基于CNKI的分子生物學技術在湖北省林業研究中的應用與進展分析

彭嬋++楊杉++陳慧玲++張新葉??

摘要：以CNKI中國知網數據庫為文獻數據源，采用文獻調研的方法分析近 10年來分子生物學技術在湖北省林業研究方面的報道，結果表明：分子標記技術和基因工程技術是湖北省林木分子生物學研究的主要技術，分子標記的開發與體系構建、遺傳基礎及多樣性評價、功能基因克隆與轉化是研究的熱點領域。最后，結合湖北省林業現狀和分子生物技術的發展趨勢對以后的研究提出了意見和建議。

關鍵詞：分子生物學；林業研究；湖北

中圖分類號：S718文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2016）06-0001-09

Application Progress on Molecular Biotechnologyof Forestry Research in Hubei Province：Based on CNKI

Peng ChanYang ShanChen HuilingZhang Xinye

（Hubei Academy of ForestryWuhan430075）

Abstract： The data was collected from CNKI，the literature research method was used to retrieve all the papers about the recent process in molecular biotechnology of forestry research in Hubei Province，The results showed that：molecular marker technology and gene engineering technology are the key techniques on molecular biotechnology research in Hubei forestry.Development of Molecular Markers and System Construction ，Genetic Basis and genetic diversity evaluation， cloning and transformation of functional gene are three new research hot topics.Finally Some suggestions for future resarch on molecular biotechnology research in Hubei forestry were put forward.

Key words：Molecular biotechnology；Forestry research；Hubei

分子生物學是近半個世紀以來迅猛發展的前沿學科，該學科以研究遺傳信息（核酸）及其載體（蛋白質）等生物大分子的組成結構、生物功能為主要目標，揭示各種生物大分子在生物特征和生命活動中的相互作用關系，并在分子水平對其進行利用和改造，因其具有簡便高效、低耗低害等特色已被各國廣泛應用于醫藥、衛生、食品、化工、環保、能源、司法等領域。

林業研究與其它行業相比具有其特殊性。首先林木普遍的生長周期長，幾年到幾十年不等，見效慢；其次林木基因組大（挪威云杉基因組是人類基因組的七倍，是擬南芥的一百多倍）[1]，且林木基因組雜合度高遺傳背景復雜；另一方面許多林木樹種的表型特征必須在達到其特定的成熟期才能顯現出來；最后是林木本身體積大，生長面積和分布范圍也大，實地調查費時費力。林業研究的特殊性決定了常規研究方法很難實現短時間內提升林木生產應用價值、達到林木速生高抗多性狀綜合改良需求，而分子生物學技術從分子水平研究林木生長成才機理，完全突破了傳統研究思維的限制，是林業發展的全新研究方向。湖北省森林覆蓋率達3961%，林木種質資源豐富，為了解分子生物學技術在湖北省林業研究的應用情況，本文從中國知網全文數據庫資源調查入手，檢索了近10年來有關湖北分子生物學在林木研究上的文獻資料，系統歸納和梳理分子生物技術在湖北林業研究中的應用歷程，了解研究現狀以及當前學科發展態勢，為分子生物技術在湖北林業研究中發揮更大作用提供理論依據。

1材料與方法

以中國知網（http：//www.cnki.net/） “中國學術期刊網絡出版總庫”、“中國博士學位論文全文數據庫”和“中國優秀碩士學位論文全文數據庫”為數據源，檢索日期為200611至20161121日，采用標準檢索方式，根據林業學科涉及范圍，學科領域選擇 “農業科技”中“林業”子學科，“基礎學科”中“生物學”下的“植物學”子學科，以“分子”“DNA”或“基因”為主題關鍵詞，以湖北省內科研單位及大專院校為第一作者單位，剔除綜述、評論、文庫重復等共檢索出文獻105篇，其中包括46篇碩博論文，59篇學術期刊論文。

湖北林業科技第45卷

第6期彭 嬋，等：基于CNKI的分子生物學技術在湖北省林業研究中的應用與進展分析

2結果與分析

2.1文獻發布樹種及技術類型

對105篇文獻進行統計分析，涉及到樹種30類，大部分樹種如表1所示，除表1另有珙桐、栓皮櫟、白皮松、刺槐、水杉、杜仲、楓楊等15余種樹木。研究文獻所涉及主要技術手段：其中55篇文獻為基因工程轉基因技術相關文獻，43篇文獻以分子標記篩選與應用為主要內容，DNA 條形碼技術、測序技術文獻各一篇，同工酶技術文獻5篇（見圖1）。

2.2分子生物學技術在湖北林業研究中的應用

2.2.1同工酶技術的應用

同工酶（等位酶）技術就是通過對同種酶不同分子形式的電泳譜帶分析，來識別控制這些譜帶的基因位點和等位基因，同工酶技術與DNA標記技術相比存在信息量少、且無法從DNA水平上檢測遺傳變異等缺點， 但是在早期林木研究中曾被廣泛應用。

李軍民[2]、丁小飛等人利用同功酶（等位酶）技術對湖北省部分地區的栓皮櫟[2]、檫木[3]、馬尾松[4]和白皮松[5]天然群體進行了遺傳結構和遺傳多樣性分析，結果表明：長陽栓皮櫟群體和馬尾松群體都具有較高的遺傳變異性水平，而檫木及南漳白皮松群體遺傳變異性水平均低于其他同類平均水平，同時結果發現馬尾松群體和檫木群體內雜合體不足，純合體過量，處于非平衡狀態，故對其適宜采取原地保護和異地保存相結合的保護策略。

