蝎毒多肽逆轉白血病干細胞多藥耐藥作用的研究

楊向東+王興麗+楊文華+趙磊+顏田賅

[摘要] 該實驗采用BALB/c小鼠多藥耐藥（MDR）白血病模型，觀察蝎毒多肽（PESV）對小鼠瘤體MDR白血病干細胞（LSC）P-gp（P-gp）蛋白上游信號的影響，研究PESV逆轉白血病干細胞（LSC）多藥耐藥的效果及機制；同時通過流式細胞術，RT-PCR，Western blot，Elisa法分別檢測 P-gp，MDR1 mRNA，PI3-K，NF-κB表達，并通過組織病理學方法檢測小鼠肝臟、脾臟等。結果顯示，正常對照組小鼠無明顯變化，其余6組小鼠均出現弓背、消瘦等表現，肝臟腫大，肝內均出現炎癥壞死；PESV下調小鼠瘤塊中LSC細胞膜P-gp，PI3K蛋白表達下調；胞漿中MDR1 mRNA表達在PESV低劑量組顯著下降，在中、高劑量組出現不同程度的升高；PESV顯著降低LSC細胞核內NF-κB因子水平。PESV具有明顯下調P-gp上游信號PI3K/NF-κB/MDR1的作用，在一定程度上增強了LSC對化療藥物阿霉素（ADM）的敏感度，從而闡述了PESV逆轉LSC多藥耐藥的可能機制之一，為PESV聯合抗腫瘤作用的進一步研究提供了基礎。

[關鍵詞] 蝎毒多肽；多藥耐藥；BALB/c小鼠模型；P-gp上游信號

[Abstract] Using the BALB/c mouse multidrug resistance model of leukemia，the effect of peptide extract from scorpion venom （PESV） to the upstream signal factors of P-gp of MDR leukemia stem cells on the mouse tumor block was observed，and the mechanism of PESV to reverse the MDR of LSC was studied. At the same time，the expression of P-gp，MDR1 mRNA and PI3-K，NF-κB were respectively detected through flow cytometry，RT-PCR，Western blot and Elisa，and the mouse liver，spleen were examined via histopathological methods. The results of the experiment were as follows： mice of the control group didnt show any obvious changes，while mice of the other six groups all showed arched back，emaciation，liver swell，and inflammation was found in all liver tissue. The expression level of P-gp and PI3K on the LSC membrane of mouse tumor block was down-regulated；the expression of MDR1 mRNA in the cytoplasm was obviously down in the PESV low dose group，and which was inordinately up in the middle dose group and the high dose group. The expression level of NF-κB in the leukemia stem cell nucleus remarkably decreased. PESV had a outstanding role of down-regulating PI3K，NF-κb，MDR1 which were all upstream factors of P-gp，and to a certain degree enhanced the sensitivity of LSC to ADM. Therefore，this experiment explained one of the mighty mechanism of PESV to reverse MDR of LSC，and provided a foundation to further study of combinational anti-cancer effects of PESV.

[Key words] peptide extract from scorpion venom （PESV）；MDR；BALB/c mouse model；upstream signal factors of P-gp

doi：10.4268/cjcmm20162426

白血病細胞對化療藥物產生多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現象是急性白血病（acute leukemia，AL）化療失敗及復發的主要原因之一[1]。MDR是指腫瘤細胞接觸一種化療藥物產生耐藥的同時，對多種結構不同、作用機制各異的其他化療藥物也產生交叉耐受性。白血病細胞產生MDR現象較常見的機制是磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）受到細胞因子、藥物等配體活化后，促使生成磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI），PI作為細胞內的第二信使活化蛋白激酶B（protein kinase，PKB又稱AKT）[2]，AKT磷酸化下游核轉錄因子（nuclear facter，NF-κB），活化的NF-κB啟動多藥耐藥基因（multidrug resistance 1，MDR1），MDR1轉錄后的mRNA表達其編碼的P-糖蛋白（P-glycoprotien，P-gp），P-gp可以利用水解ATP的能量將各種藥物從細胞內轉運到細胞外，降低藥物在細胞內的濃度，并使其細胞毒作用減弱直至消失[3]，這樣形成以P-gp上游信號PI3K/AKT/NF-κB/MDR1介導為主的白血病細胞MDR通路。所以迫切需要模擬MDR的LSC（leukemia stem cells）在體內生物學特征，課題組系統回顧文獻，從實驗的實用性、可操作性角度出發比較尾靜脈、腹腔、皮下注射和瘤塊包埋4種成模MDR白血病模型方法，以便同道參考。課題組前期研究發現蝎毒多肽（peptide extract from scorpion venom，PESV）可以通過上調DNR（daunorubicin）損傷細胞的PTEN基因、tie-2基因表達改變KG1α干細胞凋亡與分化[4]，也有研究表明PTEN基因上調Bax等多種信號分子逆轉K562/ADM細胞的MDR現象[5]，這提示PESV有逆轉白血病細胞耐藥的可能，因此探討PESV是否是通過調節P-gp 上游信號PI3K/NK-κB/MDR1實現逆轉白血病干細胞MDR。

