解淀粉芽孢桿菌植物亞種CGMCC 11640對山核桃干腐病菌的抑制機制

程 敏，徐秋芳

（浙江農林大學 浙江省森林生態系統碳循環與固碳減排重點實驗室，浙江 臨安311300）

解淀粉芽孢桿菌植物亞種CGMCC 11640對山核桃干腐病菌的抑制機制

程 敏，徐秋芳

（浙江農林大學 浙江省森林生態系統碳循環與固碳減排重點實驗室，浙江 臨安311300）

葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃Carya cathayensis干腐病是導致山核桃樹發病甚至死亡的主要病害之一，對山核桃產業帶來了嚴重威脅。通過平板對峙法成功篩選出1株對病原菌有明顯抑制效果的解淀粉芽孢桿菌植物亞種Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum（菌種保藏號：CGMCC 11640）。試圖通過掃描電鏡探究該菌株對山核桃干腐病菌的抑制機制。對峙培養4，6和7 d后，比較菌絲和孢子形態，發現病原菌菌絲出現萎縮干癟現象，培養時間越長，菌絲萎縮干癟程度越大；對峙培養4 d時病原菌孢子正常，而到第6天時部分病原菌孢子表現出凹陷、萎縮現象，第7天異常孢子數量增加。用CGMCC 11640發酵上清液與水分別按V（上清液）∶V（水）＝1∶9，2∶8，5∶5的比例配制成的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）混合培養基培養病原菌，結果發現病原菌菌絲抑制率分別為75.81%，88.84%和94.30%，說明滅菌發酵上清液對病原菌有抑制作用。電鏡觀察發現，病原菌菌絲在含有滅菌發酵上清液的PDA混合培養基上出現萎縮干癟現象。通過掃描電鏡觀察，推測CGMCC 11640菌株及其代謝物對病原菌的抑制作用主是通過破壞菌絲和孢子細胞壁和細胞膜，使細胞內原生質泄露，從而導致菌絲和孢子萎縮，最終殺死病原菌細胞。圖3表1參20

森林保護學；山核桃干腐病；解淀粉芽孢桿菌植物亞種；抑菌機制；掃描電鏡

芽孢桿菌Bacillus因能產生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的芽孢［1］，具有在不同環境下存活、定殖與繁殖等方面的優勢［2］，對植物病菌的作用機制多樣［2－3］，使得芽孢桿菌成為一種理想的生防菌。芽孢桿菌的作用機制主要包括競爭作用、拮抗作用和誘導植物抗性［2－3］等方面，其中拮抗作用是指生防菌株產生次生代謝產物抑制有害病原菌的生長、發展或直接殺滅病原菌，或是通過次生代謝產物改變自身周圍的微環境，使之不利于病原微生物的生長繁殖［4］。芽孢桿菌產生的拮抗物質主要有抗生素、細菌素、細胞壁降解酶類和其他抗菌蛋白及揮發性抗菌物質［3］。脂肽類抗生素是一大類重要的拮抗物質［5］，其理化性質穩定，對高溫、酸和弱堿具有一定的耐受［6］，已成為芽孢桿菌拮抗物質領域的研究重點。研究發現，解淀粉芽孢桿菌植物亞種Botryosphaeria amyloliquefaciens subsp.plantarun FZB42能夠產生surfactin,fengycin等脂肽類物質抑制立枯絲核菌［7］，解淀粉芽孢桿菌SWB16菌株產生的fengycin和 iturin對球孢白僵菌分生孢子的發芽和菌絲生長具有顯著的抑制作用［8］。借助掃描電子顯微鏡探究脂肽類抗生素對植物病原菌的抑菌機制表明，脂肽類抗生素導致真菌菌絲及孢子畸形，細胞膜破裂，從而使細胞代謝無法正常進行，最終導致細胞的死亡［9－11］。山核桃 Carya cathayensis是投入產出效益很高的經濟樹種之一［12］。由于純林化及片面追求產量的經營措施，導致山核桃林病蟲害日趨嚴重［13］，其中危害最大的是山核桃干腐病。山核桃干腐病又稱山核桃潰瘍病、墨汁病，病原菌為葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea。2009年以來，浙江省與安徽省將近90%的山核桃林感染山核桃干腐病，且病情繼續加重。2015年僅臨安市枯死的山核桃樹累計達3.7萬株，損失1 000萬元之多。迄今為止對山核桃干腐病缺乏有效的防治方法，雖然某些化學農藥有一定的效果，但化學農藥的長期大量使用，產生了環境污染、病蟲抗藥性及農藥殘留等令人擔憂的問題。因此，從生物防治角度來控制山核桃干腐病病情將是有效的途徑。本研究應用實驗室前期分離得到的微生物資源，通過平板對峙法篩選出1株對病原菌有明顯抑制效果的解淀粉芽孢桿菌，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌植物亞種（菌種保藏號：CGMCC 11640）。為初步了解CGMCC 11640產生的拮抗物質對山核桃干腐病病原菌的抑菌機制，推測拮抗物質中是否含有耐高溫的脂肽類抗生素，本研究利用掃描電子顯微鏡觀察CGMCC 11640菌體及其滅菌發酵上清液對山核桃干腐病病原菌菌絲生長及形態的影響，為山核桃干腐病生防菌的開發利用提供初步理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