丁小飛[6]等人利用等位酶分析結合外部形態（葉片、樹皮、小枝）比較，從表現以及基因型鑒別了鵝掌楸屬內 2 個種及種間雜種，并發現在Pgm和Shdh的基因位點分別存在特征譜帶，可以用于今后從基因水平識別鵝掌楸開雜交育種和雜種苗。

2.2.2分子標記技術的應用

隨著分子生物學及其技術的快速發展，分子標記技術因其能直接從DNA 水平反映個體遺傳差異且不受植株發育時空和環境及其他因素影響所以得到了非常廣泛的應用，是現今最為理想的遺傳標記技術。近年來湖北省與林木相關的許多新分子標記被開發，并在種質資源種群結構、遺傳變異、親緣關系鑒定與分類、系統進化、以及育種等領域發揮重要作用。

（1）遺傳多樣性的分析。遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和，一個群體的遺傳多樣性越高，其對環境的適應能力越強，越容易拓展分布范圍，反之就越容易瀕臨滅絕。因而遺傳多樣性的分析測定對了解物種的遺傳基礎、環境適應性、防止資源過度開發和制定科學有效的保護策略具有舉足輕重的意義。在湖北省林木資源遺傳多樣性研究應用領域，主要涉及以下4 個方面：①運用分子標記技術對同一樹種不同群體的遺傳基礎進行評價。大量研究表明，湖北林木種質資源具有豐富的遺傳多樣性。研究人員通過AFLP[7]、SRAP[8]以及ISSR+SRAP[9]的標記組合分析了湖北省內各地區大面積栽培的油茶群體，結果顯示均具有較高的遺傳多樣性。在優良單株研究上彭嬋[10]、李良[11]等分別對湖北省林科院收集的鄂、湘林、長林等市場優良品種和全省范圍內初選優良單株進行了SSR和ISSR分析顯示多樣性豐富。郭新安[12]、趙西梅[13]等人分別對紅安、羅田、麻城、巴東、隨州和安陸等地銀杏古樹進行ISSR標記研究，結果一致發現在物種水平上這些地區的銀杏古樹群體具有較高的遺傳多樣性，結合形態標記和分子標記對部分優良單株的遺傳基礎評價也認為總體水平上遺傳基礎較寬[14]。②運用分子標記技術探究物種瀕危原因并提出科學保護措施。楊琴軍[1516]、李江偉[1718]等在建立穩定的臺灣杉RAPD、ISSR、NSSR和CPSSR反應體系基礎上對包括湖北星斗山在內幾個臺灣杉原生居群的研究結果顯示各地種源遺傳多樣性高低程度不一，居群間的地理距離與遺傳距離之間無明顯相關性，認為臺灣杉生長原生境直接破壞及其自身的自然更新不良是導致臺灣杉種群瀕危的可能原因。珙桐[19]、香果樹[20]也存在同類問題，對此類樹種建議：建立髙效的種子萌發技術體系，保護現有資源禁止砍伐，種植園內遷移保存。而白豆杉[21]與黃梅秤錘樹[22]群體則面臨近交衰退風險，亟待開展遷地保護工作， 包括構建資源庫保存關鍵基因型。武漢植物園鄧建云[23]研究古樹資源發現一株有特異AFLP標記的杜仲古樹，并推測這一杜仲古樹是原始野生植株，在現今野生杜仲資源幾乎滅絕的情況下這株古樹急需進行切實的保護和深入研究。③運用分子標記技術對品種遺傳穩定性進行評價。物種遺傳穩定性關系到林木種質保護，利用分子標記進行遺傳穩定性分析尤為重要，可以解決林木經過多代、多次無性繁殖后種苗是否依舊保有其原品種的遺傳性狀，以及林木種苗對外界環境干擾的變異性等問題。熊丹[24]等對野生香果樹體細胞胚繁殖中不同繼代的胚性愈傷組織和再生植株之間的遺傳穩定性進行RAPD標記研究， 發現香果樹的胚性愈傷組織會發生體細胞無性系變異，但隨著繼代次數的增多，體細胞胚的變異率不是逐漸升高，而是先升高后下降。而姚軍[25]等選取處于不同立地條件下少果毛一球懸鈴木不同年份的嫁接單株進行ISSR 分子標記研究顯示，一球懸鈴木嫁接單株之間遺傳差異極小，遺傳穩定性高，多年嫁接后仍與母本性狀保持一致。王瑞靜[26]采用不同劑量60Co-γ對黑派4個楊樹品種輻射敏感度進行研究，發現各劑量組間平均基因相似系數變化無規律，并未因輻射劑量增大而增大，輻照處理后獲得的楊樹植株在DNA水平上存在多態性差異，圣山楊對輻射較為敏感。④運用分子標記技術對各個群體進行聚類分析，探討不同群體的親緣關系與地理位置關系。各樹種遺傳多樣性的普遍研究[2730]結果顯示相同區或地域鄰近的居群遺傳距離也相對較小、親緣關系較近；地理距離較遠的居群，其遺傳距離也相對較大、親緣關系較遠，說明各群體之間親緣關系的親疏與地理分布的遠近呈較強的正相關性。但木荷[31]個別無性系與相同產地無性系并未聚在起，推測其遺傳基礎的變化可能是人為因素的干擾所致。復雜的山形地貌的阻隔也可能對同一地區不同居群間基因流造成影響，袁珊[32]對神農架4 個居群66 個連香個體調查發現，在小尺度的山體隔離下也可能產生物種不同程度的分化，從而影響植物居群的遺傳結構。

