慢病毒介導microRNA-214在成牙骨質細胞分化過程中的作用

孫福財，劉雪婷，蔡志斌，張金華

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 口腔科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬口腔醫院 口腔綜合科，浙江 溫州 325027）

慢病毒介導microRNA-214在成牙骨質細胞分化過程中的作用

孫福財1，劉雪婷1，蔡志斌2，張金華1

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 口腔科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬口腔醫院 口腔綜合科，浙江 溫州 325027）

目的:構建microRNA-214沉默慢病毒載體并研究其在成牙骨質細胞分化過程中的作用。方法:常規條件下培養成牙骨質細胞系，并對其進行礦化誘導，檢測牙骨質分化及礦化相關標記物的變化。隨后，構建microRNA-214沉默慢病毒載體并感染成牙骨質細胞，熒光顯微鏡觀察其感染效率，并用茜素紅和Von kossa染色檢測不同組成牙骨質細胞的礦化能力，最后檢測不同組之間牙骨質分化標志物的變化。結果: Real-time PCR結果顯示，隨著誘導時間的延長，成牙骨質細胞分化的標志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP mRNA的相對表達量逐漸增加?？瞻捉M、陰性對照組和microRNA-214沉默載體組感染成牙骨質細胞系比率達到90%以上。相對于空白組和陰性對照組，microRNA-214沉默組microRNA-214的表達量顯著下降，這表明microRNA-214沉默載體很好地發揮了沉默功能。相對于空白組和陰性對照組，microRNA-214沉默組能顯著提高成牙骨質細胞的增殖速率。成牙骨質細胞礦化程度的檢測發現，相對于空白組和陰性對照組，microRNA-214沉默組礦化結節數量增多，形態變大。同時，成牙骨質細胞分化的標志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表達量在microRNA-214沉默組中均顯著增加。結論:microRNA-214沉默能夠促進成牙骨質細胞分化。

microRNA-214；慢病毒屬；牙骨質；細胞分化；牙再礦化

牙周病是人群中最廣泛流行的慢性感染性疾病。根據世界衛生組織口腔健康流行病學調查，成年人中約80%患有不同程度的牙周疾病，并已威脅到各個年齡人群，是成年人失牙的首要原因[1]。牙周病對人類的健康危害如此之大，是因為它會引起牙齦和牙周膜膠原纖維進行性溶解破壞以及牙骨質和牙槽骨的吸收缺陷。牙周再生治療的目的就是重建牙周組織。但牙周再生非常困難，是行內公認的難題，目前世界各國的口腔科研工作者都致力于開發有效促進牙周再生的治療手段[2]。實際上，牙周組織再生的關鍵步驟就是牙周連接纖維重新附著于病變的根面上，研究表明，成功的牙骨質再生是牙周組織再生中至關重要的一環[3]。

利用組織工程的方法達到成功的牙周組織再生是目前最為可行并具有可預見性的辦法，在牙周組織的再生中起重要作用。成功的牙周組織工程要求具備如下條件:合適的干細胞或前體細胞形成牙周組織，細胞接種到理想的支架材料，合適的因子來介導細胞的多功能分化[4-5]。microRNA-214是一種具有骨改建作用的重要調節因子，研究表明其可以通過Atf4來抑制成骨細胞活性并減少其礦化的能力，這提示microRNA-214可能可以作為一種較為合適的調節因子參與到牙周組織工程中來促進牙骨質的再生[6]，然而microRNA-214在牙骨質分化及礦化中的作用目前缺少相關研究。相對于脂質體、聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）和腺病毒轉染，慢病毒載體轉染具有包裝周期短和長期穩定轉染的特點，因此我們將慢病毒作為microRNA-214轉染的載體，研究其對成牙骨質細胞分化的影響[7]。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要材料 成牙骨質細胞系購于美國ATCC細胞庫；10%胎牛血清購于美國Gibco公司；β-甘油磷酸鈉購于美國Sigma公司；microRNA-214沉默慢病毒載體購于上海吉瑪基因化學技術有限公司；細胞增殖速率測定試劑盒CCK8購于日本同仁公司；茜素紅試劑盒和Von kossa試劑盒購于美國Sigma公司；胰酶、DMEM高糖培養基購于美國Hyclone公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Runt相關基因2（Runtrelated transcription factor 2，Runx2）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、一型膠原（Collagen I，Colla）、核衣殼蛋白（capsule associated protein，CAP）和內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的Real-time反應序列均由北京天一輝遠公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組:采用含有10%胎牛血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM高糖培養基培養成牙本質細胞系。實驗分為3組:空白組為在感染空載體的同時置于正常的細胞培養基中培養；陰性對照組為在感染含有無義序列的病毒上清的同時，置于正常的細胞培養基中培養；microRNA-214沉默組為在感染microRNA-214沉默慢病毒載體的同時，置于正常的細胞培養基中培養。為平衡各組的病毒梯度，分組前采用慢病毒滴度測定試劑盒測量了病毒滴度。成牙骨質向誘導的方法為:在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中加入5 mmol/L β-甘油磷酸鈉作為其成牙骨質向分化的誘導劑[8]。

