豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的檢測技術(shù)

陳曉輝+薛梅+朱俊平

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，常與其他病原混合感染，臨床診斷非常困難，要確診需要進行實驗室檢測。而及時診斷是防控PRRS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從抗體的檢測和病原的檢測兩個方面對PRRS的檢測技術(shù)進行了簡要綜述，旨在為診斷PRRS提供指導。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；抗體檢測；病原檢測

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼： 文章編號：1007-273X（2016）12-0009-02

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。以妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙及各年齡階段豬的呼吸道癥狀為特征[1-3]。該病毒具有抗原變異性、嗜巨噬細胞性、持續(xù)感染性及抗體依賴增強性作用，臨床上常與其他病原混合感染使臨床表現(xiàn)形式復雜化[4-5]。要確診需要進行實驗室檢測，實驗室檢測方法很多，每種方法在檢測的特異性、敏感性、成本等方面存在差異。因此，建立有效且適合基層使用的PRRS檢測方法是防控PRRS的重要環(huán)節(jié)，本文就PRRS檢測方法進行了綜述，供參考。

1 抗體的檢測

免疫熒光抗體（IFA）試驗、免疫過氧化酶單層細胞試驗（IPMA）、血清中和（SVN）試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等都可用于檢測PRRSV的特異性抗體，通過檢測抗體水平可以對豬個體或整個豬群的PRRSV感染狀況或疫苗免疫效果給予一定的評價。

1.1 PRRSV抗體檢出時間及維持時間

當豬感染PRRSV 7～14 d后，機體首先產(chǎn)生IgG抗體，機體產(chǎn)生的抗體隨著時間的積累呈增加的趨勢，當抗體達到峰值后在體內(nèi)維持一段時間，然后抗體水平逐漸下降，不同檢測方法檢測出的抗體出現(xiàn)峰值時間、峰值維持時間以及抗體在體內(nèi)存留時間均不一致。在試驗感染條件下，通過IgG-IFA、IPMA、ELISA、SVN方法可分別在感染后5～9、9～11、9～13、9～28 d內(nèi)檢測到抗體。PRRSV特異性IgM抗體在接種后5 d可以檢測到，并可持續(xù)21～28 d。不同的方法檢測出的抗體峰值時間各不相同：IFA 30～50 d、IPMA 35～50 d、ELISA 30～50 d、SVN 60～90 d，隨后抗體滴度逐漸下降。感染PRRSV后用各種方法檢測的抗體消失時間為： IFA 4～5個月、ELISA 4～10個月以上、IPMA 11～12個月、SVN12個月[6-8]。疫苗免疫后各種方法的檢測結(jié)果與上述時間段基本一致。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA適于大規(guī)模檢測，方便、易行，操作過程及結(jié)果判斷能夠標準化，且具有高度的特異性和敏感性，以間接ELISA和阻斷ELISA常見[6-8]。利用ELISA檢測血清中PRRSV抗體出現(xiàn)的時間與用IPMA和IFA檢測抗體出現(xiàn)時間基本相同，但是血清中PRRSV抗體持續(xù)時間明顯長于IPMA和IFA所檢測出的抗體維持時間，檢出時間長達1年左右。

ELISA診斷抗原有2種，一種是從細胞培養(yǎng)物中純化的全病毒抗原，另一種是重組的PRRSV核衣殼蛋白。無論是用全病毒還是用基因表達產(chǎn)物作為診斷抗原建立的ELISA，均具有較強的背景反應。IDEXX公司生產(chǎn)的PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒在全球范圍內(nèi)推廣使用，曾被認為是PRRSV抗體檢測的金標準。但不久通過對照試驗對該試劑盒檢測效果進行評價，發(fā)現(xiàn)IDEXX試劑盒存在假陽性結(jié)果，PRRSV全病毒抗原間接ELISA與IDEXX HerdChek ELISA試劑盒相比，前者特異性僅為26.6%，敏感性也僅為48.8%。如果該方法應用于實際生產(chǎn)中，將會對PRRS的凈化以及后備種豬的篩選帶來嚴重后果。因此，在ELISA試劑盒研制上還需要廣大從事ELISA試劑盒研制的人員做出更大的努力來彌補現(xiàn)有試劑盒的不足之處，進一步完善中國ELISA診斷試劑盒標準[8-10]。