1 材料

臺式高速離心機（LG16-W，北京京立離心機有限公司）；CO₂培養箱（NAPCO MODEI 5410）；倒置顯微鏡（OLYMPUS IM）；流式細胞儀（C6，美國BD公司）；萊卡石蠟包埋機EG1150（北京長恒榮創科技有限公司）；全波長掃描酶標儀（Thermo Scientific公司）。

采用電刺激東亞蝎尾采集新鮮毒液，經高速離心分離，真空干燥制成蝎毒干粉，-20 ℃保存。從蝎毒凍干粉中按文獻[7]方法提取蝎毒多肽，含50～60氨基酸的多肽混合物，相對分子質量6 000～7 000，純度89.1%，耐熱，pH穩定，使用前用0.9%氯化鈉溶液溶解稀釋到所需濃度。

細胞株采用經典髓系白血病耐ADM的K562/A02細胞株[6]，由中國醫學科學院血液病研究所提供。BALB/c小鼠，雌性，6～7周齡，體重18～22 g，共計40只，購自北京華阜康動物公司，動物許可證號SCXK（京）2014-0004，在SPF級環境下飼養，采用濾膜飼養籠，裸鼠所需飼料、飲水及其他物品均高壓滅菌。

RPMI-1640培養基（HyClone公司）；10%胎牛血清（Gibco公司）；PE Mouse Anti-Human CD34 Antibody（美國BD公司）；FITC Mouse Anti-Human CD38 Antibody（美國BD公司）；CD34 Micro Bead Kit-Human（MiltenyiBiotec公司）；CD38 Micro Bead Kit-Human（MiltenyiBiotec公司）；MACS分選架及 LD、MS柱（MiltenyiBiotec公司）；CCK-8試劑盒（索羅門生物科技有限公司）；Elisa檢測試劑盒（美國BD公司）；Western blot檢測試劑盒（北京世紀康為公司）；RT-PCR試劑盒（北京康為世紀公司），MDR1基因引物序列[8]：上游引物5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′，下游引物5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′；內參照β-actin引物序列：上游引物5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游引物5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′。

2 方法

2.1 K562/A02干細胞分選培養 常規復蘇液氮凍存K562/A02細胞，置于含15%胎牛血清的RPMI-1640（100 U·mL^-1青霉素和100 g·L^-1鏈霉素）培養基中常規培養，每3～4 d傳代1次。培養條件：5% CO₂，37 ℃恒溫培養箱。采用免疫磁珠法分選K562/A02干細胞，收集1×10⁸個對數生長期的K562/A02細胞，嚴格按照 MACS 磁珠分選說明書進行，經流式細胞儀分析樣本中1×10⁴個細胞中的陽性細胞數，鑒定后實驗備用。

2.2 動物造模建立及分組給藥 實驗先選取5只雌性BALB/c小鼠，經皮下注射K562/A02干細胞，每次間隔3 d，每次注射0.2 mL（5×10⁷個/mL），形成皮下瘤塊備用。再將35只BALB/c小鼠隨機分為正常對照組，模型組，ADM組，PESV組，ADM+PESV高、中、低劑量組。除正常對照組外各組照射后，經包埋穿刺針接種0.2 cm×0.2 cm大小瘤塊1處。成模后，對照組予0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，其余各組予腹腔注射ADM和（或）PESV。ADM腹腔注射0.05 mg（按成人40 mg·m^-2·d^-1換算）隔日1次，第1，3，5，7，9，11，13天，PESV按高、中、低（5，1，0.2 μg）劑量腹腔注射每天1次，給藥14 d，PESV組PESV劑量同中劑量組。第21天頸椎脫臼處死小鼠。

