禽腺病毒Ⅰ群分離、鑒定方法

楊作豐

摘要：禽腺病毒Ⅰ群（FAV-Ⅰ）是一種雙鏈DNA病毒，病毒對(duì)外界環(huán)境耐受較強(qiáng)，并有水平傳播及垂直傳播兩種傳播方式，近年來在國內(nèi)呈暴發(fā)式流行，各地養(yǎng)殖場均有報(bào)道檢測到FAV-Ⅰ，F(xiàn)AV-Ⅰ對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。分離、鑒定FAV-Ⅰ的毒株類型是防控此病的基礎(chǔ)。除傳統(tǒng)的檢測方法外，近年新興了多種檢測技術(shù)，對(duì)這些分離、鑒定方法進(jìn)行了概述。

關(guān)鍵詞：禽腺病毒Ⅰ群；分離；鑒定

中圖分類號(hào)：S858.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2017）02-0005-03

近年來禽腺病毒病在我國發(fā)病率日益升高，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。感染禽腺病毒的家禽21 d內(nèi)死亡率高達(dá)30%，禽腺病毒病的防治成為迫要需要解決的問題[1]。禽腺病毒是一種DNA病毒，能夠引起雞群禽腺病毒感染，是一種亞臨床性傳染病，感染雞群通常為癥狀不明顯的隱性感染，并長期帶毒[2]。根據(jù)病毒群特異性抗原的不同將其分為三群：禽腺病毒Ⅰ群（FAV-Ⅰ）、禽腺病毒Ⅱ群、禽腺病毒Ⅲ群。FAV-Ⅰ主要包括傳統(tǒng)的腺病毒以及從其他禽類分離出的腺病毒分離株，這些腺病毒毒株具有相同的抗原群；禽腺病毒Ⅱ群主要是包括火雞出血性腸炎及雞大脾病毒，這些病毒具有和FAV-Ⅰ不同的抗原群；禽腺病毒Ⅲ群主要是產(chǎn)蛋綜合征相關(guān)的病毒。

據(jù)報(bào)道FAV-Ⅰ能引起心包涵體炎、心包積水-肝炎綜合征等傳染病[3]。FAV-Ⅰ病毒可分為A、B、C、D、E、F五個(gè)種和12個(gè)血清型[4]。禽腺病毒的潛伏期較短，雞日齡越小越易感染FAV-Ⅰ，成年雞也可感染，通常沒有明顯癥狀但是能夠作為混合感染時(shí)的條件性病原，在一定條件下部分禽腺病毒也能夠作為原發(fā)性病原，引發(fā)禽類的多種病癥[5]。禽腺病毒能夠通過雞的排泄物排出，正常雞接觸后極易感染，并且禽腺病毒還能通過蛋垂直傳播。報(bào)道稱FAV-Ⅰ對(duì)宿主具有高度的特異性，只有少數(shù)的病毒能夠感染宿主以外的動(dòng)物。FAV-Ⅰ對(duì)外界環(huán)境的耐受較強(qiáng)，在室溫中依然能夠維持毒價(jià)長達(dá)半年，對(duì)酸和熱的耐受也很強(qiáng)，因此其經(jīng)過動(dòng)物胃腸道依然可以保持活性，這使得其危害更加嚴(yán)重[6-7]。因此FAV-Ⅰ病毒群的分離、鑒定更具有指導(dǎo)意義，本文對(duì)常用的FAV-Ⅰ分離、鑒定方法進(jìn)行了概述。

1 分離方法

禽腺病毒的分離通常是通過接種SPF雞胚來分離、增殖。接種位置有兩種，分別是卵黃囊接種及絨毛尿囊膜接種，接種雞胚后病變主要出現(xiàn)在肝臟部位，肝臟呈重度充血、出血及嚴(yán)重的彌漫性變性、壞死。卵黃囊、腎臟、脾臟也有一定的變性、壞死[8]。