山核桃干腐病病原菌，解淀粉芽孢桿菌植物亞種（菌種保藏號為CGMCC 11640）。

1.2 CGMCC 11640菌體對病原菌的抑制作用

平板對峙法共同培養病原菌與CGMCC 11640。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板中央接種病原菌圓餅，在距平板中心10 mm的兩側接CGMCC 11640圓餅，3個圓餅保持在一條水平線上，28℃培養。從抑菌帶一側的病原菌菌落邊緣切正方形小塊制備掃描電鏡樣品，觀察對峙培養4，6，7 d后病原真菌的形態變化，以單獨培養的病原菌作為對照。

1.3 CGMCC 11640滅菌發酵上清液對病原菌的抑制作用

1.3.1 制備含CGMCC 11640滅菌發酵上清液的PDA混合培養基 選取CGMCC 11640菌的單菌落，接種于100 mL PDA液體培養基中，在 37℃，搖瓶轉速為180 r·min－1條件下培養 14 h，得到CGMCC 11640菌株種子液。CGMCC 11640種子液按接種量為3%（體積分數）分別接種于500 mL PDA液體培養基中，在37℃，180 r·min－1條件下培養48 h，即得到CGMCC 11640菌株發酵液。將CGMCC 11640菌株發酵液3 000 r·min－1離心15 min后，去除菌體，得到CGMCC 11640滅菌上清液。將CGMCC 11640發酵上清液與水分別按V（上清液）∶V（水）=1∶9（處理1），2∶8（處理2），5∶5（處理3）的比例配制成的含有CGMCC 11640滅菌發酵上清液的PDA混合培養基。

1.3.2 CGMCC 11640滅菌發酵上清液對病原菌菌絲生長的抑制作用 采用生長速率法測定菌絲抑制率。將含有CGMCC 11640滅菌發酵上清液的PDA混合培養基，在培養基中央分別接種直徑10 mm的病原菌菌餅，重復3次·處理－1。28℃培養5 d后，十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算菌絲抑制率。抑制率（%）=［（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑］×100%。

1.3.3 CGMCC 11640滅菌發酵上清液對病原菌菌絲形態結構的影響 在含有CGMCC 11640滅菌發酵上清液的PDA混合培養基中央接種直徑10 mm的病原菌菌餅，28℃培養。重復3次·處理－1。從病原菌菌落邊緣切正方體小塊制備掃描電鏡樣品，觀察培養3 d后病原真菌菌絲的形態變化，以在不含CGMCC 11640滅菌發酵上清液的PDA純培養基上生長的病原菌作為對照。