（2）核心種質構建。不斷深入的林木研究工作需要廣泛收集種質資源和保存豐富的遺傳資料，但隨著種質資源的不斷積累，尤其是多數林木自身體積量大，其種植生長面積需求量更大，龐大的資源群體數量給種質資源的保存帶來了壓力。為解決這一難題，并提高有限空間里種質資源研究和利用的效率，以盡可能小數量的收集品種代表盡可能多的物種遺傳性狀，核心種質的構建成為現今林業研究的一個重要方向。

文靚[33]在ISSR分子標記結果的基礎上，采取逐步聚類隨機取樣法分別湖北鄉土毛白楊、響葉楊、山楊和大葉楊種質資源構建核心種質，t檢驗結果各項遺傳指標與初始種質差異不顯著，說明構建的核心種質能夠很好代表原始種質的遺傳多樣性。鄭瑜[34]研究了銀杏核心種質構建的最佳構建策略，認為分組應按來源產地，組內以對數比例法確定取樣量，25%的取樣比例，最后以組內類平均法（UPGMA）聚類抽樣的策略最佳。并以此法篩選出52份核心種質樣品，各項遺傳多樣性參數明顯高于保留種質相比，說明所構建的核心種質對原始種質群體遺傳多樣性具有較高的代表性。

（3）種質鑒定。優良的種質資源是林木研究、生產和育種的基礎，林木品種鑒定是確保優良種源的一個重要環節。傳統的植株形態鑒定雖然簡單直觀，但也受限于表觀特征數量少、環境影響大、主觀因素干擾、植株生長周期季節限制等因素，難以正確反映品種之間固有的親緣關系。而采用分子標記技術進行雜種純度鑒定，是從基因組DNA的水平檢測雜交種及其親本的差異，鑒定速度快、準確率高、非生物因素影響小，確保了被鑒定品種的真實性。楊樹是中國工業人工林主栽樹種之一，目前各地栽培的楊樹品種繁多且混雜，但楊樹種苗形態上可作為品種鑒定的特征標記數量有限，尤其是親緣關系相近的楊樹黑楊品種間的形態學差異甚微，張亞東[35]等人利用新型分子標記EST-SSR鑒定湖北省內目前主栽的 8 個黑楊品種，得到7 對多態性引物在不同品種間有特異譜帶，而只需4對就可以完全區別這8個近緣關系種，該結果證明EST-SSR標記完全可以應用于鑒定林木品種，且鑒別效率較高。付秀芹[36]聯合形態學特征、光合作用特點并RAPD分子標記鑒定了烏桕雜種的真實性，進一步證實了分子標記完全可以應用于林業實踐生產中。

（4）分子系統學研究。系統學是運用DN A 分析技術從基因、個體及居群水平上，來探討物種的多樣性、親緣關系及其之間進化關系的科學，可了解物種的起源與傳播途徑、系統位置和分類地位等，利于資源保護保存和可持續利用[3738]。現在許多林木的系統發育關系至今仍不清楚，分類和系統發育關系以及起源問題，還沒有達成共識。王麗娜[37]、王璐[39]等分別對山毛櫸科水青岡屬7個物種以及部分外類群進行了系統發育關系和地理分布格局研究，前者結果認同泛生物地理學的研究，即水青岡屬的分子系統發育與之一致，都認為水青岡屬植物在進化過程中受大陸漂移等地質歷史事件的影響。后者研究結果也與櫸屬地理分布極其吻合，因此假設櫸屬的原始分布區或起源中心為北太平洋的某個地區（中國或日本北部）。陳仁芳[38]綜合分子系統學和其他三門科學研究桑屬屬內種數和系統發育關系，對桑種植資源鑒定、育種親本選擇以及桑的分子育種等技術問題有很大幫助。

2.2.3其他技術應用

DNA條形碼技術是建立在DNA序列分析技術之上，即用一個或幾個標準的DNA片段來完成物種分類和鑒定工作，利用該方法進行木材分類是傳統木材鑒別方法的重要突破，湖北大學楊路路[40]以水杉為例，探尋了保存1 a、2 a和6 a的水杉木材及陰沉木DNA提取方法，并用DNA條形碼技術篩選分析DNA序列片段，證實了序列ITS-2、trnL-F均適合杉科DNA條形碼技術要求，對于已降解材料ITS-2更為適用，繼而在此基礎上建立了一套適于杉科分子水平的木材鑒定體系.

