2015年河南省規(guī)模化奶牛場(chǎng)BHV-1感染情況調(diào)查

皇甫和平 ， 朱志超 ， 石冬梅 ， 王 巖 ， 宋予震，陳 益 ， 王 軍 ， 許文博 ， 王林康 ， 史靜柯 ， 李聰聰 ， 潘昊純

(1．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南鄭州450046 ； 2．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南鄭州450002)

2015年河南省規(guī)模化奶牛場(chǎng)BHV-1感染情況調(diào)查

皇甫和平1， 朱志超2， 石冬梅1， 王 巖1， 宋予震1，陳 益1， 王 軍1， 許文博1， 王林康1， 史靜柯1， 李聰聰1， 潘昊純1

(1．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南鄭州450046 ； 2．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南鄭州450002)

為了解河南省規(guī)模化奶牛場(chǎng)牛皰疹病毒1型(BHV-1)的感染情況，課題組于2015年2～8月，對(duì)河南省5個(gè)地區(qū)的12個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)進(jìn)行了分層隨機(jī)抽樣，共采集了440頭牛的鼻腔和/或陰道拭子樣品，采用qPCR方法進(jìn)行BHV-1的病原學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：共檢測(cè)出陽性奶牛68頭，總體陽性率為15.45%；場(chǎng)陽性率為100%，其中陽性率最高場(chǎng)達(dá)到了68.00%，最低場(chǎng)為6.67%；5個(gè)地區(qū)的陽性率由低到高依次為豫東(10.00%)、鄭州地區(qū)(10.78%)、豫北(12.04%)、豫西(20.00%)、豫南(35.82%)；不同年齡段奶牛的陽性率不同，犢牛、后備青年牛、1胎、2胎、3胎、4胎以上牛分別是3.57%、6.67%、23.53%、26.22%、14.55%、28.57%；患病牛陽性率為28.13%，明顯高于外觀健康牛的13.23%。結(jié)果表明，2015年河南省調(diào)查的5個(gè)地區(qū)普遍有BHV-1感染，其中豫西、豫南地區(qū)的陽性率較高，明顯高于豫東、豫中和豫北地區(qū)；隨著奶牛年齡和胎次的增加，陽性率整體呈上升趨勢(shì)；BHV-1感染與奶牛的臨床健康狀況密切相關(guān)，其中患有乳房炎牛群的陽性率最高。本試驗(yàn)首次利用qPCR對(duì)河南省規(guī)模化奶牛場(chǎng)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的BHV-1病原學(xué)調(diào)查，直接揭示了牛群中BHV-1的感染情況，分析了BHV-1感染與奶牛的年齡、機(jī)體健康狀況、牛場(chǎng)地理環(huán)境等的關(guān)系。

河南省 ； 牛傳染性鼻氣管炎 ； qPCR ； 感染情況

牛傳染性鼻氣管炎(IBR)是由牛皰疹病毒I型(BHV-1)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以鼻氣管炎、高熱、流產(chǎn)、眼結(jié)膜炎、傳染性膿皰性外陰陰道炎為主要特征。BHV-1具有潛伏感染和長期帶毒的特點(diǎn)，并具有泛嗜性，可侵害多個(gè)組織器官，對(duì)奶牛產(chǎn)奶量、繁殖力等均有較大的影響。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病。

國內(nèi)多個(gè)省市均有IBR的存在[1]，課題組在2010年進(jìn)行了河南省奶牛IBR的血清流行病學(xué)調(diào)查，24個(gè)奶牛場(chǎng)均有IBR存在，538頭奶牛的總陽性率為59.29%[2]。前期研究采用的是ELISA方法檢測(cè)BHV-1抗體，能判斷牛體內(nèi)是否感染了BHV-1，但無法判斷牛體內(nèi)BHV-1是否處于活躍狀態(tài)。熒光定量PCR方法相比以往的病毒分離鑒定、普通PCR等方法，敏感性要高很多，而且省時(shí)、省力，能夠更加真實(shí)地反映出BHV-1在牛群的流行感染情況。

為直接從病原學(xué)層面揭示BHV-1在本省規(guī)模化牛場(chǎng)的流行情況，本試驗(yàn)首次運(yùn)用Taq-Man熒光定量PCR方法，對(duì)河南省的規(guī)模化牛場(chǎng)進(jìn)行了BHV-1的病原學(xué)檢測(cè)，以期客觀評(píng)價(jià)BHV-1在牛群中的感染程度。

