MicroRNA-10b與早期乳腺浸潤性導管癌的臨床及預后研究*

陳亞勇，郭晨明，迪麗米娜·伊拉木，付明剛，吳 楠，郭麗英

MicroRNA-10b與早期乳腺浸潤性導管癌的臨床及預后研究*

陳亞勇，郭晨明，迪麗米娜·伊拉木，付明剛，吳 楠，郭麗英

（新疆醫科大學第一附屬醫院 乳腺外科，新疆 烏魯木齊830054）

目的 探討早期乳腺浸潤性導管癌中microRNA-10b（miR-10b）表達與臨床指標及預后關系。 方法 采用原位分子雜交技術，檢測305例中早期乳腺浸潤性導管癌組織miR-10b表達，采用Pearsonχ2檢驗分析miR-10b表達在不同臨床指標間的差異性；采用Spearman秩和相關分析早期乳腺浸潤性導管癌中miR-10b、年齡、淋巴結、雌激素受體α（ERα）、孕激素受體（PR）及人類表皮生長因子受體2（HER-2）之間的相關性。采用Kaplan-Meier法計算累計無瘤生存時間，應用Log-rank檢驗比較miR-10b不同表達組間無瘤生存時間的差異。結果 早期乳腺浸潤性導管癌中miR-10b表達與年齡、腫瘤大小和復發轉移，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與月經狀態、臨床分期、化療、放療及內分泌治療比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。miR-10b陽性表達與HER-2陽性表達呈正相關，差異有統計學意義（P＜0.05）。miR-10b表達陰性中位無瘤生存時間較miR-10b表達陽性時間長，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）；淋巴結陰性時miR-10b陰性表達的中位無瘤生存時間較陽性表達長，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）；相反，miR-10b表達在淋巴結陽性中位無瘤生存時間無統計學意義（P＞0.05）。結論 miR-10b表達水平與早期乳腺浸潤性導管癌復發轉移相關，特別在無淋巴結轉移且miR-10b陽性表達組的中位無瘤生存時間短，預后差。miR-10b陽性表達是早期乳腺浸潤性導管癌的預后因素。

早期乳腺浸潤性導管癌；microRNA-10b；臨床；預后

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率占女性惡性腫瘤第1位，每年全球約有50萬女性死于乳腺癌[1-2]。浸潤性導管癌為乳腺癌常見的病理類型，約占乳腺癌的75%，而乳腺癌死亡原因是復發轉移，早期乳腺浸潤性導管癌為其類型之一，有一部分患者在早期即可出現復發轉移而導致死亡。近年來，研究早期乳腺浸潤性導管癌倍受關注。MicroRNA（miRNA）是近年來新發現的一類小分子RNA，microRNA-10b（miR-10b）作為其家族中的一員，定位于人2號染色體短臂3區1帶1亞帶的HOXD4與HOXD8基因之間，具有3'帽子和5'多聚尾的初始轉錄結構。研究表明miR-10b在乳腺癌和其他癌癥組織中均存在異常表達，它調控乳腺癌細胞生長增殖與凋亡[3]。miR-10b也參與乳腺癌轉移的平衡機制，能夠使非轉移性乳腺癌腫瘤細胞獲得浸潤和轉移能力[4-6]。以上研究表明miR-10b高表達與乳腺癌及非轉移性乳腺癌的復發轉移存在一定的相關性。目前，尚無miR-10b與早期乳腺浸潤性導管癌復發轉移及預后相關研究。本研究采用原位雜交法，檢測305例早期乳腺浸潤性導管癌組織中miR-10b表達情況，分析miR-10b表達與早期乳腺浸潤性導管癌臨床指標及預后關系，探討miR-10b是否與其復發轉移相關，其能否作為臨床預后的指標。

1 資料與方法

1.1 標本來源

本研究資料來源為自2000年1月-2013年12月在新疆醫科大學第一附屬醫院乳腺外科收治且臨床資料及隨訪信息完整，并經病理證實的乳腺癌患者約2 600例。對數據庫內患者進行長期隨訪，隨訪間隔為1年，術后隨訪2～15年，隨訪截止時間為2015年12月31日，隨訪方式為門診、住院復診以及電話回訪。隨訪期間未發現復發轉移者認為無瘤生存，通過超聲和影像學檢查等發現轉移病灶和/或病理證實轉移者明確為復發轉移。本研究從上述數據庫中排除新輔助化療、放療的患者，既往或現在患有其他腫瘤患者，由其他腫瘤引起的乳腺癌患者，納入病理類型為乳腺浸潤性導管癌且臨床分期為0～Ⅱ期，手術方式為改良根治術，腫瘤大小≤3 cm，年齡為30～92歲，平均年齡43.8歲，臨床早期患者共305例進行分析。