2.3 白血病多藥耐藥小鼠模型鑒定 BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，抽吸復沖骨髓制備骨髓細胞懸液，取1×10⁶個細胞分別加入CD34，CD117，CD45抗體，常溫孵育15 min；離心，棄上清，上機檢測白血病抗原，計數小鼠骨髓內白血病干細胞。剪取瘤組織，加入100 μL膠原酶消化（37 ℃，30 min），過濾，離心洗滌。收集小鼠骨髓細胞梯度接種于96孔板（A～H，1～3），每梯度設3個平行孔。培養72 h后向每孔加入8 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育20 min后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（A）及計算細胞IC₅₀。頸椎脫臼法處死BALB/c小鼠，應用無菌手術器械解剖，取肝臟放入10%甲醛中固定；梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡，石蠟包埋，切片，中性樹膠加蓋玻片封片，鏡檢。

2.4 流式細胞術P-gp檢測 剪取1 g中心部位的瘤組織，PBS（0.01 mol·L^-1，pH 7.0～7.2）沖洗3次，同組標本混合。將組織充分剪碎，加入100 μL膠原酶消化（37 ℃，30 min），過濾。加1 mL PBS，混勻，過濾，離心洗滌2遍（2 000 r·min^-1，5 min），計數。取1×10⁶個細胞，加入5 μL FITC M-H P-gp抗體，避光，4 ℃孵育30 min。加1 mL PBS洗滌（2 000 r·min^-1，5 min），上機檢測。

2.5 RT-PCR檢測MDR1 mRNA表達 剪取1 g中心部位的瘤組織，PBS沖洗3次，同組標本混合。用Trizol法提取移植瘤總RNA，然后按第一鏈合成試劑盒逆轉錄為cDNA。將得到的cDNA模板用去離子水稀釋5～10倍后用于Real-time PCR，反應體系50 μL（PCR Master Mix 25 μL，Forward Primer 2 μL，Reverse Primer 2 μL，Template cDNA 1 μL，PCR Enhancer 10 μL，RNase-Free Water up to 10 μL）；反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃終延伸5 min。設β-actin為管家基因，同時檢測。

2.6 Western blot法檢測PI3K蛋白 剪取1 g中心部位的瘤組織，加1 mL液氮研磨，200 μL蛋白裂解液，吹打混勻，取上清總蛋白，采用BCA方法測蛋白濃度。樣本煮沸轉移蛋白至PVDF，0.5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，分別加入一抗40 ℃孵育過夜，0.1% TEST洗膜3次，室溫孵育加入二抗1 h，TBST洗膜3次，加ECL發光劑后顯影。

2.7 Elisa法檢測NF-κB含量 剪取1 g中心部位的瘤組織，預冷研磨，5 000×g離心5 min，留取上清。嚴格按照試劑盒說明書步驟，在酶標板分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔，依次加A液、B液。終止反應后用酶標儀在450 nm 波長測量各孔的吸光度（A），通過標準曲線計算NF-κB濃度。

2.8 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計量資料用±s表示，先行方差齊性檢驗和正態性檢驗，再行組間均數F檢驗，檢驗水準α=0.05。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 K562/A02干細胞耐藥性 對數生長期K562/A02細胞，流式細胞儀檢測CD34⁺CD38^-細胞占31.5%，見圖1a，經免疫磁珠分選后CD34⁺CD38^-細胞比例為92.8%，見圖1b，分選后K562/A02細胞干性顯著性提高。

3.2 BALB/c小鼠成模情況 BALB/c小鼠接種K562/A02細胞21 d后，正常組無白血病表現，其他各組100%出現不同程度白血病表現：消瘦、弓背癥狀、皮下包塊。檢測小鼠骨髓單個核細胞中CD34⁺CD117⁺表達23.4%，小鼠腫瘤包塊細胞耐ADM的IC₅₀為（25.32±10.77）mg·L^-1，耐藥指數17.83。小鼠肝臟腫大，肝內均出現炎癥壞死，見圖2。