1.1 病料直接分離法

無菌操作取發(fā)病雞肝臟，按照1∶5（W/V）的比例加入滅菌后的生理鹽水，于操作臺(tái)中研磨，生理鹽水中預(yù)先加入雙抗（青霉素2 000 U/mL；鏈霉素2 000 μg/mL）。充分研磨后，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心20 min后取上清液，經(jīng)0.22 μm的濾器過濾除菌，過濾液經(jīng)無菌檢驗(yàn)后，卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，每日照蛋兩次，棄掉3 d內(nèi)死掉的雞胚，收獲4～10 d死亡的雞胚的尿囊液，盲傳檢驗(yàn)所收獲病毒液，合格后冷凍保存。

1.2 棉拭子分離法

取病雞口腔及肛門拭子，用適量的生理鹽水浸泡拭子2 h，充分浸泡棉拭子后，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾器除菌，經(jīng)無菌檢驗(yàn)后卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，每日照蛋兩次，棄掉3 d內(nèi)死掉的雞胚，收獲4～10 d死亡的雞胚的尿囊液，盲傳檢驗(yàn)所收獲病毒液，合格后冷凍保存。

2 鑒定方法

禽腺病毒的鑒定方法有很多種，分別為免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、電子顯微鏡法、PCR反應(yīng)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）鑒定、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)（CPA）等，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)實(shí)際要求選擇合適的方法進(jìn)行鑒定，現(xiàn)對(duì)其中幾種實(shí)驗(yàn)室常用方法進(jìn)行概述。

2.1 免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

根據(jù)沉淀試驗(yàn)原理，抗原、抗體在瓊脂中擴(kuò)散，相遇后可結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，外觀呈一條白色沉淀線。應(yīng)用免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定FAV-Ⅰ病毒是一種血清學(xué)診斷技術(shù)，該方法具有操作簡便、快捷、靈敏度高等特點(diǎn)，將病毒分離、純化，用作免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的抗原，稱取一定量的瓊脂粉，按照1%濃度加入生理鹽水，加熱充分溶解，將溶解的瓊脂溶液倒入平皿中，冷卻，選擇合適打孔器進(jìn)行打孔，挑出孔內(nèi)瓊脂，小心加熱平皿底部使孔底瓊脂融化少許，起到封底的作用。加入陽性血清和所制備的抗原，倒置放置在濕盤中，37 ℃自由擴(kuò)散24～48 h觀察結(jié)果，看是否觀察到白線，如果有則證明此抗原是FAV-Ⅰ[9]。

2.2 電鏡檢測鑒定

根據(jù)腺病毒的特征形態(tài)，該病毒為球形、無囊膜、二十面體對(duì)稱、直徑約為80 nm。可以直接用電子顯微鏡觀察病毒形態(tài)，看是否吻合進(jìn)行初步確定。也有報(bào)道稱禽腺病毒可以用電鏡負(fù)染法鑒定，用適量的水重懸病毒粒子，在載玻片上以1%磷鎢酸負(fù)染30 s，包埋于200目聚乙烯醇縮甲醛銅網(wǎng)上，用電子顯微鏡觀察病毒粒子形態(tài)，看是否與禽腺病毒吻合[10]。

2.3 PCR方法鑒定

FAV-Ⅰ能夠在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生嗜堿性包涵體，其結(jié)構(gòu)蛋白主要是Hexon蛋白，含有特異性抗原決定簇，能夠中和抗體，是病毒的一種保護(hù)基因，與病毒的致病性密切相關(guān)[11]。FAV-Ⅰ病毒有12個(gè)血清型，其中最具有代表性的病毒為雞胚致死孤兒病毒（CELOV），許多學(xué)者應(yīng)用PCR鑒定時(shí)會(huì)選擇Hexon基因或CELOV的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[12]。也有報(bào)道根據(jù)Hexon loop1基因及特意纖維蛋白原基因的同源性分析，可以將不同種的腺病毒進(jìn)行進(jìn)一步的分離鑒定，分析各種毒株的親緣性關(guān)系，對(duì)疾病的防控起到了積極作用[13]。

PCR方法鑒定是常用的檢測手段，根據(jù)GenBank中公布的病毒的全基因組序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。無菌取病雞內(nèi)臟研磨，將研磨液8 000 r/min離心后取上清液，提取其中的病毒DNA作為模板，加入酶、引物等。瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有目的條帶。用瓊脂凝膠回收試劑盒將目的條帶回收純化，測序。將測序結(jié)果用NCBI中的Nuclear acid blasting進(jìn)行序列比對(duì)，確定是否為FAV-Ⅰ感染[14]。

