異氟醚對阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因型小鼠學習記憶能力的影響*

趙燕星，蘇殿三，陳 杰，王祥瑞

（1.中國中醫科學院廣安門醫院 麻醉科，北京 100053；2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 麻醉科，上海 200127）

基礎研究·論著

異氟醚對阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因型小鼠學習記憶能力的影響*

趙燕星1，蘇殿三2，陳 杰2，王祥瑞2

（1.中國中醫科學院廣安門醫院 麻醉科，北京 100053；2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 麻醉科，上海 200127）

目的 研究異氟醚對阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因型小鼠學習記憶能力的影響。方法將轉基因小鼠分為轉基因異氟醚組（Tg-iso組）及轉基因空白對照組（Tg-con組），野生型分為野生異氟醚組（Wt-iso組）及野生空白對照組（Wt-con組）。Tg-iso組及Wt-iso組于7個月齡行異氟醚麻醉，吸入1.1%異氟醚2 h，連續5 d。同時Tg-con及Wt-con組吸入30%氧氣與70%氮氣的混合氣體。麻醉后48 h各組行水迷宮實驗，麻醉后5個月各組行Y迷宮實驗。結果 7個月齡時：與Wt-con組比較，Wt-iso組的潛伏期縮短（P= 0.013）；與Tg-con組比較，Tg-iso組的潛伏期縮短（P=0.043）；各組間空間探索實驗目標象限時間和路程百分比的差異無統計學意義（P=0.392和P=0.300）。12個月齡時：與Tg-con組比較，Wt-con組和Tg-iso組辨別錯誤次數明顯減少（P=0.044和P=0.020）。結論 短時間重復吸入低濃度的異氟醚不增加阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因型小鼠及野生對照型小鼠近期及遠期學習記憶能力障礙的風險，反而在一定程度上有減輕的作用。

學習記憶；異氟醚；APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠；Y迷宮；Morris水迷宮

隨著人口老齡化的到來，阿爾茨海默病（alzheimer's disease，AD）的發病率也隨之增高。部分患者，特別是老年患者于手術和麻醉后會出現術后認知功能障礙，兩者主要表現為認知障礙和記憶力損害及日常生活能力下降。那么，手術或麻醉是否會加速AD患者認知功能的改變不得而知。針對AD的發病機制存在多種模型，其中轉基因小鼠模型以模擬AD患者主要病理改變，如老年斑、神經元纖維纏結，成為研究AD發病機制和藥物篩選的理想模型。本實驗采用阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠模擬以上AD病理機制，以觀察重復吸入異氟醚在不同時期對其學習記憶能力的影響，從而為臨床上阿爾茨海默病患者實施麻醉提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠，由中國科學院神經科學研究所段樹民院士饋贈。

1.2 試劑與儀器

引物（上海英駿公司合成），Taq酶（上海申能博彩公司），異氟醚（美國雅培公司），30%氧氣O2與70%氮氣N2的混合氣體。主要儀器：聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，電泳儀，Morris水迷宮視頻分析系統2.0（上海吉量軟件科技有限公司），Y迷宮，Datex-Ohmeda麻醉氣體監測儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 轉基因小鼠的繁殖 C57BL/6J雌鼠與C3H/ HeJ雄鼠交配得到F1代，再將F1代與3個月齡的阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠交配得到F2代。由于APPswe和PS1dE9是連鎖遺傳，按照孟德爾遺傳規律，F2代50%為阿爾茨海默病APP swe/PS1dE9雙轉基因型小鼠。

1.3.2 轉基因小鼠的基因型鑒定 F2代小鼠剪尾，提取鼠尾DNA，紫外分光光度計分析DNA濃度，PCR擴增目的基因APP、PS1，瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR反應中所用的具體序列為：APP正向引物（P1）：5'-G ACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3'，反向引物（P2）：5'-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3'；PS1正向引物（P3）：5'-GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAG ACC-3'，反向引物（P4）：5'-AATAGAGAACGGCAGG AGCA-3'。Prp基因作為內參。PCR的反應體系為20μl，其中：10×PCR buffer 2μl，25 mmol氯化鎂MgCl21.6μl，2 mmol dNTP 2μl，DNA 100 ng，引物10mmol P1、P2各0.5μl（或P3、P4），Taq 3～5 u，另PS1基因加50%甘油4μl，加水補足20μl。APPswe基因反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，69℃退火60s，72℃延伸60 s，共35次循環后72℃再延伸3 min，PCR產物長度約為300 bp。PS1基因反應條件：94℃預變性15 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，共40次循環后72℃再延伸5 min，PCR產物長度約為1 200 bp。