1 材料與方法

1.1 樣品 2015年2～8月期間，在河南省5個(gè)地區(qū)(豫東、豫西、豫南、豫北及鄭州地區(qū))的12個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)進(jìn)行了分層隨機(jī)抽樣，共采集了440頭牛的鼻腔和/或陰道拭子樣品，-80 ℃凍存待檢。

1.2 BHV-1 qPCR引物及探針 參照蔣珊珊的方法[3]，設(shè)計(jì)針對(duì)BHV-1gE基因序列的特異性引物和探針(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增片段為75 bp。

表1 qPCR引物和探針

1.3 主要試劑及儀器 AceQ?qPCR Probe Master Mix(Vazyme)、Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；900系列超低溫冰箱由賽默飛世爾儀器公司生產(chǎn)；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 拭子的處理 將采集的棉拭子分別放入1.5 mL EP管，加入1 mL的生理鹽水，振蕩30 s，室溫浸泡20 min或4 ℃過夜待處理。

1.4.2 拭子病毒DNA的提取 按照Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒操作步驟提取棉拭子中病毒DNA。

1.4.3 qPCR檢測(cè)方法 反應(yīng)體系：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，熒光探針(10 μmol/h)0.5 μL，上下游引物(10 μmol/h)各0.4 μL，模板1 μL，加dH2O至25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.4.4 臨床樣品的檢測(cè) 以含部分gE基因片段的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照，對(duì)440頭牛的棉拭子DNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)方法 運(yùn)用SPSS19.0軟件對(duì)不同地區(qū)的陽性率數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 牛拭子樣品檢測(cè)結(jié)果 12個(gè)牛場(chǎng)均檢出BHV-1陽性，場(chǎng)陽性率為100%，其中陽性率最高場(chǎng)達(dá)到了68.00%，最低場(chǎng)為6.67%，440頭牛共檢出陽性68頭，總陽性率達(dá)到15.45%。5個(gè)地區(qū)的陽性率由低到高依次為豫東地區(qū)(10.00%)、鄭州地區(qū)(10.78%)、豫北地區(qū)(12.04%)、豫西地區(qū)(20.00%)、豫南地區(qū)(35.82%)。豫南和豫東地區(qū)(P<0.01)、豫南和豫北地區(qū)(P<0.01)、豫南和鄭州地區(qū)(P<0.01)的結(jié)果差異極顯著；其他地區(qū)結(jié)果間存在的差異不顯著(P>0.05)。見表2、中插彩版圖1、圖2。

2.2 不同年齡、胎次牛的拭子檢測(cè)結(jié)果 不同年齡、胎次牛的拭子檢測(cè)結(jié)果見表3、圖3。陽性率最低的為犢牛，結(jié)果為3.57%，最高的為4胎以上奶牛，結(jié)果是28.57%。

2.3 不同健康狀況奶牛的拭子陽性率 不同臨床健康狀況奶牛的陽性率見表4。由表4可知，患病牛群的陽性率總體為28.13%，遠(yuǎn)高于外觀健康牛群的13.23%。患乳房炎牛的檢出率最高，結(jié)果是47.37%，其次為繁殖障礙牛群的24.14%、外觀消瘦、拉稀牛的14.29%和呼吸道疾病牛的11.11%。

3 討論

抽檢的12個(gè)奶牛場(chǎng)均為BHV-1陽性，場(chǎng)陽性率為100%，440頭抽檢牛的總陽性率為15.45%。

表2 不同牛場(chǎng)BHV-1陽性率

表3 不同年齡階段牛的拭子陽性率

圖3 不同年齡階段牛的拭子陽性率

表4 不同健康狀況牛的拭子陽性率

所有調(diào)查牛場(chǎng)均未防疫過IBR疫苗，說明河南省奶牛場(chǎng)仍廣泛存在BHV-1感染。相比較于過去常用的檢測(cè)抗體的血清學(xué)方法，本試驗(yàn)利用qPCR方法檢測(cè)BHV-1核酸，直接揭示BHV-1在牛體內(nèi)的感染情況，能更加真實(shí)地反映牛體內(nèi)處于活躍狀態(tài)病毒的感染情況。

