將滅活的野生型病毒或者培養物稀釋于人源陰性血清或通用稀釋液，凍干后分裝，按照WHO的固定程序對制備的候選標準物質進行穩定性和均勻性檢驗、多中心合作聯合定值［9］。WHO制備的國際標準物質的表述單位通常為IU（international unit），這種標準物質量值是WHO經多中心聯合定值后，確定其可以作為第一個國際標準物質后賦予的一個標準數值，后續標準物質的更替則以第一個標準值為標準繼續定值。

2008年6月在英國國家生物制品鑒定所（the National Institute for Biological Standards and Con?trol，NIBSC）舉行的基因擴增技術標準化臨床診斷會議上討論了關于HCMV標準品制劑的建議，對候選原材料和配方進行了討論，并且最終確定候選標物是包含完整病毒顆粒的HCMV Merlin毒株（NIBSC code 09/162）［10］。Merlin 毒株為 gB1 基因型，與其它實驗室常用HCMV毒株相比，該低傳代株具有良好的HCMV的特征，包含近似于完整的HCMV基因組，且已完全測序（Gene bank登錄號：AY446894）［11］。制備過程主要是將 HCMV Merlin毒株的培養上清樣本在人胚肺成纖維細胞內增殖，收獲培養上清液后先低速離心，然后超速離心收獲病毒沉淀。考慮到用于HCMV檢測樣本來源的多樣性，候選標準品被溶于通用的緩沖液，該緩沖液含有10 mmol/L的Tris?HCl和0.5%的人血清白蛋白，然后采用各自實驗室所用的樣本基質來進一步稀釋。最后該制劑經過冷凍干燥以確保長期穩定。此標準品是通過來自14個國家的32個實驗室進行聯合定值，其中大多數實驗室都采用實時熒光定量PCR法，最后其量值指定為5×106IU，并被推薦為首個針對HCMV的WHO國際標準物質，主要供臨床醫學實驗室和體外診斷試劑制造商用于以核酸擴增技術為基礎的二次引用HCMV校準試驗［12］。

1.2 NIST國際標準物質

為了建立成分單一且穩定供應的國際標準物質，早在2002年即有專家在WHO會議上提出采用人工合成方法生產國際標準物質，隨即開展了一系列相關研究［13］。其中NIST在HCMV人工合成國際標準物質的研發中取得了很大進展。

不同于HCMV?WHO國際標準物質，NIST研制的HCMV國際標準物質是經過提取純化的HCMV基因組DNA。實驗室用毒株在體外培養時常會產生基因序列缺失而導致假陰性檢測結果，將目的基因連接于質粒中會保持基因組的穩定［14］。由于HCMV基因組大約235 kb，一般質粒載體無法連接，所以NIST研制的HCMV核酸標準物質（SRM2366）是將HCMV基因組通過同源重組方式插入到細菌人工染色體（bacterial artificialchro?mosome，BAC）上，以產生穩定基因組的克隆并且具有低傳染性［15］。SRM2366所用毒株為Towne株，包含了除 IRS1、US1?15、和 UL147 以外相對完整的HCMV基因組。其制備過程主要是將構建好的HCMV Towne BAC轉入EPI300大腸桿菌中，經過培養后收集菌體，再采用堿性裂解法提取純化菌體釋放的BAC DNA，最后將BAC DNA溶于Tris?EDTA（10 mmol/L Tris base，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）通用緩沖液中進行分裝。此種制備方法可以持續獲得穩定基因組的核酸標準品。SRM2366的定值不同于WHO采用實時熒光定量PCR的多中心協作定值，而是采用最新的數字PCR技術，此方法不需要線性標準品即可計算出待檢DNA分子的拷貝數，而且實驗中的探針和引物可以與熒光定量PCR通用。最后，制備的3個水平的HCMV標準品賦值分別為 420 copies/μL，2702 copies/μL，19641 copies/μL，并附有置信水平的不確定度［16］。

1.3 國內人巨細胞病毒標準物質、質控物

隨著HCMV核酸檢測技術在國內臨床實驗室的開展以及《臨床基因擴增實驗室工作規范》的施行，國內相關機構和臨床檢驗實驗室也在探索開發HCMV標準物質、質控物等。在臨床檢驗中HCMV?DNA的定量檢測主要通過尿液、血漿、乳汁等樣本完成，并且由于尿液容易收集，標本陽性檢出率較高，而其它標本陽性檢出率較低［17］，所以目前國內一些臨床實驗室收集HCMV?DNA陽性的患者尿液樣本再經過過濾制備成室內質控物［18］。目前國內實驗室制備的室內質控物一般不添加任何防腐劑與穩定劑，這樣可避免基質效應的不確定影響；并且研究也發現不加入穩定劑與向尿液室內質控物中加入穩定劑（牛血清白蛋白）無明顯差別［19］。但是，此類質控物一般只能作為實驗室內質控，無法像WHO或者NIST制備的HCMV核酸標準物質一樣方便的進行更替換代以及量值溯源，在應用的過程中也就有所限制，對促進HCMV核酸檢測標準化作用不大，所以國內也有些公司或機構研制了可溯源至WHO?HCMV國際標準物質的二級標準物質，主要用于校準儀器和裝置、實驗室質量控制等，在一定程度上解決了這個問題。