1.3.4 掃描電鏡樣品制備 將切取的菌落邊緣正方體小塊，浸沒于體積分數為2.5%的戊二醛，4℃下靜置過夜。0.1 mol·L－1磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸洗樣品15 min，重復3次。隨后，將樣品依次浸沒于梯度體積分數為30%，50%，70%，80%，90%，95%的乙醇中15 min，再用體積分數為100%的乙醇洗脫2次，20 min·次－1。用V（乙醇）∶V（醋酸異戊酯）＝1∶1混合液處理樣品30 min，再用體積分數為100%醋酸異戊酯處理樣品2 h。樣品自然風干后鍍金，使用掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1 CGMCC 11640菌體對病原菌的抑制作用

平板對峙培養時病原菌與CGMCC 11640形成抑菌帶，說明CGMCC 11640抑制病原菌菌絲的生長。用掃描電鏡觀察病原菌單獨培養（對照組）以及病原菌與CGMCC 11640對峙培養4，6，7 d時病原菌絲形態發現，對照組培養4，6，7 d的病原菌菌絲均通體完整飽滿，粗細均勻，圖1A為對照組培養4 d時的掃描電鏡圖；對峙培養的病原菌菌落邊緣菌絲明顯異常，培養第4天時有部分菌絲出現萎縮干癟現象（圖1B），第6天則絕大多數菌絲出現縮干癟現象（圖1C），到培養第7天菌絲全部萎縮干癟（圖1D），說明后期干癟程度比前期嚴重。對照組的孢子形態飽滿（圖2A），而對峙培養第4天時病原菌孢子正常（圖2B），而到第6天時部分病原菌孢子表現出凹陷、萎縮現象（圖2C），第7天異常孢子數量增加花板（圖2D）。畸形孢子的數量隨之培養時間的延長而增多。

圖1 掃描電鏡下CGMCC 11640菌體對山核桃干腐病菌絲形態的影響Figure 1 Effect of CGMCC 11640 cells on hypha of Botryosphaeria dothidea under scanning electron microscope

2.2 CGMCC 11640滅菌發酵上清液對病原菌的抑制作用

2.2.1 CGMCC 11640滅菌發酵上清液對病原菌菌絲生長的抑制效果 測量含有不同比例CGMCC 11640滅菌發酵上清液的PDA混合培養基上生長5 d后的病原菌菌落直徑，計算出菌絲抑制率如表1。結果表明：CGMCC 11640滅菌發酵上清液對山核桃干腐病病原菌菌絲生長均具有較強的抑制作用，含滅菌發酵上清液與水的比例分別為V（上清液）∶V（水）=1∶9，2∶8，5∶5的PDA混合培養基上生長的病原菌菌絲抑制率分別為75.81%，88.84%和94.30%，說明抑制效果在實驗范圍內隨著發酵液含量的增加而增強。

2.2.2 含有CGMCC 11640滅菌發酵上清液培養基上的病原菌菌絲形態結構 分別切取不含CGMCC11640滅菌發酵上清液的PDA純培養基（對照組）和含有CGMCC 11640滅菌發酵上清液PDA混合培養基（處理組）上生長3 d后的病原菌邊緣菌落，制成掃描電鏡樣品，觀察菌絲形態變化。結果發現：對照組病原菌絲菌絲整體圓潤光滑，粗細均勻（圖3A），處理組病原菌菌絲出現萎縮干癟現象（圖3 B），觀察結果與2.1相同，說明耐高溫的CGMCC 11640的代謝產物對病原菌起抑制作用。

圖2 掃描電鏡下CGMCC 11640菌體對山核桃干腐病孢子形態的影響Figure 2 Effect of CGMCC 11640 cells on spores of Botryosphaeria dothidea under scanning electron microscope

表1 CGMCC 11640滅菌發酵上清液對山核桃干腐病菌絲抑制率Table 1 Hyphal inhibitory ratio of CGMCC 11640 sterilized supernatant liquor against B.dothidea

圖3 掃描電鏡下CGMCC 11640滅菌發酵上清液對山核桃干腐病菌絲形態的影響Figure 3 Effect of sterilized supernatant liquor from CGMCC 11640 on hypha of B.dothidea under scanning electron microscope