1.2.2 慢病毒感染及鑒定:取對數生長期的成牙骨質細胞，加入含有microRNA-214和陰性對照組的慢病毒載體上清，感染24 h后，分別用倒置熒光顯微鏡檢測平均熒光強度。

1.2.3 細胞增殖速率測定:取病毒感染后對數生長期的成牙骨質細胞，分別用細胞速率測定試劑盒CCK8測定不同組細胞的增殖速率。

1.2.4 茜素紅和Von kossa染色:分別將空白組、陰性對照組和microRNA-214沉默組病毒上清感染成牙骨質細胞后，利用成牙骨質細胞分化誘導劑誘導成牙骨質之后，分別采用0.2%的茜素紅試劑盒和5% Von kossa染色試劑盒檢測成牙骨質細胞形成礦化結節的能力。

1.2.5 Real-time PCR檢測:分別提取空白組、陰性對照組和microRNA-214沉默組3組成牙骨質細胞誘導14 d后的總RNA，反轉成cDNA后，分別檢測Runx2、BSP、ALP、OCN、Col1a和CAP基因的表達水平，并測定誘導14 d后microRNA-214表達情況。1.3 統計學處理方法 采用SPSS14.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，多個時間點之間的比較采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成牙骨質細胞礦化誘導 Real-time PCR的結果顯示，隨著誘導時間的延長，成牙骨質細胞分化的標志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP的表達水平逐漸上升（P＜0.05），表明成牙骨質細胞礦化誘導成功。同期檢測了microRNA-214的表達量，發現microRNA-214的表達量隨著時間的推移逐漸下降（P＜0.05），見表2。

2.2 microRNA-214沉默慢病毒轉染 倒置熒光顯微鏡下觀察發現，空白組、陰性對照組和microRNA-214沉默組均很好地感染上了成牙骨質細胞系，通過計數熒光視野和白場視野的細胞數目，發現感染比率達到了90%以上，表明3組質粒均能順利地轉染進入細胞（見圖1）。同時，我們檢測了microRNA-214的表達量，發現在空白組和陰性對照組均有較多的microRNA-214的表達量，而在microRNA-214沉默組，其表達量顯著下降（P＜0.05），這表明microRNA-214沉默載體很好地發揮了沉默功能（見圖2）。進一步檢測了3組不同的病毒感染成牙骨質細胞后成牙骨質細胞的增殖速率，發現相對于空白組和陰性對照組，microRNA-214沉默組能夠顯著提高成牙骨質細胞的增殖速率（見圖2）。

表1 成牙骨質細胞礦化誘導過程中Runx2、Bsp、Alp、Ocn、Colla、CAP和microRNA-214的表達量變化（n=6，±s）

表1 成牙骨質細胞礦化誘導過程中Runx2、Bsp、Alp、Ocn、Colla、CAP和microRNA-214的表達量變化（n=6，±s）

圖1 慢病毒感染成牙骨質細胞的熒光圖（×20）

圖2 3組microRNA-214的相對表達量和成牙骨質細胞的增殖量

2.3 microRNA-214沉默載體能夠促進成牙骨質細胞的分化及礦化 采用茜素紅染色和Von kossa染色來檢測成牙骨質細胞礦化的程度，并采用檢測成牙骨質細胞分化標志物的方式來檢測其分化程度。結果發現，在空白組和陰性對照組中，形成了數量相當的礦化結節，2組間差異無統計學意義。而在microRNA-214沉默組中，發現了礦化結節數量增多，形態變大，見圖3。同時，成牙骨質細胞分化的標志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表達量在microRNA-214沉默組中均顯著增加（P＜0.05），見圖4。這些都表明了microRNA-214沉默能夠顯著地促進成牙骨質細胞的分化和礦化。