3.3 P-gp檢測LSC細胞膜上P-gp表達 給藥后，BALB/c小鼠瘤塊細胞膜上P-gp表達比較見表1，圖3，與模型組比較，ADM+PESV高、中、低劑量組P-gp降低，差異有統計學意義（P<0.05）；分別與ADM組和PESV組比較，ADM+PESV高劑量組P-gp均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。

3.4 多藥耐藥基因MDR1 mRNA表達情況 本次相對定量RT-PCR檢測將各組2^-ΔΔCt測定值相對模型組的結果比較，設2^-ΔΔCt測定值≥5的定為高表達標準。測得K562/A02干細胞的MDR1 mRNA基因表達量PESV組>低劑量組>高劑量組>中劑量組>ADM組，其中PESV組、中劑量組、低劑量組高表達，見表2。

3.5 BALB/c小鼠瘤塊細胞PI3K蛋白水平 PI3K蛋白在ADM組、PESV組表達上調，在ADM+PESV組表達下調，下調強度從高到低依次為高劑量組>中劑量組>低劑量組，見圖4。

3.6 BALB/c小鼠瘤塊細胞NF-κB因子水平比較 標準曲線：使用專業制作曲線軟件curve expert 1.30進行分析，以標準品的濃度為縱坐標（Y），A為橫坐標（X），依據回歸方程R²繪出標準曲線。用標準物的濃度與A計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的A代入方程式，計算出樣品濃度。R²=0.999 6，繪制標準曲線為Y=25.992X-0.189 8。根據標準曲線求出NF-κB分析結果，與模型組比較，PESV組、ADM+PESV高劑量組NF-κB水平下調，差異有統計學意義（P<0.05）；ADM組及ADM+PESV中、低劑量組NF-κB水平比較，差異無統計學意義；與ADM組和PESV組比較，ADM+PESV高劑量組NF-κB水平均下調，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

4 討論

目前研究表明白血病化療緩解率低、短期內復發是因為白血病細胞對化療藥物不敏感，尤其白血病細胞產生MDR阻礙了化療治愈白血病。盡管MDR機制極其復雜[9]，但P-gp是 MDR效應的終末活性主要蛋白，編碼在人類MDR1基因，MDR1 cDNA位于人類7號染色體的q21.1帶上，編碼4.5～5.0 kb mRNA，長4 669 bp，其第179～3 840 bp為可讀區，起始密碼為ATG，共編碼1 280個氨基酸殘基，經折疊修飾后形成定位于細胞質和高爾基體的P-gp[10]。兩者是P-gp轉運藥物的重要場所，整個分子由幾乎完全相同的2個亞基構成，每部分具有6個跨膜區和1個ATP結合位點，構成ABC超家族中P-gp藥物泵降低細胞內化療藥物濃度[11]。白血病細胞表面的酪氨酸蛋白激酶受體（receptor tyrosine kinases，RTK）通過接收胞外多種生長因子如胰島素（insulin）、成纖維細胞生長因子（FGF）、人生長因子（HGF）、血管內皮生長因子（VEGF） 等配體信號刺激而被激活，激活的RTK通過PI3K將信號傳遞到細胞內激活AKT。AKT屬于PI3K重要的下游分子，包括AKT1，AKT2和AKT3至少3種形式[12]，其中AKT1促進細胞增殖和存活；AKT2參與胰島素調節的糖類物質代謝；AKT3則對細胞的數目以及大小起著關鍵的調節作用。ATK激活IκB激酶（IKKα）進而導致NF-κB的抑制劑IκB的降解，使NF-κB從細胞質中釋放出來進行核轉位，NF-κB與MDR1基因啟動子結合，MDR1的DNA完成mRNA轉錄，這樣白血病MDR的PI3K/NF-κB/MDR1細胞信號通路激活。