1.2 原位雜交染色

敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒I（POD）購自武漢博士德生物工程有限公司，探針（hsa-miR-10b）miRCURY LNA Detection ProbeDAB購自丹麥Exiqon公司。實驗方法如下：①包埋組織切片，貼于APES載玻片上，70℃烤箱過夜，脫蠟脫水。②3%過氧化氫H2O2室溫處理10 min，蒸餾水洗滌2次。胃蛋白酶（1 ml 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻）37℃消化15 min。0.5 mol PBS洗3次，每次5 min，蒸餾水洗1次。③濕盒37℃預雜交3 h后添加地高辛標記的寡核苷酸探針，濃度2μg/ml。按每張切片加20μl雜交液。蓋上原位雜交專用蓋玻片，恒溫箱37～40℃雜交過夜。④雜交后洗滌：去掉蓋玻片，37～40℃2×SSC洗滌5 min×2；0.5×SSC洗滌15 min；0.2×SSC洗滌15 min。⑤滴加封閉液，37℃ 30 min后滴加生物素化鼠抗地高辛，室溫120 min。0.5 mol PBS洗5 min，4次。⑥滴加SABC，室溫30 min。0.5 mol PBS洗5 min，3次。⑦滴加生物素化過氧化物酶，室溫30 min，0.5 mol PBS洗5min，4次。⑧DAB顯色：1 ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標本上。鏡下顯色，10～30 min，水洗終止顯色。⑨蘇木素復染，酒精逐級脫水，二甲苯透明，封片。

1.3 判斷標準

以文獻[1]為標準，陽性細胞的胞漿著色呈棕黃色。染色評分根據染色強度和陽性細胞數來評價：依照細胞陽性著色程度，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依照陽性細胞數量（5個高倍視野），陽性細胞總數1%～25%，1分；陽性細胞總數26%～50%，2分；陽性細胞總數51%～75%，3分；陽性細胞總數＞75%，4分。每例標本最后得分為陽性細胞數計分×染色強度計分之積，0分為（-），1～2分（+），3～4分（++），＞4分（+++）（見圖1）。

圖1 miR-10b表達情況

1.4 統計學方法

應用SPSS17.0統計軟件包進行統計學處理。采用Pearson χ2檢驗分析miR-10b表達在不同臨床指標間的差異性；采用Spearman秩和相關分析早期乳腺浸潤性導管癌中miR-10b、年齡、淋巴結、雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人類表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）之間的相關性。采用Kaplan-Meier法計算累計無瘤生存時間，應用 Log-rank檢驗比較miR-10b不同表達組間無瘤生存時間的差異。P＜0. 05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 早期乳腺浸潤性導管癌miR-10b表達與臨床指標的關系

分析305例早期乳腺浸潤性導管癌miR-10b在不同臨床指標中表達情況，結果顯示：在年齡≥50歲、腫瘤直徑2 cm＜T≤3 cm和復發轉移中miR-10b陽性率高于年齡＜50歲、腫瘤T≤2 cm和無瘤生存組，差異具有統計學意義（χ2=7.832，P=0.05；χ2= 8.400，P=0.038；χ2=9.431，P=0.024）；miR-10b陽性表達率在月經狀態、臨床分期、化療、放療、內分泌治療無統計學差異（P＞0.05），結果表明miR-10b陽性表達與早期乳腺浸潤性導管癌在年齡、腫瘤大小和復發轉移中存在相關性。見表1。

2.2 早期乳腺浸潤性導管癌中miR-10b、年齡、淋巴結、ER-α、PR及HER-2之間的秩相關性分析

利用Spearman秩和相關分析305例早期乳腺浸潤性導管癌患者組織中miR-10b、年齡、淋巴結、ER-α、PR及HER-2之間的相關性，結果表明：miR-10b與淋巴結、PR（+）、HER-2（-）呈正相關，其中miR-10b表達與HER-2（-）差異有統計學意義（P＜0.05），miR-10b表達與淋巴結、PR（+）不具有統計差異（P＞0.05）；年齡與miR-10b、淋巴結、PR（+）呈負相關，年齡與ER-α（+）、HER-2（-）呈正相關；淋巴結與ER-α（+）呈負相關，淋巴結與PR（+）、H ER-2（-）呈正相關；ER-α（+）與PR（+）、HER-2（-）呈正相關；PR（+）與HER-2（-）呈正相關，差異具有統計學意義（P＜0.05）；HER-2（-）與淋巴結、PR（+）差異具有統計學意義（P＜0.05）；結果表明：miR-10b陽性表達與HER-2陰性表達呈正相關。見表2。