2 HCMV核酸標準物質的應用

目前，WHO等多個國際組織正在通過廣泛應用國際參考物質，來證明其在核酸檢測標準化過程中的實際應用價值。其中HCMV核酸國際標準品在其中起到了重要的作用。在實驗室間的能力驗證中，Rychert等［20］應用 WHO?HCMV 核酸標準物質來評價各參與實驗室現行的HCMV核酸檢測方法，結果顯示WHO?HCMV核酸標準物質促進了HCMV檢測的標準化并且各實驗室數據具有可比性。HCMV核酸標準物質還應用于產品的溯源、儀器的評價和校準等。目前羅氏、雅培等體外診斷試劑制造廠商的校準品均溯源至WHO?HC?MV標準物質，并顯示了良好的一致性，不過各檢測系統的靈敏度仍然具有差異［21］。Tsai等［22］也應用WHO?HCMV標準物質來對不同HCMV核酸檢測系統的性能特征、相關性和工作流程等進行評價。而且隨著數字PCR技術的應用，為了評價熒光定量PCR和數字PCR等不同平臺在核酸定量檢測中的性能，Pav?i?等［23?24］分別應用 WHO 和 NIST研制的2種核酸標準物質進行試驗，結果表明數字PCR受到不同組成的PCR反應組分所產生的影響更小，并且在檢測臨床血漿樣本中HCMV時，發現當病毒DNA載量≥4 log10時數字PCR的精密度明顯高于熒光定量PCR的精密度。

在HCMV核酸以及其它核酸標準物質的廣泛應用的過程中也出現了一些問題，例如，核酸提取效率的問題。例如，WHO和NIST研制的HCMV核酸國際標準物質制備方法不同，SRM2366國際標準物質為人工構建具有基本完整的病毒基因組，并且低傳染性，但類似于此類的合成的核酸未參與核酸提取過程，故不能反映病毒核酸的提取效率；同時，國際參考物質在于提供一個準確的數值，而不是關注提取效率，因此在制備國際參考物質的時候是否需要考慮提取過程還有待討論。另外，HCMV核酸標準物質的互換性也需要注意。互換性為不同檢測系統對某個參考物質和來自健康或疾病個體代表樣品的檢測所得的結果量值一致，即各個樣品或參考物質的檢測值可以在不同檢測系統間互換［25］。例如，Hayden 等［26］在研究HCMV核酸標準物質的互換性時發現，通過8家實驗室采用10種不同的熒光定量PCR檢測WHO?HCMV標準物質與50份臨床樣本，通過線性回歸和對應分析WHO?HCMV標準物質的互換性，發現在此分析方法下WHO?HCMV標準物質互換性較差。并且HCMV核酸國際標準物質在不同基質中也會有影響，Jones等［27］研究表明使用全血稀釋WHO?HCMV標準物質時會產生基質效應，全血稀釋的WHO?HCMV標準物質進行HCMV全血定量測定校正試驗時，樣本的測量濃度值會偏高。然而使用血漿或通用緩沖液對標準物質進行稀釋時無基質效應出現；而SRM2366國際標準物質，雖然不需要對其進行提取，但是在實驗中采用血漿或者全血作為稀釋液進行稀釋后，于臨床樣本一同進行測量結果顯示互通性良好。

小結

隨著HCMV相關疾病研究的深入，HCMV的危害越來越受到重視。與其它方法相比，核酸水平的檢測更為簡便、可靠，并且可以做到早期檢測及量化，對判斷HCMV的活動性和評價抗病毒治療療效的動態監測有著重要的意義。而相應國際標準品建立工作也在不斷推進，已存在的WHO和NIST的HCMV核酸標準物質在一定程度上促進了HCMV檢測以及核酸檢測的標準化。當然，在推動HCMV核酸檢測的標準化中也遇到了很多問題，例如上文中提到的核酸提取效率問題，所以更需要推動核酸檢測的全自動化以減少手動提取核酸的誤差。并且目前國內市場上存在著大約10家HCMV核酸診斷試劑生產廠家，由于國內還缺乏可靠的HCMV核酸標準物質，所以大部分市售的HCMV核酸檢測試劑的標準化還存在問題，這也就更需要相關機構去努力研制出可靠的HCMV核酸標準物質以促進核酸檢測的標準化，為臨床準確診斷提供合理依據。

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The development and application of reference materials for human cytomegalo?virus nucleic acids

FU Yue1,WANG Ruixia1,ZOU Yingshu1,LI Erhua2,GAO Xunian2,WANG Jun1★
(1.Beijing Key Laboratory of Medical Device Testing and Safety Evaluation,Beijing Institute of Medical Device Testing,Beijing,China,101111;2.Guangzhou Bangdesheng Biological Technology Co.,Ltd,Guangzhou,Guangdong,China,510665)

Human cytomegalovirus(HCMV)is one of the most important pathogens which are threatening people health in the world.With the development of molecular biology techniques,value of HCMV DNA detection has been recognized gradually.The reference materials for HCMV test are critical to guarantee the quality of the test.In this study,the research progress of the reference materials for HCMV nucleic acid amplification testing and the problems in application will be summarized.The aim of this study was to standardize the diagnostic reagents for human cytomegalovirus nucleic acid testing and provide a reference for the quality control.

Human cytomegalovirus;Nucleic acid;Reference materials

北京市科技計劃課題（Z151100002115047）

1.北京市醫療器械檢驗所，醫療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室，北京101111

2.廣州邦德盛生物科技有限公司，廣東，廣州510665

★通訊作者：王軍，E?mail：wangjun1@bimt.org.cn