表達序列標簽（EST）和基因組測序也是功能基因組學中常用的高通量研究方法，湖北省林科院張新葉[4142]等人首先利用現有數據庫中來自美洲黑楊及歐美楊的20 023條EST序列開發了楊樹EST-SSR標記，此后又結合EST序列和生物信息學方法進行了楊樹SNPs標記開發，并測序驗證得到13個候選SNPs位點可以用于楊樹進一步相關研究。利用所開發的標記，楊彥伶[43]等人基于柳樹和楊樹的親緣關系，探究了楊樹SSR和ESTSSR標記在柳樹中的通用性，發現ESTSSR標記通用性較好，而基因組SSR標記多態性較好。此后，張新葉[44]等人又用黑斑病高抗與高感的美洲黑楊為材料建立了2個cDNA文庫，通過克隆測序鑒定出177個抗病候選基因，該研究為進一步從基因水平探究黒楊的抗黑斑病機制及功能基因的發現奠定了基礎。

利用EST技術開發的分子標記來自于基因編碼序列，因其更為保守多態性相對量也較少，因此開發全基因組標記對林木研究也不可或缺。目前，第 2 代高通量測序技術已被廣泛應用，水杉是中國一級保護植物，發源地湖北利川，張新葉[45]利用第二代高通量測序平臺 ROCHE-454 GLX對水杉基因組進行測序，在得到的全基因組信息上對所含微衛星重復序列進行了特征和組成情況分析，發現1 965個微衛星其中921個可開發的SSR標記位點，引物驗證結果也表明所開發標記的高效性，該結果不僅豐富了水杉群體的標記資源，更對保存遺傳學與分子標記輔助育種有重要意義。

2.2.4林木基因工程研究

通常林木基因工程是指將克隆的外源優良目的基因利用DNA重組等技術導入植物細胞或組織進行表達，以有效改良品種的不良性狀定向獲得有利性狀的植物新品種的技術，該技術不僅克服了植物有性雜交的限制性而且無限擴大基因交流的范圍。在過去的 10年里，湖北省林木基因工程已在花期調控、雄性不育、次生代謝物合成、抗病蟲害、和抗逆等發面取得了很大進展，詳情見表2。

（1）銀杏基因工程進展。銀杏葉中活性化合物不僅對植物自身生長和抗逆性有重要作用，也是植物藥制劑的重要材料，我省銀杏基因工程研究主要圍繞銀杏葉黃酮類和萜內酯類合成代謝調控以及銀杏逆境脅迫耐受力展開。

李金寶[46]、李琳玲[47]從等結構基因表達序列方向，分別對銀杏葉中類黃酮生物合成過程中的關鍵酶PAL（苯丙氨酸解氨酶）、CHSP（查爾酮合成酶）基因啟動子序列進行了表達載體構建和功能分析。袁紅慧[59]人等通過基因步移法克隆得到萜內酯合成 MEP 途徑中兩個關鍵酶基因GbMECT和 GbMECPs的啟動子序列，并對其進行了生物信息學分析，為后續萜內酯或其前體物質生產建立了分子基礎。

李琳玲[54]、程華[5557]等人首次利用RACE技術克隆得到銀杏葉綠體銅鋅超氧化物歧化酶基因GbCuZnSOD、錳型超氧化物歧化酶GbMnSOD、過氧化氫酶基因CAT1、POD1的cDNA序列，采用Northern雜交及進化樹分析基因起源，并用RTPCR技術探明這些基因在植物中的表達情況，以期揭示其對環境適應能力及抗逆性分子機理，為林木遺傳改良提供理論依據和基因資源。

（2）紅豆杉基因工程。

紫杉醇是紅豆杉的重要次生代謝產物，已有研究證明紫杉醇能夠使細胞周期停滯于有絲分裂期從而抑制癌細胞的有絲分裂，對各種癌癥都有很好的療效[64，67]。研究其在紅豆杉中生物合成代謝及機制顯得尤為重要。

紫杉醇合成約需要 20 步酶促反應，探究參與各合成反應的酶及其編碼基因的功能， 并通過基因工程途徑調節紫杉醇的合成代謝是目前的一個主要研究方向。燕麗娜[62]等以南方紅豆杉為材料， 獲得了紫杉烷7β羥基化酶基因的全長序列，并對其進行了進化分析。張志建[63]等對曼地亞紅豆杉的3氨基3苯基丙酰轉移酶（BAPT）基因進行了克隆，并研究其在大腸桿菌中的表達。謝莎[68]從中國紅豆杉細胞中克隆TcNPR1基因，研究了其響應SA誘導大量合成紫杉醇的途徑和分子進化情況。張鵬[67]克隆了紫杉醇合成的最后一個關鍵酶紫杉烷側鏈苯甲酰轉移酶基因Dbtnbt，轉化紅豆杉細胞過表達后發現紫杉醇產量提高約37%。

紫杉醇合成系列關鍵酶基因的表達及其活性受轉錄因子影響，通過改造關鍵酶基因的啟動子或轉入相應的轉錄因子可激活酶的基因表達。鄧慧[61]克隆曼地亞紅豆杉細胞紫杉醇合成途徑中關鍵酶基因 DBAT 啟動子，為后續克隆相應紫杉醇轉錄因子打下基礎。于小青[64]將轉錄因子ORCA3和MET1RNA分別導入到紅豆杉細胞中發現紫杉醇產量明顯升高。李書濤[66]使用酵母單雜交技術分離了轉錄因子TcMYC和TcWRKY1，下一步是分析其在SA和 MeJA 介導紫杉醇合成過程中起到的作用。