1.3.3 實驗分組及麻醉方法 繁殖的小鼠根據是否含APP和PS1基因分為轉基因組（以下稱為Tg）和野生對照組（以下稱為Wt），再將Tg小鼠分為轉基因異氟醚組（Tg-iso）及轉基因空白對照組（Tg-con），將Wt小鼠分為野生異氟醚組（Wt-iso）及野生空白對照組（Wt-con）。于7個月齡對Tg-iso組及Wt-iso組行異氟醚麻醉，吸入1.1%異氟醚和O2/N2（FiO230%）的混合氣體，連續5 d，2 h/d。同時Tg-con及Wt-con組吸入O2/N2（FiO230%）的混合氣體。氧氣流量2 L/min。Datex-Ohmeda持續監測異氟醚濃度。電熱毯加熱，維持小鼠體溫（37±0.5）℃（肛溫）。

1.3.4 Morris水迷宮 小鼠于7個月齡異氟醚麻醉后48 h行水迷宮實驗。水迷宮由直徑100 cm，高50 cm的水池組成，分為4個象限，水位沒過逃生平臺1 cm，水溫（25±2）℃。水池底及四壁均涂成黑色使平臺不可見。采用Morris水迷宮視頻分析系統2.0監測并記錄小鼠的游泳軌跡。Morris水迷宮實驗程序包括：①定位航行實驗用于測量小鼠獲取空間學習記憶的能力。歷時4d，4次/d，每次訓練間隔15 s。將小鼠從4個入水點隨機地放入水中，通過自動錄像系統記錄小鼠90 s內找到平臺的時間（逃避潛伏期）。找到平臺后休息30s，如果90 s內找不到平臺，逃避潛伏期記錄為90 s。然后人為地將小鼠誘導至平臺休息30s。②空間探索實驗用于測量小鼠學會尋找平臺后，保持對平臺空間位置記憶的能力。即訓練第5天拆除平臺，將小鼠從1、3象限面向池壁放入水中，記錄60 s內小鼠在原目標象限的路程和時間百分比，兩次測量取平均值。認知測試過程中保持實驗室內燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，以排除環境干擾。

1.3.5 Y迷宮 小鼠于12個月齡時行Y迷宮實驗。測試前在迷宮中適應5 min，測試時調節刺激電壓以保證小鼠在5 s內進入安全臂。小鼠在5 s內進入安全臂不會受到電擊，為正確反應，否則為錯誤反應。每7 s進行1次電擊，直到進入安全臂。記錄訓練次數、正確次數和辨別錯誤次數。

1.4 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用重復測量的雙因素方差分析（兩個控制因素分別為實驗日期與實驗分組）比較定位航行實驗所測的游泳速度、游泳路程及潛伏期。采用單因素方差分析比較定位航行實驗每天的游泳速度、游泳路程及潛伏期，以及空間探索實驗所測的時間與路程百分比，以及Y迷宮的訓練次數、正確次數和辨別錯誤次數，其中組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠的繁殖及基因型鑒定結果

F2代小鼠91只，其中轉基因型49只，野生型42只。PCR結果顯示 49只小鼠出現APP，PS1陽性條帶，見圖1，與預計擴增目的基因大小一致（APP 300 bp，PS1 1 200 bp）。分別將轉基因型49只和野生型42只隨機分為異氟醚組（Tg-iso組、Wt-iso組）和對照組（Tg-con組、Wt-con組），12個月齡存活的Tg-iso組20只、Tg-con組23只、Wt-iso組16只、Wt-con組18只。

2.2 Morris水迷宮結果

游泳速度是反映各組小鼠運動能力的指標。定位航行實驗期間各組游泳速度比較，差異無統計學意義（P=0.525）。見圖2。

隨著訓練時間的延長，各組小鼠的潛伏期逐漸縮短。定位航行實驗第3天，各組潛伏期比較，差異有統計學意義（F=3.781，P=0.015）。整個過程Wt-iso組的潛伏期最短，Tg-con組的潛伏期最長（F=4.944，P=0.004）。與Wt-con組比較，Wt-iso組的潛伏期縮短（P=0.013），與Tg-con組比較，Tg-iso組的潛伏期縮短（P=0.043）。見圖3。

隨著訓練時間的延長，除Tg-con組游泳路程無明顯變化，其余各組小鼠的游泳路程逐漸縮短，但各組比較差異無統計學意義（F=2.727，P=0.052）；定位航行實驗第3天，各組游泳路程比較，差異有統計學意義（F=3.128，P=0.032）。與Tg-con組比較，Tg-iso組游泳路程縮短（P=0.027）。見圖4。

