血凝（HA）—血凝抑制（HI）試驗操作要點

黃艷羚+孫淑蘭

摘要：獸醫實驗室檢測禽流感和雞新城疫抗體采用血凝（HA）-血凝抑制（HI）試驗。該試驗有些因素會影響試驗結果，是試驗的關鍵環節，如配制1%雞紅細胞時其濃度的高低會影響抗體滴度的高低；4單位抗原的配制需要回滴正確；試驗的反應時間和溫度也要符合要求。只有掌握好試驗的關鍵點，才能得出準確無誤的試驗結果。對該試驗的操作要點及注意事項進行了介紹。

關鍵詞：禽流感抗體檢測；雞新城疫抗體抗體檢測；血凝（HA）-血凝抑制（HI）試驗；操作要點

中圖分類號：S851.3 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2016）12-0022-01

實驗室檢測禽流感及雞新城疫抗體滴度采用血凝（HA）—血凝抑制（HI）試驗，是利用了禽流感病毒、雞新城疫病毒的血凝素能凝集雞紅細胞的特性。現將HA-HI試驗操作步驟及注意事項介紹如下，供參考。

1 試劑配制

1.1 阿氏液配制

稱量葡萄糖2.05 g、檸檬酸鈉0.80 g，檸檬酸0.055 g、氯化鈉0.42 g，加蒸餾水至100 mL，加熱溶解后調pH至6.1，高壓滅菌，4 ℃保存備用。

1.2 1%雞紅細胞液的制備

因為每只雞的血紅細胞的結合性不一樣，所以要取3～4只公雞血，要求是SPF雞，每3個月換一次雞。采血與等量阿氏液混合均勻，放入離心管中。雞紅細胞的洗滌：將離心管中的血液經2 500 r/min離心5 min，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，再重復2次以上過程后，用生理鹽水配成1%紅細胞懸液，4 ℃保存備用，不超過5 d。離心的時間、轉速不一樣，紅血球壓積不一樣。紅血球濃度低，檢測出的抗體效價就低，反應時間變長。紅血球濃度高，檢測出的抗體效價就高，會偏離正常值。轉速不能超過3 000 r/min，不然紅細胞易破碎。洗紅血球時需要用和稀釋液一樣的液體。

2 操作步驟

2.1 抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）

在一次性微量反應板的1～12孔均加入25 μL的生理鹽水，吸取25 μL抗原加入第一孔，混勻。從第一孔倍比稀釋至第11孔，從第11孔棄25 μL，每孔再加入25 μL生理鹽水，每孔均加入25 μL 1%雞紅細胞懸液，振蕩混勻，室溫，25 min觀察結果，使紅細胞完全凝集的抗原最高稀釋度為1個血凝單位。

2.2 血凝抑制（HI）試驗（微量法）

4單位抗原配制：終點稀釋倍數除以4即為含4 HAU的抗原的稀釋倍數。4單位抗原在使用前最好做回滴試驗，以確保配制的抗原正好為4單位抗原。具體操作方法如下：在微量反應板的1～6孔均加入25 μL生理鹽水，吸取25 μL配好的4單位抗原，分別加入第1孔和第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第5孔，從第5孔棄25 μL，2～6孔再加入25 μL生理鹽水，1～6孔均加入25 μL1%雞紅細胞懸液，室溫靜置30 min，判斷結果。將板傾斜，1～3孔紅細胞全部凝集，第4孔顯淚滴狀流淌，則配液正確。調整抗原濃度，直到回滴正確。配好的抗原使用時間不超過4 h。4單位抗原配制是否正確，對試驗結果影響很大。抗原-20 ℃保存，用時恢復至室溫。抗原應分裝，避免反復凍融，否則會降低效價。

在微量反應板的第1～11孔加入25 μL生理鹽水，第12孔加入50 μL生理鹽水。吸取25 μL待檢血清加入第1孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 μL棄去。第1～11孔均加入4HAU混勻的抗原液25 μL，室溫靜置30 min，每孔加入25 μL 1%的雞紅細胞懸液，混勻，室溫靜置30 min。結果判定：以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于2log2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結果才有效。HI效價≤3log2判定HI試驗陰性，HI效價=4log2為可疑，HI效價≥5log2為陽性。

注意，稀釋液的pH應在7.0～7.2，pH低時，看不見效價，pH大于7.8時，容易溶脫。反應時，室溫高于37 ℃時，血細胞易脫落，4 ℃以下會自凝。溫度24～25 ℃反應效果最好。稀釋溶液時，用10～100 μL量程多道移液器，每孔反復吹吸6次，動作應均勻一致。常用96孔V型板，一次性微量反應板，沉降快，清晰、易判。用雞紅細胞檢測鴨血清時，會出現非特異性凝集，最好用同源動物紅血球。