（3）懸鈴木基因工程。懸鈴木是湖北省重要的園林綠化樹種，華中農業大學圍繞定向培育無毛或者雄性不育新品目標進行了一系列相關研究。黃文俊[72]將導致雄性不育的核糖核酸酶基因barnase導入到懸鈴木得到5%的穩定轉化率。李志能[74]構建了懸鈴木雌花cDNA文庫，并結合同源序列法和RACE技術克隆了花發育LFY基因和部分MADSbox基因，為下一步不育懸鈴木研究奠定了基礎。易雙雙[70]，張佳琪[73]分別通過抑制成花轉換、花器官形成等關鍵基因PaFT、PaLFY的表達，以及時空表達分析以及異源表達實驗來研究這些關鍵基因的生物學功能，并通過表型觀測驗證了部分開花相關基因轉化遺傳穩定性。孔宇飛[69]在前人基礎上利用GUS報告基因對影響以懸鈴木合子胚為受體的農桿菌介導遺傳轉化條件進行探索認為Tm的濃度為300 mg/L，最適合作為轉化體系的抑菌濃度。菌液濃度OD值0.6～0.8之間，農桿菌的侵染能力最強，農桿菌EHA105適合作為侵染細菌。

圍繞無果、雄性不育的新品種培育方向，施雪萍[83]針對樟樹在成功轉化GFP基因植株基礎上，又進行了Barnase雄性不育基因和PaFT早花基因的轉化并得到了轉化Barnase的植株，證明了樟樹可以通過基因工程進行遺傳改良。其后劉冉冉[85]也將懸鈴木PaFT基因轉入楓香葉片再生體系開拓了鄉土樹種楓推廣應用新方向。

（4）楊樹基因工程。病蟲害一直是侵害林木生長的重要因素，林木抗性研究即通過基因工程手段引入抗病蟲害基因，使其在植株內穩定地遺傳和表達獲得相應抗性。湖北省氣候溫暖濕潤也是各種病害高發區，楊樹是主要造林以及林業產業樹種，熊瑞婷[75]以楊樹抗銹病基因MXC3為對象構建RNAi載體，以南林895楊的組培苗葉片作為受體材料進行遺傳轉化發現外源基因影響了楊樹內源MXC3基因的表達；徐金艷[76]、盧小三[77]分別構建了SN0431、LH0143、LH0417楊樹無性系再生體系并探究了其在不同條件下對轉化抗蟲基因CrylC+9C轉化效率的影響。康薇[78]、鄭進[79]等針對中嘉8號楊存在抗蟲性不強的缺陷，建立了中嘉8號楊原生質體再生及轉化體系，并發現轉BtcrylA基因楊樹植株具有明顯的抗蟲活性。肖碩[91]首次將BtcrylA基因轉入刺槐，并建立和優化了農桿菌介導的刺槐離體莖段的轉化體系，但對轉化植株在田間通過抗性試驗有待更進一步的檢驗和篩選。

（5）其他樹種相關基因工程。張艷[80]、梁曉靜[81]、郭少玲[82]利用RACE技術分別從毛竹中克隆出與生長素、赤霉素、脫落酸相關基因PheABPl+PheARFI、PheGA20ox、PhePP2C，并用QRTPCR技術分析了這些基因在不同劑量的60Coγ射線處理中的相對表達量。三峽大學景丹龍[86]、張博[87]分別對木蘭科紅花玉蘭和星花木蘭花發育AGAMOUS（AG）同源基因MwAG和MastAG的結構和功能進行分析，認為MwAG基因是雌、雄蕊發育的關鍵基因，僅表達于雌、雄蕊中而不在幼葉和花被片中，基因表達量與其雌、雄蕊發育快慢呈強相關性，而MastAG基因參與心皮的發生，能抑制A類基因活性。任景[89]利用SNP技術對控制油桐脂肪酸代謝關鍵基因fad2基因的變異情況進行研究認為該基因編碼區的SNP是導致不飽和脂肪酸和桐酸含量的增加的主要原因。許鋒[90]等利用反義RNA技術克隆國槐苯丙氨酸解氨酶基因SPAL并構建反義表達載體，導入擬南芥后對獲得的抗性植株進行Northern雜交鑒定及成分含量分析，結果表明SPAL基因對多酚和類黃酮有明顯抑制作用。湖北大學田良濤[92]首次構建了烏桕三倍體培育體系并進一步研究了烏桕胚乳轉基因的方法，為提高烏桕產能利用率打下基礎。

3結論與討論

本研究以CNKI中國知網全文期刊數據庫和碩博士學位論文數據庫為數據源，檢索和分析2006～2016年分子生物學在湖北林業研究中的應用情況，發現其中分子標記技術和轉基因技術是林業研究重點，主要涉及三大方面： 分子標記的開發與體系構建、遺傳基礎及多樣性評價、功能基因克隆與轉化，而有關核心種質構建、DNA條形碼、cDNA文庫建立、基因組測序等研究成為新興的熱點研究方向。雖然分子生物技術已經在湖北林業研究的各個領域中得到廣泛應用， 但與其它行業相比， 無論是在技術成熟度還是應用范圍來講都是剛剛起步。根據湖北林業研究的可持續發展的需要，結合分子生物技術的學科特性， 建議未來湖北林木分子研究從以下幾個方面著手開展研究工作：