2.3 早期乳腺浸潤性導管癌miR-10b表達相關預后分析

2.3.1 早期乳腺浸潤性導管癌miR-10b表達生存曲線比較 早期乳腺浸潤性導管癌中miR-10b陽性表達和陰性表達進行無瘤生存時間Kaplan-Meier生存分析，結果顯示：miR-10b（-）中位無瘤生存時間為11.863年，miR-10b陰性表達的中位無瘤生存時間高于其陽性表達的中位無瘤生存時間，9.940年miR-10b（+）、10.054年miR-10b（++）和9.084年miR-10b（+++），經Log-rank檢驗（χ2=8.805，P=0.032），差異有統計學意義。見圖2。

表1 miR-10b表達與臨床指標的關系 例（%）

2.3.2 早期乳腺浸潤性導管癌淋巴結陰性與miR-10b表達生存曲線比較 早期乳腺浸潤性導管癌當淋巴結陰性時進行Kaplan-Meier生存分析，結果提示：miR-10b（-）中位無瘤生存時間為12.282年，miR-10b陽性表達中位無瘤生存時間分別為：10.508年miR-10b（+）、8.624年miR-10b（++）和9.228年miR-10b（+++）低于miR-10b（-）表達的中位無瘤生存時間，經Log-rank檢驗（χ2=8.016，P= 0.046），差異有統計學意義。見圖3。

表2 miR-10b與臨床指標相關性

2.3.3 早期乳腺浸潤性導管癌淋巴結陽性與miR-10b表達生存曲線比較 早期乳腺浸潤性導管癌淋巴結陽性時進行Kaplan-Meier生存分析，結果提示：miR-10b（-）中位無瘤生存時間為11.426年，miR-10b陽性表達的中位無瘤生存時間分別為：7.118年miR-10b（+）、9.197年miR-10b（++）和8.421年miR-10b（+++），經Log-rank檢驗（χ2=3.605，P= 0.307），差異無統計學意義。見圖4。

圖2 miR-10b表達生存曲線比較

圖3 miR-10b不同表達在淋巴結陰性生存曲線比較

圖4 miR-10b不同表達在淋巴結陽性生存曲線比較

3 討論

miRNA是通過調控大量的腫瘤基因在腫瘤侵襲與轉移過程中的作用機制，最終導致腫瘤復發轉移[8-11]；在乳腺癌中，不同miRNA表達與雌激素受體、孕激素受體或HER-2受體表達、淋巴結轉移等生物學行為相關，成為乳腺癌分子學領域研究的熱

點[12-14]。

據相關研究證明：miR-10b在轉移的腫瘤細胞中有很高的表達，這是首個被發現的影響人類腫瘤細胞轉移潛能的miRNA[15-17]。又有相關研究證明：miR-10b在無淋巴結轉移組乳腺癌患者血清中表達下調，其在轉移性乳腺癌細胞中表達明顯升高且miR-10b的表達量與乳腺癌的惡性程度密切相關[18-21]。本研究結果提示miR-10b陽性表達與年齡、腫瘤大小和復發轉移中差異具有統計學意義；miR-10b陽性表達率在不同月經狀態、臨床分期、有無化療、有無放療、有無內分泌治療表達無統計學差異。表明miR-10b陽性表達與早期乳腺浸潤性導管癌的侵襲性與其惡性程度密切相關，這與上述文獻報道一致。

影響乳腺癌患者預后的因素很多，包括淋巴結狀態、臨床分期、腫瘤大小、激素受體狀況、HER-2受體的擴增情況和年齡等[22-23]。在諸多影響乳腺癌患者預后的因素中，淋巴結轉移是決定性因素之一。淋巴結在無轉移者預后好，一旦出現轉移，預后變差，而且隨著轉移數目的增加預后更差。本研究結果提示，在分析miR-10b表達與臨床指標相關性時發現miR-10b與早起浸潤性導管癌患者的HER-2狀態差異具有統計學意義。表明miR-10b高表達與HER-2陽性表達呈正相關，即miR-10b陽性表達時HER-2表達含量明顯增強，當HER-2過表達導致乳腺侵襲性及轉移力增加，導致早期乳腺浸潤性導管癌復發轉移，預后差，認為miR-10b表達可能參與了早期復發轉移階段，以上說明miR-10b陽性表達是早期乳腺浸潤性導管癌的復發轉移因素，盡管它們之間的內在分子關系尚不清楚。