圖3 茜素紅和Von kossa染色檢測成牙骨質細胞礦化的程度（×20）

圖4 成牙骨質細胞分化的標志物ALP、BSP、Runx2、Col1a、OCN和CAP的mRNA相對表達量

3 討論

牙周炎是一種非常常見的感染性疾病，極易導致牙齒的缺失。目前大家一直嘗試用各種再生性手術、組織工程方法、局部使用重組生長因子等方法促進牙周組織再生，特別是牙周膜和牙槽骨的再生，往往忽略了根面的牙骨質的再生。到目前為止還沒有一種方法能夠達到重建新的牙骨質、牙周膜和牙槽骨[9]。研究表明成功的牙骨質再生是牙周組織再生的金標準[10]。因此，如何利用組織工程的方法重建功能性的牙骨質具有十分重要的臨床意義。

microRNA-214是一種重要的血管生成信號調節因子，在缺氧環境下，上調microRNA-214可以促進血管重構[11]。此外，microRNA-214還是十分關鍵的骨改建調節因子，其可以通過直接靶點轉錄因子Atf4來抑制成骨細胞的分化和基質礦化。

本研究發現microRNA-214可以有效地提高成牙骨質細胞增殖速率，Real-time PCR的結果顯示，隨著誘導時間的延長，成牙骨質細胞分化的標志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP的mRNA相對表達量逐漸增加。李瑤等[12]和童曉潔等[13]研究表明，ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP是在成骨細胞分化及牙齒的發育過程中起著重要作用的轉錄因子，牙齒及骨組織中的特異性基質蛋白在轉錄水平均受其調控?？瞻捉M、陰性對照組和microRNA-214沉默組感染成牙骨質細胞系比率達到90%以上。相對于空白組和陰性對照組，microRNA-214沉默組microRNA-214的表達量顯著下降，這表明microRNA-214沉默載體很好地發揮了沉默功能。成牙骨質細胞礦化的程度檢測發現，相對于空白組和陰性對照組，microRNA-214沉默組礦化結節數量增多，形態變大。楊楠等[14]研究發現，microRNA-21的靶基因負向調控人骨髓間充質干細胞的成骨分化，在骨形成過程發揮著重要作用，與本文研究結果相似，microRNA能夠促進骨質細胞礦化。同時，成牙骨質細胞分化的標志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表達量在microRNA-214沉默組中均顯著增加。這表明，microRNA-214影響成牙骨質細胞分化及礦化的機制可能與其在骨改建中的機制相同，即通過結合Atf4的mRNA，抑制Atf4的表達，從而抑制了成牙骨質細胞的分化及礦化。李春雷等[15]研究發現，在人牙周膜細胞骨向分化中microRNA101可能通過抑制PLAP-1而促進其成骨分化能力，與本研究結論一致。

綜上所述，microRNA-214沉默可以顯著促進成牙骨質細胞的增殖、分化、礦化，可能作為一個潛在的靶點應用于牙周組織工程。

[1] SCHMALZ G, LI S, BURKHARDT R, et al. MicroRNAs as salivary markers for periodontal diseases: A new diagnostic approach?[J]. Biomed Res Int, 2016, 2016: 1027525.

[2] CHANDRA A, YADAV O P, NARULA S, et al. Epidemiology of periodontal diseases in Indian population since last decade[J]. J Int Soc Prev Community Dent, 2016, 6(2): 91-96.

[3] GRZESIK W J, NARAYANAN A S. Cementum and periodontal wound healing and regeneration[J]. Crit Rev Oral Biol Med, 2002, 13(6): 474-484.

[4] ZEICHNER-DAVID M. Regeneration of periodontal tissues: cementogenesis revisited[J]. Periodontol 2000, 2006, 41: 196-217.