3 討論

本研究通過掃描電鏡觀察，結合其他研究者對芽孢桿菌抑真菌的機制成果推測，得出結論：CGMCC 11640菌株及其代謝物對病原菌的抑制作用主是通過破壞菌絲和孢子細胞壁和細胞膜，使細胞內原生質的泄露，從而導致菌絲和孢子萎縮，最終殺死病原菌細胞。

非核糖體合成的脂肽類抗生素是芽孢桿菌產生的拮抗物質中重要的一類。常見的三大家族脂肽類物質surfactins，iturins和fengycins在防治植物病害中最早開始研究［14－16］。因脂肽類穩定的理化性質及廣泛的抗菌活性使其成為生防菌劑的研究熱點。脂肽類的抗菌機制研究主要集中在作用于細胞膜，引起細胞膜的破裂和細胞質的泄露［17－19］。陶陽等［10］采用顯微技術觀察發現2種抗菌脂肽surfctin和fengycin能夠導致桃軟腐病菌菌絲體變形，細胞壁和細胞膜的破裂，原生質的泄露，細胞器、細胞核出現異常，使細胞代謝無法正常進行，最終導致細胞的死亡。胡陳云等［11］通過掃描電鏡觀察發現，被抗菌脂肽抑制的人參病原菌菌絲出現明顯萎縮、皺縮現象。有研究表明：脂肽抗生素理化性質穩定，如較好的熱穩定性，121℃高溫處理仍有較高的活性［20］。本研究用含有CGMCC 11640滅菌發酵上清液的PDA混合培養基培養病原菌，發現病原菌菌絲生長受到抑制，說明CGMCC 11640發酵液中含有耐高溫的抑菌物質。然后利用掃描電鏡觀察與CGMCC 11640菌株對峙培養以及在含有CGMCC 11640滅菌發酵上清液的培養基上生長的病原菌菌絲形態結構，發現病原菌菌絲形態均發生異常，主要表現為菌絲萎縮、干癟、形成褶皺，但沒有觀察到菌絲體的外壁溶解現象；對峙培養6 d時觀察病原菌孢子出現凹陷、萎縮現象，畸形孢子的數量隨著培養時間的延長而增多。由此說明：CGMCC 11640通過代謝產物破壞細胞壁和細胞膜，使細胞內原生質的泄露，從而導致菌絲和孢子萎縮，與報道的有關脂肽抗生素的作用機制相一致。后續采用酸沉淀法提取脂肽類物質，經HPLC，LC-MS技術分析鑒定得出，CGMCC 11640菌株能夠產生surfactins，iturins和fengycins三大類脂肽類物質。2015年5月進行初步林間試驗，將脂肽粗提物與愈合劑混合后涂在山核桃干腐病斑處，2016年5月觀察發現，傷口愈合，不再有黑色液體流出，表明CGMCC 11640產生的脂肽類物質對山核桃干腐有較好的抑制作用。因此，可以將CGMCC 11640菌株產生的脂肽類抗生素制成生物農藥防治山核桃干腐病。

4 致謝

本研究承蒙浙江農林大學林業與生物技術學院王彥先生在掃描電鏡使用方面的技術指導。謹此致謝！

［1］ 李晶，楊謙．生防枯草芽孢桿菌的研究進展［J］．安徽農業科學，2008，36（1）：106－111．LI Jing,YANG Qian.Research progress on biocontrol Bacillus subtilis［J］.J Anhui Agric Sci,2008,36（1）:106－111.

［2］ 陳中義，張杰，黃大昉．植物病害生防芽孢桿菌抗菌機制與遺傳改良研究［J］．植物病理學報，2003,33（2）：97－103．CHEN Zhongyi,ZHANG Jie,HUANG Dafang.Research progress on antimicrobial mechanism and genetic engineering of Bacillus for plant diseases biocontrol［J］.Acta Phytopathol Sin,2003,33（2）:97-103.