（1）充分利用省內資源優勢， 加強本土優良、珍貴林木種質資源發掘與收集，同時著力開展已有資源高產、優質、多抗等相關性狀的系統評價， 儲備優質遺傳資源。

（2）不斷改進和利用新的分子標記技術，在進行新性狀 DNA 分子標記篩選的同時，積極尋找與林木重要性狀的主效基因連鎖更為緊密的標記，實現功能基因快速準確追蹤。

（3）構建高密度遺傳連鎖圖、物理圖譜尋求更為快速、簡捷的克隆功能基因的方法。

摸索建立可操作性強的轉基因體系，對性狀改良基因進行重點研究，改善一些具經濟價值性狀如觀賞、食用、藥用、環保、工業用等以獲得更大的經濟價值。在已有高產、優質品種中導入抗逆性的關鍵基因，創制一批擁有自主知識產權的高產多抗廣適新品種。

（4）基于林木植物基因功能分析的現有成果， 通過同源基因序列分析， 利用基因克隆與表達技術、基因芯片技術、RNAi/DNAi技術以及蛋白質組學技術， 在基礎研究層面深入揭示重要林木種發育與代謝過程的分子機制， 深入解析林木生長發育與環境相互適應的分子機制等。

雖然分子生物學手段相比傳統研究方法已顯示出更大優勢，但是通過基因層面對樹種的研究只是一種新的方向，并不能完全取代傳統方法，仍然需要將分子生物學技術與常規手段緊密配合，加速林木科研進程， 為湖北林業的發展發揮推動作用。

參考文獻

[1]Nystedt B.， N.R. Street， A. Wetterbom，等. The Norway spruce genome sequence and conifer genome evolution[J]. Nature， 2013，497（7451）： 579584.

[2]李軍民， 丁小飛， 陳紅林，等.長陽栓皮櫟天然群體遺傳多樣性的等位酶分析[J].湖北林業科技，2012（01）：34+12.

[3]丁小飛，陳紅林，曹健，等.檫木三個群體的遺傳結構初探[J].湖北林業科技，2006（05）：12.

[4]丁小飛，曹健，陳紅林，等.湖北省馬尾松天然群體的遺傳變異和遺傳多樣性研究[J].安徽農業科學，2006（13）：30573059.

[5]丁小飛，楊桂芬，董梅，等.白皮松天然群體遺傳多樣性的等位酶分析[J].廣東林業科技，2011（01）：812.

[6]丁小飛，曹健，陳紅林，等.同功酶技術在鵝掌楸屬樹種分類中的應用研究[J].湖北林業科技，2009（02）：58+14.

[7]張婷，劉雙青，梅輝，等.湖北省不同地區油茶遺傳多樣性的AFLP分析[J].安徽農業科學，2011（23）：1407014071+14075.

[8]左雪枝.SRAP標記技術優化與湖北油茶遺傳多樣性研究[D].湖北：華中農業大學，2012.

[9]張婷，劉雙青，董妍玲.湖北省油茶種質資源的遺傳基礎研究[J].河南農業科學，2011（11）：5356.

[10]彭嬋，李振芳，陳慧玲，等.湖北油茶種質資源SSR分析[J].湖北林業科技，2013（05）：14+32.

[11]李良.湖北省油茶優良單株遺傳多樣性及品質初步分析[D].湖北：華中農業大學，2010.

[12]郭新安.湖北省三大區域群體銀杏古樹遺傳多樣性的ISSR分析[D].湖北：華中農業大學，2006.

[13]趙西梅.湖北省大別山區銀杏古樹種核變異的研究[D].湖北：華中農業大學，2007.

[14]王婷婷.銀杏優良單株的遺傳基礎分析[D].湖北：華中農業大學，2014.

[15]楊琴軍，陳光富，劉秀群，等.湖北星斗山臺灣杉居群的遺傳多樣性研究[J].廣西植物，2009（04）：450454+567.

[16]楊琴軍，袁繼林，付強，等.臺灣杉ISSR反應體系的建立及檢測[J].華中農業大學學報，2011（04）：432437.

[17]李江偉，楊琴軍，劉秀群，等.臺灣杉遺傳多樣性的ISSR分析[J].林業科學，2014（06）：6166.

[18]李江偉.基于NSSR和CPSSR標記的臺灣杉遺傳多樣性研究[D].湖北：華中農業大學，2014.

[19]羅世家.珙桐遺傳多樣性與保護生物學研究[D].湖北：華中農業大學，2012.

[20]熊丹，陳發菊，李雪萍，等.神農架地區瀕危植物香果樹的遺傳多樣性研究[J].西北植物學報，2006（06）：12721276.

[21]王艇，蘇應娟，歐陽蒲月，等.利用RAPD標記分析瀕危植物白豆杉種群的遺傳結構[J].生態學報，2006（07）：23132321.

[22]阮詠梅，張金菊，姚小洪，等.黃梅秤錘樹孤立居群的遺傳多樣性及其小尺度空間遺傳結構[J].生物多樣性，2012（04）：460469.

[23]鄧建云，李建強，黃宏文.一株具有特異AFLP指紋圖譜的杜仲古樹[J].武漢植物學研究，2006（06）：509513.

[24]熊丹，謝偉，陳發菊，等.香果樹組織培養過程中遺傳變異的RAPD分析[J].植物生理學通訊，2008（01）：3741.