本文為進一步研究其是否與其復發轉移相關，將305早期乳腺浸潤性導管癌進行中位無瘤生存分析。結果表明：miR-10b陽性表達者中位無瘤生存時間下降，且miR-10b陰性表達的中位無瘤生存時間高于miR-10b陽性表達。當淋巴結陰性時，miR-10b陰性表達的中位無瘤生存時間高于陽性；相反，當淋巴結陽性時，miR-10b生存分析顯示差異無統計學意義。提示miR-10b陽性表達可能導致或者參與了早期乳腺浸潤性導管癌發生復發轉移，特別在無淋巴結轉移且miR-10b陽性表達組的中位無瘤生存時間短，預后差。這與相關文獻報道一致[4，13]。

綜上所述，miR-10b與早期乳腺浸潤性導管癌預后具有相關性，在早期乳腺浸潤性導管癌侵襲轉移過程中發揮重要作用，miR-10b陽性表達參與早期乳腺浸潤性導管癌的復發轉移，在有無淋巴結轉移中具有差異性，特別在淋巴結陰性患者容易呈現復發轉移。因此，miR-10b陽性表達為早期乳腺浸潤性導管癌預后指標之一，miR-10b即可能作為早期乳腺浸潤性導管癌發生預測的預測指標，也可能是一項臨床預后指標。

[1]DOWNS-HOLMES C,SILVERMAN P.Breast cancer:overview& updates[J].Nurse Pract,2011,36(12):20-26.

[2]SINGER A,TRESLEY J,VELAZQUEZ-VEGA J,et al.Unusual aggressive breast cancer:metastatic malignant phyllodes tumor[J]. J Radial Case Rep,2013,7(3):24-37.

[3]顧憶,李小曼,鄭祿楓,等.MicroRNA-10b調控乳腺癌細胞生長增殖與凋亡的研究[J].中國藥科大學學報,2015,46(2):242-249.

[4]劉勇.MicroRNA-10b靶向CDH1促進乳腺癌轉移的初步研究[D].武漢:華中科技大學,2011.

[5]LIU Z,ZHU J,CAO H,et al.miR-10b promotes cell invasion through RhoC-AKT signaling pathway by,targeting HOXD10 in gastric cancer[J].International Journal of Oncology,2012,40(5): 1553-1560.

[6]LI Q J,ZHOU L,YANG F,et al.MicroRNA-10b promotes migration and invasion through CADM1 in human hepatocellular carcinoma cells[J].Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology&Medicine,2012,33 (5):1455-1465.

[7]WOLFF A C,HAMMOND M E,SCHWARTZ J N,et al.American Society of clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing In Breast Cancer[J].Arch Pathol Lab Med,2007, 13(1):18-43.

[8]GAURAV S,IVAN M,MINKOV G,et al.isomiRex:Web-based identification ofmicroRNAs,isomiR variationsand differential expression using next-generation sequencing datasets[J].Febs Letters,2013,587(16):2629-2634.

[9]霍晶,吳夏陽,李文睿,等.MicroRNA與乳腺癌近期研究進展[J].中國臨床藥理學雜志,2015,(16):1677-1680.

[10]VICKERS K C,PALMISANO B T,SHOUCRI B M,et al.MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins[J].Nature Cell Biology,2011, 13(4):423-433.

[11]CHEN X,LIANG H,ZHANG J,et al.Secreted microRNAs:a new form of intercellular communication[J].Trends in Cell Biology,2012,22(3):125-132.

[12]WANG Y Y,LI L,YE Z Y,et al.MicroRNA-10b promotes migration and invasion through Hoxd10 in human gastric cancer[J].World Journal of Surgical Oncology,2015,13(1):1-8.

[13]ZHANG J,XU L,YANG Z,et al.MicroRNA-10b indicates a poorprognosisofnon-smallcelllung cancerand targets E-cadherin[J].Clinical&Translational Oncology,2014,17(3): 209-214.

[14]YU X,LI Z,SHEN JX,et al.MicroRNA-10b promotes nucleus pulposus cell proliferation through RhoC-Akt pathway by targeting HOXD10 in intervetebral disc degeneration[J].Plos One, 2013,8(12):1524-1528.