［3］ 彭研，陳相艷，裘紀瑩，等．生防芽孢桿菌的研究進展［J］．山東農業科學，2013,45（7）：138－140．PENG Yan,CHEN Xiangyan,QIU Jiying,et al.Research progress on biocontrol Bacillus［J］.Shandong Agric Sci, 2013,45（7）:138－140.

［4］ 趙東洋．解淀粉芽孢桿菌SWB16脂肽類代謝產物對球孢白僵菌的拮抗作用及發酵條件的初步優化［D］．重慶：西南大學，2014．ZHAO Dongyang.Antagonism of the Lipopeptide Metabolites Produced by Bacillus amyloliquefaciens strain SWBl6 A-gainst Beauveria bassiana and Prelimary Optimization of Its Formation［D］.Chongqing:Southwest Universuty，2014．

［5］ 王智文，劉訓理．芽孢桿菌非核糖體肽的研究進展［J］．蠶業科學，2006,32（3）：392－398．WANG Zhiwen,LIU Xunli.Research advances in nonribosomal peptides produced by Bacillus［J］.Sci Sericul,2006, 32（3）:392－398.

［6］ 徐楊，王楠，李偉，等．海洋枯草芽孢桿菌3512A抗真菌脂肽的分離純化及結構特性鑒定［J］．中國生物防治，2009,25（4）：328－333．XU Yang,WANG Nan,LI Wei,et al.Purification and structural identifications of the antifungal lipopeptides produced by Marine bacterium Bacillus subtilis 3512A［J］.ChinJ Biol Control,2009,25（4）:328－333.

［7］ CHOWDHURY S P,HARTMANN A,GAO Xuewen,et al.Biocontrol mechanism by root-associated Bacillus amyloliquefaciens FZB42:a review［J］.Front Microbiol,2015,6:780.doi:10.3389/fmicb.2015.00780.

［8］ 汪靜杰，趙東洋，劉永貴，等．解淀粉芽孢桿菌SWB16菌株脂肽類代謝產物對球孢白僵菌的拮抗作用［J］．微生物學報，2014,54（7）：778－785．WANG Jingjie,ZHAO Dongyang,LIU Yonggui,et al.Antagonism against Beauveria bassiana by lipopeptide metabolites produced by entophyte Bacillus amyloliquefaciens strain SWB16［J］.Acta Microbiol Sin,2014,54（7）:778－785.

［9］ 孔建，趙白鴿，王文夕，等．枯草芽孢桿菌抗菌物質對鐮刀菌抑制機理的鏡下研究［J］．植物病理學報，1998，28（4）：337－340．KONG Jian,ZHAO Baige,WANG Wengxi,et al.Survey on the antifungal mechanism of Bacillus subtilis cohen to Fusarium oxysporum under the microscope［J］.Acta Phytopathol Sin,1998,28（4）:337－340.

［10］ 陶陽.Bacillus subtilis fmbJ抗菌脂肽對Rhizopus stolonifer作用機理研究［D］.南京：南京農業大學，2010．TAO Yang.Antifungal Mechanism of Antimicrobial Lipopeptide Produced by Bacillus subtilis fmbJ against Rhizopus stolonifer［D］．Nanjing:Nanjing Agricultural University，2010．

［11］ 胡陳云，李勇，劉敏，等．枯草芽孢桿菌ge25對2種人參病原菌的抑制作用及脂肽類抑菌代謝產物的鑒定［J］．中國生物防治學報，2015,31（3）：386－393．HU Chenyun,LI Yong,LIU Min,et al.Antagonism of Bacillus subtilis ge25 against two kinds of ginseng pathogens and identification of antifungal lipopeptide metabolites［J］.Chin J Biological Control,2015,31（3）:386－393.

［12］ 鄭萬鈞．中國樹木志［M］．北京：中國林業出版社，1985：23－79．

［13］ 楊淑貞，丁立忠，樓君芳，等．山核桃干腐病發生發展規律及防治技術［J］．浙江林學院學報，2009,26（2）：228－232．YANG Shuzhen,DING Lizhong,LOU Junfang,et al.Occurrence regularity of Carya cathayensis canker disease and its control［J］.J Zhejiang For Coll,2009,26（2）:228－232.