[25]姚軍，張麗芳，涂炳坤，等.基于ISSR標記的少果毛一球懸鈴木遺傳穩定性分析[J].中南林業科技大學學報，2014（02）：611.

[26]王瑞靜.黑楊派4個楊樹品種～（60）Coγ輻射效應研究[D].湖北：華中農業大學，2009.

[27]黎曙光.湖北省楓楊種質資源的收集及遺傳多樣性分析[D].湖北：華中農業大學，2007.

[28]萬愛華，徐有明，管蘭華，等.馬尾松種子園無性系遺傳結構的地理變異[J].東北林業大學學報，2006（04）：1214+48.

[29]肖黎，李曉玲，王玉兵，等.22種木蓮屬植物親緣關系的ISSR分析[J].植物研究，2011（04）：489494.

[30]肖黎，馬太洋，李曉玲，等.22種木蓮屬植物親緣關系的SRAP分析（英文）[J].西北植物學報，2011（11）：21782184.

[31]辛娜娜.木荷家系遺傳及其育種親本特性的研究[D].湖北：華中農業大學，2014.

[32]袁珊，孟愛平，李建強，等.神農架山體對瀕危植物連香樹遺傳結構影響的研究[J].植物科學學報，2012（04）：358365.

[33]文靚.湖北鄉土楊樹的核心種質構建研究[D].湖北：華中農業大學，2013.

[34]鄭瑜.銀杏核心種質構建初探[D].湖北：華中農業大學，2010.

[35]張亞東，胡興宜，宋叢文.利用新型分子標記ESTSSR鑒定湖北省內的主栽黑楊品種[J].分子植物育種，2009（01）：105109.

[36]付秀芹，宋兆建，蔡明鋒，等.能源植物烏桕雜種苗期形態與光合特性及分子鑒別[J].湖北林業科技，2011（06）：1721.

[37]王麗娜.山毛櫸科水青岡屬（FagusL.）的分子系統發育關系和生物地理研究[D].湖北：華中師范大學，2012.

[38]陳仁芳.桑屬系統學研究[D].湖北：華中農業大學，2010.

[39]王璐，雷耘，張明理.基于序列trnLtrnF和ITS的櫸屬系統發育與地理分布格局的初步分析[J].植物生態學報，2013（05）：407414.

[40]楊星宇，楊路路，余志偉，等.水杉木材DNA提取及條形碼分子鑒定[J].湖北大學學報（自然科學版），2011（04）：397403.

[41]張新葉，宋叢文，張亞東，等.楊樹ESTSSR標記的開發[J].林業科學，2009（09）：5359.

[42]張新葉，宋叢文，楊彥伶，等.基于EST序列的楊樹候選SNPs標記分析[J].華中農業大學學報，2009（06）：741745.

[43]楊彥伶，張亞東，張新葉.楊樹SSR標記在柳樹中的通用性分析[J].分子植物育種，2008（06）：11341138.

[44]張新葉，宋叢文，黃敏仁.楊樹抗黑斑病相關基因表達譜分析（英文）[J].林業科學，2011（01）：8594.

[45]張新葉，張亞東，彭嬋，等.水杉基因組微衛星分析及標記開發[J].林業科學，2013（06）：160166.

[46]李金寶，唐寅，許鋒，等.銀杏GbPAL基因啟動子表達載體的構建[J].貴州農業科學，2012（05）：1719.

[47]李琳玲，程華，程水源，等.銀杏查爾酮合成酶基因啟動子（GbCHSP）調控元件及功能分析[J].園藝學報，2010（12）：19191928.

[48]許鋒，孫楠楠，張威威，等.銀杏GbMYBF2啟動子克隆及序列分析[J].貴州農業科學，2014（04）：1620.

[49]龔付全，熊超，陳柳吉，等.銀杏CONSTANS基因的克隆與序列分析[J].湖北農業科學，2010（12）：29452948.

[50]張威威，寧迎晶，陳柳吉，等.銀杏CONSTANS基因植物表達載體構建[J].生物技術，2010（06）：810.

[51]許鋒，張威威，唐寅，等.銀杏葉綠體petD基因的克隆與表達[J].植物生理學通訊，2010（01）：3741.

[52]李琳玲，程華，陳小玲，等.銀杏類黃酮3羥化酶基因的克隆與表達分析[J].園藝學報，2015（04）：643654.

[53]程華，李琳玲，王燕，等.銀杏EPSPS基因克隆及表達分析[J].西北植物學報，2010（12）：23652372.

[54]程華，許鋒，王燕，等.銀杏葉綠體銅鋅超氧化物歧化酶基因GbCuZnSOD的克隆與表達[J].林業科學，2010（06）：3542.

[55]程華，李琳玲，許鋒，等.銀杏過氧化氫酶基因CAT1的克隆及表達分析[J].林業科學研究，2010（04）：493499.

[56]程華，李琳玲，王燕，等.銀杏過氧化物酶基因POD1的克隆及表達分析[J].華北農學報，2010（06）：4451.

[57]程華，李琳玲，許鋒，等.銀杏錳型超氧化物歧化酶GbMnSOD基因的克隆與表達[J].園藝學報，2009（09）：12831290.