目標象限時間百分比和路程百分比各組間差異無統計學意義（P=0.392和0.300）。見圖5。

2.3 Y迷宮結果

圖1 鼠尾PCR檢測電泳圖

圖2 Morris水迷宮實驗中各組小鼠運動能力的比較

圖3 定位航行實驗中各組小鼠潛伏期的比較

圖4 定位航行實驗中各組小鼠游泳路程的比較

圖5 空間探索實驗中各組小鼠目標象限時間、路程百分比的比較

圖6 Y迷宮實驗中各組小鼠學習記憶能力的比較

如圖6所示，各組辨別錯誤次數差異有統計學意義（F=3.247，P=0.046）。與Tg-con組比較，Wt-con組及Tg-iso組辨別錯誤次數明顯減少（P=0.044和0.020）。

3 討論

有實驗采用的APPswe/PS1AE9雙轉基因小鼠可以模擬AD患者腦內β-淀粉樣蛋白沉積所致的老年斑和tau蛋白磷酸化所致的神經纖維纏結等主要病理改變，而且隨著月齡的增加其行為學方面也表現出不同程度的認知功能障礙[1-2]，為研究的實施提供很好的動物模型。

本實驗選擇小鼠7個月齡時行異氟醚麻醉，據報道此月齡的APPswe/PS1AE9雙轉基因小鼠尚未出現認知功能障礙[1]。而實驗結果也證實Wt-con組與Tg-con組的潛伏期及游泳路程比較差異無統計學意義，說明此時APPswe/PS1AE9小鼠尚未產生認知功能障礙。在定位航行實驗中，與Wt-con組比較，Wt-iso組的潛伏期及游泳路程縮短；與Tg-con組比較，Tg-iso組的潛伏期縮短。可見不論是APPswe/ PS1AE9小鼠還是野生對照型小鼠，異氟醚麻醉后在定位航行實驗中的潛伏期均較自身對照組縮短，且野生型小鼠的游泳路程也明顯較對照組縮短，表明重復異氟醚麻醉并未增加轉基因型及野生型小鼠近期學習記憶功能障礙，與對照組比較其學習記憶能力在某種程度上反而有一定的提高。SU等[3]用C57小鼠行異氟醚重復麻醉（每天吸入1.4%異氟醚2 h，共5 d），48 h后行水迷宮實驗，發現異氟醚麻醉后的小鼠學習能力明顯增強，但麻醉后2周再次行水迷宮實驗，兩組比較差異無統計學意義。各組空間探索實驗所測的時間與路程百分比沒有區別，在定位航行實驗中，不論是潛伏期還是游泳路程的比較，統計差異主要出現于前3天，這說明異氟醚可能主要影響學習的過程，一旦形成記憶后異氟醚的影響就變得不明顯。SU等[3]的研究結果也顯示空間探索實驗中時間與路程百分比異氟醚組與對照組比較，差異無統計學意義。已有大量的臨床及動物研究均證實異氟醚可增加老年患者認知功能障礙的風險，但本實驗于小鼠中年時期進行異氟醚重復麻醉，而且近期的研究表明某些干預措施可以減輕異氟醚對這種認知功能的損傷[4-7]。LIU等[8]的研究發現3個月齡的C57小鼠吸入0.7%異氟醚0.5 h或2 h，其學習記憶的能力增強；吸入1.4%的異氟醚2 h，其學習記憶能力與對照組無差異；而吸入1.4%的異氟醚4 h，其學習記憶能力明顯變弱。LEE[9]報道吸入2%異氟醚20～30 min可以改善缺氧引起的細胞損傷，而吸入2%異氟醚60 min或者吸入2.5%異氟醚20～30 min對缺氧引起的細胞損傷沒有改善。PAN[10]的研究證實吸入0.5%異氟醚8 h可以減輕Caspase-3和H4人類神經膠質細胞天冬氨酰蛋白酶β位點裂解酶的含量，而吸入2%異氟醚8 h可以增加以上2種物質的含量。可見長時間高濃度地吸入異氟醚是導致學習記憶能力減退及細胞損傷的重要原因。該研究的結果表明重復吸入異氟醚麻醉不增加術后認知功能障礙的風險，可能與吸入異氟醚的濃度及時間有關。1.1%異氟醚麻醉2 h，濃度低，時間短，對于APP-swe/PS1AE9及野生對照小鼠的近期認知功能均無損傷，反而在一定程度上有促進的作用。