［14］ CHAN Y K,SAVARD M E,REID L M,et al.Identification of lipopeptide antibiotics of a Bacillus subtilis isolate and their control of Fusarium graminearum diseases in maize and wheat［J］.Biocontrol,2009,54（4）:567－574.

［15］ ONGENA M,JOURDAN E,ADAM A,et al.Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants［J］.Environ Microbiol,2007,9（4）:1084－1090.

［16］ GANZ T,LEHRER R I.Defensin［J］.Curr Opin Immunol,1994,66（4）:584－589.

［17］ DELEU M,BOUFFIOUX O,RAZAFINDRALAMBO H,et al.Interaction of surfactin with membranes:a computational approach［J］.Langmuir,2003,19（8）:3377－3385.

［18］ DELEU M,PAQUOT M,NYLANDER T.Effect of fengycin,a lipopeptide produced by Bacillus subtilis,on model biomembranes［J］.Biophys J,2008,94（7）:2667－2679.

［19］ MAGET-DANA R,PEYPOUX F.Iturins,a special class of pore-forming lipopeptides:biological and physicochemical properties［J］.Toxicologyl,1994,87（1/3）:151－174.

［20］ 裴炎，李先碧，彭紅衛，等．抗真菌多肽APS-1的分離純化與特性［J］．微生物學報，1999，39（4）：344－349．PEI Yan,LI Xianbi,PENG Hongwei,et al.Purification and characterization of a novel antifungal peptide APS-1 produced by Bacillus cereus［J］.Acta Microbiol Sin,1999,39（4）:344－349.

Inhibitory mechanism of Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum CGMCC 11640 against Botryosphaeria dothidea,the pathogen of canker disease of Carya cathayensis

CHENG Min,XU Qiufang
（Key Laboratory of Carbon Cycling in Forest Ecosystems and Carbon Sequestration of Zhejiang Province,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

The canker disease of Carya cathayensis caused by Botryosphaeria dothidea,is one of the diseases in China that has resulted in serious damage and even death for the tree.To overcome the serious disease threat to the C.cathayensis industry,Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum CGMCC 11640,which has shown a strong inhibitive activity in vitro against Botryosphaeria dothidea,was obtained by screening with the dual-culture method and cultured in medium mixtures with ratios of sterilized fermentation supernate to PDA being 1: 9,2:8,and 5:5 （volume ratio）.Then,the inhibitory mechanisms of strain CGMCC 11640 against Botryosphaeria dothidea were further explored by scanning electron microscopy （SEM）.Results revealed that the Botryosphaeria dothidea strain growth rate for the three volume ratio mediums were restrained by 75.8%for 1:9,88.8%for 2:8,and 94.3%for 5:5.The SEM results showed that both bacterial cells and their steril-ized fermentation supernate exhibited strong inhibition activity in vitro against Botryosphaeria dothidea and that the hyphae and spores of Botryosphaeria dothidea exhibited atrophy and introcession.Thus,CGMCC 11640 inhibited Botryosphaeria dothidea by destroying cell membranes （e.g.punching holes in them）and walls of hyphae and spores resulting in leakage of plasmatic material from the inside of the cells.［Ch,3 fig.1 tab.20 ref.］

forest protection;Carya cathayensis canker;Botryosphaeria amyloliquefaciens subsp.plantarum; inhibitory mechanism;scanning electron microscopy（SEM）

S763.1；S664.1

A

2015-0756（2017）02-0326-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.02.017

2016-04-18；

2016-05-23

浙江農林大學農林碳匯與生態環境修復研究中心預研基金項目（2013CB03）；浙江省自然科學基金資助項目（LZ16C1600002）

程敏，從事土壤生物與生物化學研究。E-mail：1071886021@qq.com。通信作者：徐秋芳，教授，博士，博士生導師，從事土壤生物學及森林生態學等研究。E-mail：xuqiufang@zafu.edu.cn