1.3 免疫過氧化酶單層細胞試驗（IPMA）

IPMA是廣泛用于該病診斷的一種方法，其敏感性和特異性都較好，可用于PRRSV的血清抗體檢測、病毒鑒定及抗原檢測。自1991年建立至今，仍是歐洲和美洲國家廣泛使用的血清學診斷方法。利用IPMA和商品化的PRRSV ELISA試劑盒檢測抗體，并進行比較，發(fā)現(xiàn)利用同源性抗原檢測抗體，IPMA比ELISA試劑盒檢測出抗體的時間提前2～3 d，特別是對母源抗體的靈敏度更高，然而ELISA卻能在不損失特異性的基礎(chǔ)上提高敏感性，所以相比之下，ELISA更適合用來診斷PRRSV。由于IPMA結(jié)果判定具有一定主觀性，不能自動顯示，同時費時，檢測費用高，不適合大規(guī)模檢測，因此在實際生產(chǎn)中未得到廣泛應用[9，10]。

1.4 免疫熒光抗體（IFA）試驗

IFA法在美國被廣泛利用，該法需進行細胞培養(yǎng)、熒光鏡檢，結(jié)果借助肉眼來觀察，因?qū)嶒炇也僮鞣椒ǖ牟煌⒓夹g(shù)人員的不同和非特異性熒光等原因產(chǎn)生較大的主觀性。對IFA和ELISA方法進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者具有很高的符合率，不符合的原因可能是血清抗體的水平太低。ELISA可以檢測抗體滴度比較低的血清，而用IFA則檢測不到，由此造成假陰性結(jié)果。

利用間接熒光抗體試驗對試驗感染PRRSV的豬的抗體進行檢測，結(jié)果表明，在感染病毒后9～14 d，首先檢測出IgG抗體，高滴度的IgG抗體可以維持7周；感染病毒后35 d再次接種PRRSV，體內(nèi)IgG抗體滴度不發(fā)生變化，病毒血癥仍可檢測到。在接種5～28 d可以檢測到IgM抗體，35 d后再次接種病毒其抗體在短時間內(nèi)增加。利用熒光抗體試驗在不同時間對IgM抗體水平進行檢測，在短時間內(nèi)有助于鑒別是否感染PRRSV。因此，在實際生產(chǎn)過程中要盡可能避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，在條件允許情況下結(jié)合其他檢測結(jié)果得出結(jié)論[9-11]。

血清中和試驗與IFA和ELISA相比，其敏感性低，原因可能是由于PRRSV特異的中和抗體出現(xiàn)比較晚，要在感染后30～60 d才能檢測到。對于急性感染的敏感性更差，與其他檢測方法的結(jié)果符合率低，達不到早期診斷的目的。因此，該方法不適合應用于實際生產(chǎn)中，僅限于實驗室診斷[10-12]。

血清學呈陽性的結(jié)果并不能確定PRRSV是否能引起臨床發(fā)病，也不能區(qū)別是感染野毒還是疫苗毒，也不能說明動物機體是否為病毒的攜帶者，僅能說明曾經(jīng)感染過PRRSV。對于血清學陰性可能是未感染PRRSV或感染但還未產(chǎn)生抗體，或以前感染過但現(xiàn)在血清轉(zhuǎn)陰，或是檢測方法的敏感性不夠或操作誤差。因此，現(xiàn)有的血清學方法不適合監(jiān)測整個豬群的群體情況，其僅能對單個個體作出初步診斷，要作出更準確的診斷，還應與免疫狀況或病毒分離或抗原的檢測相結(jié)合，才能達到對PRRS診斷、疫情凈化的目的[10-12]。

2 病原的檢測

病原的檢測主要包括免疫學檢測以及生物學檢測，其中免疫學檢測包括免疫熒光染色法、免疫過氧化物酶染色法以及免疫膠體金技術(shù)等，而生物學檢測主要進行病毒的分離；核酸的檢測主要利用分子生物學技術(shù)對病毒特定的基因組進行檢測。由于免疫學檢測存在較大的弊端，下面僅對生物學檢測以及核酸檢測技術(shù)作一簡單的概述。

2.1 生物學檢測—病毒的分離

用于PRRSV分離的細胞有原代豬肺巨噬細胞（PAM）、傳代細胞系CL2621和Marc145。其中PAM最常用，因為傳代細胞系對該病毒易感性差，故不能完全代替PAM，而且由于不是每批巨噬細胞對病毒的易感性都相同，所以在用PAM進行分離病毒前，還要進行批次試驗，只有當特定滴度的標準病毒在新的巨噬細胞中生長良好時，方可使用，該方法是診斷PRRSV感染的經(jīng)典方法，多用于急性病例的確診和新疫區(qū)的確定，但是也存在不足之處，如費用較高、勞動強度較大，耗時多，且有可能污染其他病毒等，因此該方法不利于大規(guī)模豬場疫病的檢測[10-12]。