也有研究[14]將套式PCR應(yīng)用到鑒定中，套式PCR具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、高效等特點(diǎn)。方法是根據(jù)GenBank中FAV-Ⅰ病毒的基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，第一對(duì)引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似，第二對(duì)引物（巢氏引物）應(yīng)在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部。這樣經(jīng)過兩次PCR反應(yīng)后，根據(jù)目的條帶判斷所檢測病毒是否為FAV-Ⅰ病毒。

2.4 ELISA方法鑒定

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是在不影響酶活性的條件下，令酶分子與免疫球蛋白相結(jié)合，由標(biāo)記酶的放大作用，確保了ELISA反應(yīng)的靈敏性[15]。FAV-Ⅰ病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是六鄰體蛋白，是該病毒粒子中含量最高的一種蛋白，含有240個(gè)殼粒，占了FAV-Ⅰ病毒全部殼粒的90%以上。了解六鄰體衣殼蛋白特性具有非常大的研究價(jià)值，無論是滅活疫苗制備還是ELISA抗原蛋白的制備[16]。100 K蛋白、33 K蛋白是FAV-Ⅰ的非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染的過程中起到了關(guān)鍵的作用，并且在鑒定的時(shí)候這兩種蛋白具有更高的敏感性及特異性，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確[17]。羅絲絲[18]建立了一種簡便、快速的檢測FAV-Ⅰ抗體的間接ELISA方法，構(gòu)建pGEX-penton質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，誘導(dǎo)表達(dá)、純化。利用表達(dá)和純化產(chǎn)物作為抗原，同時(shí)優(yōu)化了反應(yīng)條件，成功建立FAV-Ⅰ間接penton-ELISA檢測方法。Junnu等[19]利用大腸桿菌表達(dá)純化禽腺病毒中的六鄰體蛋白而研究出一種新的、快速的ELISA檢測試劑盒。

2.5 LAMP鑒定方法

LAMP技術(shù)是一種新的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到多種病原微生物的檢測，如大腸桿菌、沙門氏菌、分枝桿菌、副溶血性弧菌等[20]。唐熠等[21]根據(jù)Ⅰ群禽腺病毒的Hexon基因的保守序列設(shè)計(jì)了一套特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，從而建立了一種適用于Ⅰ群禽腺病毒的LAMP快速的檢測手段，該方法簡便、快速、敏感性強(qiáng)、特異性高。

2.6 CPA鑒定方法

CPA是完全由中國優(yōu)思達(dá)公司獨(dú)立研發(fā)成功的一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，也是中國首個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，CPA與其他技術(shù)相結(jié)合是現(xiàn)在一個(gè)完整的快速分子檢測技術(shù)平臺(tái)，目前CPA對(duì)禽腺病毒檢測的應(yīng)用才剛剛開始，據(jù)報(bào)道稱CPA檢測禽腺病毒hexon基因已經(jīng)研發(fā)出來[22]，這將是比PCR技術(shù)更加快速、更加便宜的一項(xiàng)檢測技術(shù)。

3 展望

FAV-Ⅰ是近年危害較大的一種常見禽流行病，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失，引起畜牧工作者較多關(guān)注，越來越多的分離、鑒定方法被應(yīng)用到檢測FAV-Ⅰ上。除本文上述常規(guī)、成熟檢測方法外，多種快捷、簡便且精準(zhǔn)度更高的檢測方法，如I群腺病毒定向靶位檢測、腺病毒跨群定型檢測等也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。隨著對(duì)檢測方法的不斷深入研究，將為腺病毒檢測及綜合防控提供基礎(chǔ)保障。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZHAO J，ZHONG Q，ZHAO Y，et al. Correction： Pathogenicity and complete genome charanterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in China[J].Plos One，2016，11（8）： e0161744.

[2] ALVARADO I R， VILLEGAS P， ELATTRACHE J， et al. Genetic characterization， pathogenicity， and protection studies with an avian adenovirus isolate associated with inclusion body hepatitis[J]. Avian Diseases，2007，51（1）：27-32.