[58]袁紅慧，程華，李琳玲，等.銀杏MECPs基因啟動子克隆及其植物表達載體的構建[J].貴州農業科學，2013（05）：1015.

[59]袁紅慧.銀杏MECT、MECPs基因啟動子克隆及植物表達載體構建[D].湖北：武漢工程大學，2013.

[60]袁紅慧，程華，李琳玲，等.銀杏MECT基因啟動子克隆及序列分析[J].湖北農業科學，2015（07）：17461750.

[61]鄧慧.紫杉醇生物合成酶DBAT啟動子的克隆與植物表達載體的構建[D].湖北：華中科技大學，2007.

[62]燕麗娜，蘇應娟，王艇.南方紅豆杉紫杉烷7β羥基化酶基因全長序列的克隆和進化分析[J].中山大學學報（自然科學版），2009（05）：120124.

[63]張志建，郭佳玉，張鵬，等.紫杉醇合成關鍵酶BAPT基因的克隆及原核表達[J].現代生物醫學進展，2010（16）：30113014.

[64]于小青.紅豆杉細胞遺傳轉化體系優化及轉基因細胞株ORCA3、MET1RNAi基因表達分析[D].湖北：華中科技大學，2011.

[65]于小青，楊海燕，張蒙，等.ORCA3轉錄因子對紅豆杉細胞中紫杉醇生物合成的影響[J].山地農業生物學報，2012（03）：189193.

[66]李書濤.調控紫杉醇合成轉錄因子TcMYC和TcWRKY1的克隆及功能研究[D].湖北：華中科技大學，2012.

[67]張鵬，李書濤，付春華，等.過表達Dbtnbt基因提高中國紅豆杉細胞的紫杉醇含量[J].中國生物化學與分子生物學報，2014（04）：377382.

[68]謝莎，許想平，張蒙，等.中國紅豆杉TcNPR1基因的克隆與功能研究[J].植物科學學報，2014（04）：383393.

[69]孔宇飛.懸鈴木開花相關基因遺傳轉化研究[D].湖北：華中農業大學，2014.

[70]易雙雙.二球懸鈴木花發育相關基因功能的初步驗證及遺傳轉化[D].湖北：華中農業大學，2010.

[71]彭文明.不同基因型懸鈴木的離體培養及遺傳轉化研究[D].湖北：華中農業大學，2009.

[72]黃文俊.農桿菌介導不育基因轉化懸鈴木及長期繼代培養植株的遺傳穩定性分析的研究[D].湖北：華中農業大學，2007.

[73]張佳琪.二球懸鈴木花發育相關基因的克隆及功能研究[D].湖北：華中農業大學，2010.

[74]李志能.二球懸鈴木LFY及MADSbox同源基因克隆、功能驗證及其系統進化研究[D].湖北：華中農業大學，2008.

[75]熊瑞婷.楊樹MXC3基因RNAi載體構建及遺傳轉化研究[D].湖北：華中農業大學，2015.

[76]徐金艷.兩種楊再生體系建立及轉Cry1C+9C基因的研究[D].湖北：華中農業大學，2011.

[77]盧小三.兩個楊樹無性系再生體系的建立及抗蟲基因Cry1C+9C轉化的初步研究[D].湖北：華中農業大學，2010.

[78]康薇.中嘉8號楊基因轉化受體系統的建立及轉BtCry1A基因植株檢測[D].湖北：華中師范大學，2007.

[79]鄭進.BtCry1A基因轉化中嘉8號楊的研究[D].湖北：華中師范大學，2006.

[80]張艷.毛竹生長素相關基因的克隆及輻射對其表達的影響[D].湖北：華中農業大學，2010.

[81]梁曉靜.毛竹赤霉素相關基因的克隆及輻射對其表達的影響[D].湖北：華中農業大學，2011.

[82]郭少玲.毛竹脫落酸相關基因的克隆及輻射對其表達的影響[D].湖北：華中農業大學，2013.

[83]施雪萍.樟樹體細胞胚再生體系的優化和轉化Barnase、PaFT基因的研究[D].湖北：華中農業大學，2009.

[84]陳甘明.樟樹遺傳轉化體系的優化及抗寒基因的轉化[D].湖北：華中農業大學，2014.

[85]劉冉冉.楓香遺傳轉化體系的優化及轉化PaFT基因的研究[D].湖北：華中農業大學，2010.

[86]景丹龍，馬江，張博，等.紅花玉蘭MwAG基因在花發育不同時期的表達[J].植物學報，2013（02）：145150.

[87]張博.星花木蘭AGAMOUS同源基因的可變剪接與功能分化[D].湖北：三峽大學，2015.

[88]李虹俠.油桐種子油體發育規律和FADX、PDAT1基因克隆表達[D].湖北：中國科學院研究生院（武漢植物園），2015.

[89]任景，油桐的再生體系建立及其fad2基因克隆與多態性分析[D].湖北：華中農業大學，2011.

[90]許鋒，朱俊，張風霞，等.國槐苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、反義表達載體構建及遺傳轉化[J].林業科學研究，2008（05）：611618.

[91]肖碩，刺槐高頻再生體系的建立及轉BtCry1A基因的初步研究[D].湖北：華中師范大學，2009.

[92]田良濤，烏桕胚乳三倍體植株再生與轉基因研究[D].湖北：湖北大學，2011.

（責任編輯：唐 嵐）