2.2 核酸檢測（反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應）

核酸檢測（反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應）反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（Reverse transcription polymer-ase chain reaction， RT-PCR）廣泛應用于PRRSV的鑒定及臨床診斷，并在方法上不斷改進和提高，擴增的目的片段也主要是針對PRRSV的核衣殼蛋白基因，主要的原因是PRRSV基因組中ORF7編碼的核衣殼蛋白（N蛋白）中包括所有毒株都保守的共同表位和區(qū)別于歐洲型的特異性決定簇。RT-PCR比病毒分離更省時、省力，敏感性和特異性更強。用于RT-PCR檢測的樣品包括血清、精液及肺臟、脾臟等組織[13-15]。

利用RT-PCR對試驗感染豬進行抗原和抗體檢測，并與病毒分離和ELISA抗體檢測結(jié)果進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法可以在感染24 h后檢測到病毒的核酸，但不能分離到病毒，而抗體只能在感染后第9d檢測到，由此可見RT-PCR的靈敏度明顯高于病毒分離和ELISA，有利于早期診斷[13-15]。

PCR方法可以區(qū)分歐洲株與美洲株，但其臨床應用意義并不大。國外應用PCR診斷PRRSV已取得很大進展，許多學者根據(jù)PRRSV不同的ORF序列，設(shè)計了不同引物，建立了檢測PRRSV核酸的RT-PCR方法。隨著RT-PCR技術(shù)的發(fā)展，也陸續(xù)出現(xiàn)了熒光標記的RT-PCR方法，如采用TaqManTMRT-PCR或分子信標RT-PCR方法檢測臨床樣品，這些方法比常規(guī)RT-PCR方法的特異性更強，敏感性更高，但需要更高的成本。應特別注意的是，因其敏感性特別高，易引起假陽性，因此在檢測時應盡可能避免RNA的污染。RT-PCR方法在PRRS的診斷及監(jiān)測中發(fā)揮很大作用，在ELISA檢測為陽性的基礎(chǔ)上，再用高敏感性的RT-PCR進行確診，這不僅可以降低費用，而且可拓寬RT-PCR的應用前景，如后備種豬的篩選，持續(xù)性感染豬的診斷及豬群的凈化等[13-15]。

參考文獻：

[1] 陳溥言.家畜傳染病學[M].第五版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[2] WENSVOORT G，TERPST RA C，POL J M. Mystery swine disease in the Netherlands： the isolation of Lelystad virus[J].Vet Q，1991，13（3）：121-130.

[3] 蔡寶樣.豬繁殖與呼吸綜合征病毒最新研究進展[J].中國畜禽傳染病，1998（8）：18-20.

[4] 吳加強，姜 平.豬繁殖與呼吸綜合征[J].畜牧與獸醫(yī)，1999 （S1）：42-46.

[5] 楊漢春.我國豬繁殖與呼吸綜合征的流行現(xiàn)狀與控制對策動態(tài)[J].當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2003（4）：43-46.

[6] 孟令偉，孫穎杰.豬藍耳病的幾種血清學診斷方法[J].中國動物檢疫，1995（2）：14-15.

[7] 楊小燕，李曉華，沈紹新.豬繁殖與呼吸綜合征的血清學調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志，2001（4）：17-18.

[8] 溫振標，湯瑞珍.豬繁殖與呼吸綜合征血清學調(diào)查報告[J].廣西畜牧獸醫(yī)，1999，15（5）：28-29.

[9] 陸文俊，黃 夏，趙國明，等.廣西豬繁殖與呼吸綜合征血清學調(diào)查[J].中國動物檢疫，2002（3）：29-30.

[10] （美）B.E.斯特勞，（加）S.D.阿萊爾，（美）W.L.蒙加林，等.豬病學[M].第八版.趙明德，張仲秋，沈建忠，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2003.

[11] KRISTENSEN C S，BOTNER A，TAKAI H，et al. Experilnental airborne transmission of PRRS virus[J].Vet Microbiol，2004，99：197-202.

[12] 陳繼明.重大動物疫病監(jiān)測指南[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2008.

[13] 童光志，周艷君，郝曉芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（5）：323-327.

[14] 涂宜強，楊增歧，徐 輝.RT-PCR檢測豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒方法的建立與應用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2005，32（6）：52-53.

[15] 婁高明，杜偉賢，謝明權(quán)，等.豬繁殖與呼吸綜合征RT-PCR診斷方法的建立[J].中國獸醫(yī)學報，2000，20（2）：141-144.