[5] 董學君, 孫荷, 張帆, 等. 小鼠Brg1 shRNA慢病毒載體構建及其在骨髓間充質干細胞中的沉默效應[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2013, 27(4): 324.

[6] WANG X, GUO B, LI Q, et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation[J]. Nat Med, 2013, 19(1): 93-100.

[7] 徐柯, 馮霞, 余雙慶, 等. 慢病毒介導白介素IL15在人樹突狀細胞中表達研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2014, 28(2): 132-134.

[8] CAO Z, ZHANG H, ZHOU X, et al. Genetic evidence for the vital function of Osterix in cementogenesis[J]. J Bone Miner Res, 2012, 27(5): 1080-1092.

[9] BARTOLD P M, MCCULLOCH C A, NARAYANAN A S, et al. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology [J]. Periodontol 2000, 2000, 24: 253-269.

[10] 潘文波, 林鵬, 鄭文娥, 等. 牙骨質附著蛋白在牙周組織再生中的作用[J]. 中國老年學雜志, 2014(13): 3785-3787.

[11] LIU H, TAO Y, CHEN M, et al. Upregulation of microRNA-214 contributes to the development of vascular remodeling in hypoxia-induced pulmonary hypertension via targeting CCNL2[J]. Sci Rep, 2016, 6: 24661.

[12] 李瑤, 周益翔, 于金華. Runx2在牙齒發育過程中的表達研究進展[J]. 口腔生物醫學, 2014(2): 96-99.

[13] 童曉潔, 蘭澤棟, 鄭雅心, 等. 骨形成蛋白-2和牙胚細胞聯合作用誘導人牙周膜干細胞表達成牙骨質細胞的表型研究[J]. 中國美容醫學, 2014, 23(16): 1343-1348.

[14] 楊楠, 周威, 王光, 等. Spry1在miR-21調控人骨髓間充質干細胞成骨分化中的作用[J]. 中國組織工程研究, 2014 (32): 5085-5090.

[15] 李春雷, 盧昌懿, 李長霞, 等. miR101通過PLAP-1調節牙周膜細胞成骨分化的研究[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志, 2014, 24(3): 125-129, 141.

（本文編輯：賈建敏）

The functional role of microRNA-214 in the differentiation and mineralization of cementoblasts

SUN Fucai1, LIU Xueting1, CAI Zhibin2, ZHANG Jinhua1.
1.Department of Stomatology, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of General Dentistry, the Aff liated Stomatological Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To construct a silencing plasmid of microRNA-214 and study the functional role of microRNA-214 in the differentiation and mineralization of cementoblasts.Methods:The cementoblasts was cultured in normal condition and expression level of the cementoblastic markers was test during the differentiation and mineralization induction period. Silencing lentiviral vector of microRNA-214 was constructed and then transfected into mouse cementoblasts (OCCM-30 cell lines). Fluorescence microscope was used to detect transfection ability and silencing effects of the construct. Alizarin Red and Von kossa staining was used to test the mineralization ability of cementoblasts. Real-time PCR was used to demonstrate the differentiation ability of cementoblasts.Results:Real-time PCR results showed that the relative expression of cementoblast differentiation marker ALP, Runx2, BSP, OCN, Col1a and CAP mRNA increased gradually as time goes on. The blank group, negative control group and microRNA-214 group infection ratio of silent carrier reached more than 90% cementum cells. Compared with blank group and negative control group, the expression of microRNA-214 in the microRNA-214 silencing group decreased 5 times. The results showed that the microRNA-214 silencing vector played a good role in silence. Compared with blank group and negative control group, microRNA-214 silencing group could signif -cantly increase the proliferation rate of cementoblasts. Compared with blank group and negative control group, microRNA-214 silencing group, the number of mineralized nodules increased and the morphology becamed larger. Cementoblast differentiation markers ALP, Runx2, OCN, Col1a, BSP and CAP expression were significantly increased in microRNA-214 silencing group in silence.Conclusion:The research demonstrats that silencing lentiviral vector of MicroRNA-214 can promote the differentiation and mineralization ability of cementoblasts.

microRNA-214; lentivirus; dental cementum; cell differentiation; tooth remineralization

R780.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.007

2016-07-24

孫福財（1976-），男，浙江溫州人，主治醫師，碩士。