[3] 袁萬哲，李玉寶，王建昌，等.雞心包積液-肝炎綜合征的初步研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2016（2）：157-160.

[4] 趙 莉，周 潔，高 誠.禽腺病毒載體研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012（11）：99-103.

[5] 王 慧，程小果，郭建友，等.近期雞群Ⅰ群禽腺病毒的流行與防治[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2016（2）：62-63.

[6] 刁有祥.Ⅰ群禽腺病毒感染的流行情況與防控[J].北方牧業(yè)， 2016（10）：21.

[7] LI C，LI H，WANG D，et al.Characterization of fowl adenoviruses isolated between 2007 and 2014 in China[J].Veterinary Microbiology，2016，197：62-67.

[8] ALENMNESH W， HAIR-BEJO M， AINI I， et al. Pathogenicity of fowl adenovirus in specific pathogen free chicken embryos[J].Journal of Comparative Pathology，2012，146（2-3）：223-229.

[9] 智海東，解生亮，楊 志，等.禽腺病毒Ⅰ型瓊脂擴(kuò)散抗原的研制及應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2009（8）：718-722.

[10] 由 佳，朱應(yīng)民，李明舉.雞包涵體肝炎診斷及防治措施概述[J].山東畜牧獸醫(yī)，2016（7）：78-79.

[11] 牛登云，沈 元，王 蕊，等. 2015年我國Ⅰ群禽腺病毒分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國家禽，2016（9）：65-68.

[12] LI Y， FU J， CHANG S， et al. Isolution， identification， and hexon gene characterization of fowl adenoviruses from a contaminated live Newcastle diease virus vaccine[J]. Poultry Science，2016：pew405.

[13] SCHACHNER A，MAREK A，GRAFL B，et al. Setailed molecular analyses of the hexon loop-1 and fibers of fowl aviadenoviruses reveal new insights into the antigenic relationship and confirm that specific genotypes are involved in field outbreaks of inclusion body hepatitis[J]. Veterinary Microbiology，2016， 186：13-20.

[14] MITTAL D，JINDAL N，TIWARI A K，et al. Characterization of fowl adenoviruses associated with hydropericardiu syndrome and inclusion body hepatitis in broiler chickens[J]. Indian Journal of Virology，2014，25（1）：114-119.

[15] R R， Roy P. Recombinant hexon antigen based single serum dilution ELISA for rapid serlolgical profiling against fowl adenovirus causing hydropericardium syndrome in chickens[J]. Journal of Virological Methods，2014，207（10）：121-127.

[16] DAR A，TIPU M，TOWNSEND H，et al. Administration of Poly[di（sodium carboxylatoethylphenoxy）phosphazene]（PCEP） and avian beta defensin as adjuvants in inactivated inclusion body hepatitis virus and its hexon protein-based experimental vaccine formulations in chickens[J]. Avian Diseases，2015，59（4）：518-524.

[17] XIE Z，LUO S，F(xiàn)AN Q，et al. Detection of antibodies specific to the non-structural proteins of fowl adenoviruses in infected chickens but not in vaccinated chickens[J]. Avian Pathology，2013，42（5）：491-496.

[18] 羅絲絲. Ⅰ群腺病毒分離堅(jiān)定及重組蛋白ELISA鑒別診斷方法的研究[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2011.

[19] JUNNU S，LERTWATCHARASARAKUL P，JALA S，et al. Developing an indirect ELISA based on recombinant hexon protein for serological detection of inclusion body hepatitis in chickens[J].Journal of Veterinary Medical Science，2014，76（2）：289.

[20] 李志強(qiáng). LAMP技術(shù)在微生物檢測中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器，2009（7）：3-6.

[21] 唐 熠，謝芝勛，熊文婕，等.Ⅰ群禽腺病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2010（7）：713-716.

[22] NICZYPORUK J S，WOZNIAKOWSKI G，SAMOREKSALAMONOWICZ E. Application of cross-priming amplification（CPA） for detection of fowl adenovirus（FadV） strains[J]. Archives of Virology，2015，160（4）：1005-1013.