[15]LIU X H,LIU Z L,SUN M,et al.The long non-coding RNA HOTAIR indicates a poor prognosis and promotes metastasis in non-small cell lung cancer[J].Bmc Cancer,2013,13(41):1-10.

[16]GOLDHIRSCH A,WOOD W C,COATES A S,et al.Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer:highlights of the St.Gallen International Expert Consensus on the primary therapy of early breast cancer 2011[J].Annals of Oncology,2011,22(8):1736-1747.

[17]VICKERS K C,PALMISANO B T,SHOUCRI B M,et al. Corrigendum:microRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins[J].Nature Cell Biology,2014,17(1):104.

[18]NISHIDA N,YAMASHITA S,MIMORI K,et al.MicroRNA-10b is a prognostic indicator in colorectal cancer and confers resistance to the chemotherapeutic agent 5-Fluorouracil in colorectal cancer cells[J].Annals of Surgical Oncology,2012, 19(9):3065-3071.

[19]GUESSOUS F,ALVARADO-VELEZ M,MARCINKIEWICZ L, etal.Oncogenic effectsofmiR-10b in glioblastoma stem cells[J].Journal of neuro-oncology,2013,112(2):153-163.

[20]APPAIAH H N,GOSWAMI C P,MINA L A,et al.Persistent upregulation of U6:SNORD44 small RNA ratio in the serum of breast cancer patients[J].Breast Cancer Research Bcr,2011,13 (5):1147-1152.

[21]LEI D,MIN L,FANG W,et al.TUMIR:an experimentally supported database of microRNA deregulation in various cancers[J].Journal of Clinical Bioinformatics,2013,3(1):1-4.

[22]宋傳貴,傅芳萌,吳雪英,等.miR-10b與乳腺癌侵襲及預后的相關性研究[J].中國癌癥雜志,2012,22(1):31-34.

[23]曹志剛,邵志敏.microRNA在乳腺癌診斷及預后判斷中的作用[J].中國癌癥雜志,2012,22(7):542-546.

（張蕾 編輯）

Relationships of miR-10b expression with clinical parameters and prognosis in patients with early breast invasive ductal carcinoma*

Ya-yong Chen,Chen-ming Guo,Dilimina·Yilamu,Ming-gang Fu,Nan Wu,Li-ying Guo
(Department of Breast Cancer,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi,Xinjiang 830054,China)

Objective To discuss the reationships of clinical parameters and prognosis of early breast invasive ductal carcinoma with miRNA-10b(miR-10b)expression.MethodsIn situmolecular hybridization technique was used to detect miR-10b expression in early breast invasive ductal cancer tissues of 305 cases.Pearson Chi-square test was adopted to analyze the differences in miR-10b expression between the patients with different clinical indicators.Spearman rank test was used to analyze the correlations of miR-10b expression with age,lymph node metastasis,estrogen receptor α(ERα),progesterone receptor(PR)and human epidermal growth factor receptor 2(HER-2) in early breast invasive ductal cancer.Kaplan-Meier method was adopted to calculate the accumulative tumor-free survival time.Log-rank test was applied to compare the tumor-free survival time between the groups with different miR-10b expressions.Results There were significant differences in age,tumor recurrence and metastasis betweenthe early breast invasive ductal cancer patients with different miR-10b expressions(P＜0.05);however,there was no significant difference in menstrual status,clinical stage,chemotherapy,radiotherapy or endocrine therapy(P＞0.05). Positive miR-10b expression was positively correlated with positive HER-2 expression(P＜0.05).The median survival time of the patients with negative miR-10b expression was significantly longer than that of the patients with positive miR-10b expression(P＜0.05).When there was no lymph node metastasis,the median tumor-free survival time of the patients with negative miR-10b expression was significantly longer than that of the patients with positive miR-10b expression(P＜0.05);while there was no statistical difference in the median tumor-free survival time when there was lymph node metastasis(P＞0.05).Conclusions miR-10b expression level is associated with recurrence and metastasis of early breast invasive ductal carcinoma,especially in the absence of lymph node metastasis;and in the miR-10b positive expression group the median tumor-free survival time is short,the prognosis is poor.miR-10b positive expression is a prognostic factor of early breast invasive ductal cancer.

early breast invasive ductal carcinoma;miR-10b;clinic;prognosis

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.008

1005-8982（2017）04-0040-06

2016-08-02

新疆重大疾病醫學重點實驗室專項（No：SKLI-XJMDR-ZX-2014-1）

郭麗英，E-mail：ggs318@126.com