PESV是蝎毒多肽提取物的簡稱，是由蝎毒凍干粉經葡聚糖凝膠，收集蝎毒Ⅲ～Ⅳ蛋白峰，再進行陽離子交換色譜而成。PESV組分Ⅲ通過下調bcl-2基因和激活caspase-3途徑促進人肝癌細胞株Hep G2的凋亡[13]，PESV組分Ⅳ作用及機制尚未明確。實驗中發現PESV和ADM能夠獨立同步上調上游信號通路中PI3-K蛋白、NF-κB因子、MDR1 mRNA表達；當PESV和ADM聯合應用時能夠同步下調上游信號通路中PI3-K蛋白、NF-κB因子、MDR1 mRNA表達，表達水平與PESV劑量呈正相關；提示了PESV對ADM作用后的白血病細胞的PI3-K蛋白、NF-κB因子、MDR1 mRNA表達具有下調作用，換而言之，PESV提高白血病細胞對ADM的敏感性，或是PESV逆轉白血病細胞的MDR。大黃蟄蟲丸含藥血清可能通過抑制PI3K/AKT信號通路激活實現了對白血病K562細胞抑制的增殖，誘導凋亡且將細胞阻滯于G0/G₁期，呈濃度依賴性[14]。植物雌激素毛蕊異黃酮處理T24細胞后，P-Akt/Akt比值下降，提示毛蕊異黃酮可以抑制PI3K/Akt通路的活性，當采用不同濃度毛蕊異黃酮作用時P-Akt/Akt比值下降顯著性差異 [15]。本研究與以上學者的研究結果是一致的，但多藥耐藥信號通路PI3K/NF-κB/MDR1所涉及細胞因子多，蛋白磷酸化、基因甲基化等方面細節尚需進一步研究探討。

[參考文獻]

[1] Mattern J，Volm M. Multiple pathway drug-resistance（review）[J]. Int J Oncol，1993，2（4）：557.

[2] O saki M，O shinura M，Ito H. P13K-Akt pathway its functions and alterations in human cancer[J].Apoptosis，2004，9（6）：667.

[3] Juliano R L，Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants[J].Biochem Biophys Acta，1976，455（1）：152.

[4] 楊向東，李紅玉，李德冠，等. 蝎毒多肽對白血病細胞株KG1a干細胞活性的影響[J].中華中醫藥雜志，2015，30（4）：101.

[5] 成志勇，李琳，王亞麗，等.PTEN基因逆轉白血病多因素多藥耐藥機制探討[J].第二軍醫大學學報，2013，34（2）：142.

[6] 欒鳳君，楊純正，馬建國，等.一株人紅白血病多藥耐藥細胞系（K562/AO2）的建立及其耐藥特性的研究[J].中華腫瘤雜志，1993，15：101.

[7] 郝征，楊文華.蝎毒多膚干預急性白血病髓外浸潤傳變的機制[J].中華中醫藥雜志，2012，27（4）：1106.

[8] Xu Yan，Zhi Feng，Xu Guangming，et al. Overcoming multidrug-resistance in vitro and in vivo using the novel P-glycoprotein inhibitor1416[J]. Biosci Rep，2012（32）： 559.

[9] Zunino S J，Storms D H，Ducore J M.Novel in vivo model of inducible multi-drug resistance in acute lymphoblastic leukemia with chromosomal translocation t（4；11）[J].Cancer Lett，2010，296（1）：49.

[10] Perrin L，Gatouillat G，Balasse E，et al. lnduction of autoantibodies to murine P-glycoprotein： consequences on drug sensitivity in MDR cancer cells and on the expression of MDR genes[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，358（1）：325.

[11] Tian K，Wang Y，Huang Y. Methylation of WTH3，a possible drug resistant gene，inhibits p53 regulated expression[J].BMC Cancer，2008，8：327.

[12] Mackay H J，Eisenhauer E A，Kamel-Reid S，et al. Molecular determinantks of outcome with mammalian target of rapamycin inhibition in endometrial cancer[J]. Cancer，2013，25（3）：123.

[13] 李建偉，胡靜，張桂榮，等. 東亞鉗蝎蝎毒多肽組分Ⅲ對肝癌細胞凋亡的影響[J].吉林大學學報，2006，32（4）：625.

[14] 秦寶寧，滕文靜，劉瑞娟，等.大黃蟄蟲丸對慢性粒細胞白血病K562細胞增殖凋亡及PI3K/AKT信號傳導通路的影響[J].時珍國醫國藥，2015，26（3）：522.

[15] 辛敏，陳健，郭艷紅. 毛蕊異黃酮對膀胱癌細胞凋亡和PI3K/Akt信號通路的影響[J].廣東醫學，2015，36（5）：690.

[責任編輯 馬超一]