為了觀察異氟醚重復麻醉對APPswe/PS1AE9及野生對照小鼠認知功能的遠期影響，于小鼠12個月齡時進行了Y迷宮實驗。結果表明與Wt-con組比較，Tg-con組辨別錯誤次數明顯增加，說明此時APPswe/PS1AE9小鼠已形成認知功能障礙。MINKE VICIENE[1]的研究表明APPswe/PS1AE9小鼠在10個月時表現出輕度的認知功能損壞，至15個月時其認知功能損壞表現得非常顯著。Wt-con組與Wt-iso組辨別錯誤次數差異無統計學意義，而Tg-con組較Tg-iso組辨別錯誤次數增加，說明異氟醚延緩APP swe/PS1AE9小鼠認知功能障礙的發生，但異氟醚所起的作用及持續時間不得而知，可能是Wt-con組與Wt-iso組差異無統計學意義的原因。關于引起本實驗結果的機制還有待進一步研究。近期XIONG等[11]的研究顯示長期的跑臺實驗可以改善APPswe/PS1dE9小鼠在水迷宮的空間記憶，可能與腦源性神經營養因子含量增加同時激活的小膠質細胞減少有關，但與APPswe/PS1dE9小鼠腦內β-淀粉樣蛋白含量無相關性。TANIUCHI等[12]的研究認為APPswe/ PS1dE9小鼠9個月的時候表現出認知功能障礙，而此時正是β-淀粉樣蛋白大量堆積的時候，ORRE[13]同時證實是β-淀粉樣蛋白激活腦內神經膠質細胞的活性，所以β-淀粉樣蛋白可能是導致APP swe/PS1dE9小鼠認知功能損傷的原因。而且IZCO[14]的研究表明伴隨APPswe/PS1dE9小鼠月齡增加，其腦內不可溶性β-淀粉樣蛋白逐漸增加，血液內不可溶性β-淀粉樣蛋白逐漸減少，同時其學習能力也逐漸下降，兩者有相關性。LAURSEN[15]的研究進一步證明APPswe/PS1dE9小鼠腦室內注射乙酰膽堿免疫毒素后其認知功能減退，且腦組織內斑塊堆積增加，腦內β-淀粉樣蛋白含量也增加，認為膽堿能系統功能減退可促進認知功能損傷。關于本實驗上述結論的機制有待進一步深入研究。

綜上所述，短時間重復吸入低濃度的異氟醚不增加阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因型小鼠及野生對照小鼠近期及遠期學習記憶能力障礙的風險，反而在一定程度上有減輕的作用。其機制還有待進一步研究。本研究結果為臨床上對AD患者及普通患者麻醉的實施提供了參考依據，可在一定程度上避免術后認知功能障礙的發生。

參考文獻：

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（張蕾 編輯）

Influences of Isoflurane on learning and memory of APPswe/ PS1AE9 double transgenic mice of Alzheimer disease*

Yan-xing Zhao1,Dian-san Su2,Jie Chen2,Xiang-rui Wang2
(1.Department of Anesthesiology,Guang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100053,China;2.Department of Anesthesiology,Renji Hospital Affiliated to Medical School of Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200127,China)

Objective To study the influences of Isoflurane on learning and memory of APPswe/PS1AE9 double transgenic mice of Alzheimer disease(AD).Methods Transgenic mice were divided into Tg-iso group and Tg-con group,wild-type mice were divided into Wt-iso group and Wt-con group.At the age of seven months,the Tg-iso group and the Wt-iso group were exposed to 1.1%Isoflurane for 2 hours per day for 5 days.Meanwhile,the mice in the Tg-con group and the Wt-con group inhaled oxygen/nitrogen (FiO2=30%).Learning and memory abilities were tested 48 hours and 5 months after Isoflurane exposure using the Morris Water Maze and Y maze,respectively. Results At the age of seven months,mean latency in the Wt-iso group decreased in a place navigation test compared to the Wt-con group(P=0.013);compared to the Tg-con group,the mean latency decreased in the Tgiso group(P=0.043);there was no significant statistical difference in the target quadrant time or distance percentage in probe trials among the groups(P=0.392).At the age of twelve months,compared to the Tg-con group,the discrimination errors of the Wt-con and Tg-iso groups decreased(P=0.044 and 0.020).Conclusions Repeatedlow-dose Isoflurane anaesthesia does not increase the dysfunction of learning and memory of APPswe/PS1AE9 double transgenic mice and wild type mice,to some extent,can even decrease dysfunction of learning and memory in APPswe/PS1AE9 double transgenic mice and wild type mice.

learning and memory;Isoflurane;APPswe/PS1AE9 double transgenic mice;Y-maze;Morris water maze

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.001

1005-8982（2017）04-0001-06

2016-09-05

國家自然科學基金（No：30801069）；上海市自然科學基金（No：08ZR1413700）；教育部博士點基金（No：200802481094）；上海市科技啟明星項目（No：09QA1403800）

蘇殿三，E-mail：diansansu@yahoo.corn