不同地區(qū)奶牛場(chǎng)BHV-1的陽性率差異明顯，由低到高依次為豫東、鄭州地區(qū)、豫北、豫西、豫南地區(qū)，其中豫西和豫南地區(qū)的陽性率均高于總體陽性率，課題組在2010年進(jìn)行調(diào)查也發(fā)現(xiàn)豫西和豫南地區(qū)的陽性率較高[2]。通過PearsonX2分析結(jié)果顯示，豫南和豫東地區(qū)(P<0.01)、豫南和豫北地區(qū)(P<0.01)、豫南和鄭州地區(qū)(P<0.01) 的結(jié)果差異極顯著。河南省不同地區(qū)IBR陽性率的差異可能與不同地區(qū)的自然地理位置有一定關(guān)系，如豫西、豫南山區(qū)較多，而鄭州和豫東地區(qū)以平原為主，這一情況與王永艷調(diào)查結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)山區(qū)的BHV-1抗體陽性率顯著高于丘陵和平原地區(qū)[4]。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同年齡及胎次牛均為BHV-1陽性，并且隨著年齡和胎次的增加，陽性率整體呈上升的趨勢(shì)，表明奶牛BHV-1感染與牛的年齡和胎次有一定的相關(guān)性，隨著牛齡和胎次的增加，奶牛感染BHV-1的幾率也隨之增加。

患病牛群明顯高于外觀健康牛的陽性率，其中患乳房炎的牛群中，BHV-1的陽性率最高，結(jié)果為47.37%(9/19)，其次為繁殖障礙牛群的24.14%、外觀消瘦、拉稀牛的14.29%、呼吸道疾病牛的11.11%，上述結(jié)果表明，BHV-1感染與多種臨床病癥有關(guān)，但BHV-1感染與這些患牛病癥間的具體因果關(guān)系仍不清楚，這一情況或許與烏蘭其其格等報(bào)道的BHV-1感染后能夠?qū)е屡５姆翘禺愋悦庖吣芰ο陆涤嘘P(guān)[5]。但呼吸道疾病牛群中的陽性率僅為11.11%，與預(yù)期相反，推測(cè)與樣品數(shù)量少有關(guān)，需要對(duì)更多數(shù)量的樣品進(jìn)行檢測(cè)來研究。

在當(dāng)前奶牛養(yǎng)殖業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的關(guān)鍵階段，疾病是制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)效益的重要因素。本研究從病原學(xué)角度證實(shí)了河南省奶牛場(chǎng)BHV-1的普遍感染，并分析了河南省不同地區(qū)BHV-1的流行情況、BHV-1 感染與牛群年齡、健康狀況等的關(guān)系，提醒人們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)IBR的重視，積極做好IBR的防控。

[1] 鄒世穎, 何倩妮，劉蕾, 等. 中國北方六省市牛傳染性鼻氣管炎病流行病學(xué)分析[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2012,48(2): 47-48.

[2] 石冬梅, 王巖, 張華, 等. 河南省奶牛傳染性鼻氣管炎血清學(xué)調(diào)查[J]. 畜牧與獸醫(yī),2011,43(6):67-68.

[3] 蔣姍姍，趙莎莎，狄和雙，等. 牛傳染性鼻氣管炎病毒的熒光PCR檢測(cè)方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(1)：45-47.

[4] 王永艷, 王仲兵, 鄭明學(xué), 等. 山西省雁門關(guān)地區(qū)牛傳染性鼻氣管炎感染情況與相關(guān)因素的調(diào)查[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010,37(6):194-197.

[5] 烏蘭其其格，高晶，周偉光，等. BHV-1對(duì)牛單核巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能的影響[J].畜牧與飼料科學(xué)，2015.36(4)：23-25.

An Investigation on BHV-1 Infection in Large-Scale Dairy Farms in Henan Province in 2015

HUANG FU-heping1, ZHU Zhi-chao2, SHI Dong-mei1, WANG Yan1, SONG Yu-zhen1, CHEN Yi1, WANG Jun1, XU Wen-bo1, WANG Lin-kang1, SHI Jing-ke1, LI Cong-cong1, PAN Hao-chun1

(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China; 2.Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to study the BHV-1 infection status in large-scale dairy farms in Henan province, we conducted stratified random sampling on 12 large-scale dairy farms in 5 regions across Henan province. Nasal and/or vaginal swab samples were collected from a total of 440 cows for etiological detection of BHV-1 using qPCR. Results: A total of 68 cows were tested positive for BHV-1, accounting for the total positive rate15.45%. A total positive rate was 100% in the 12 ranch, and their positive rate was in the range of 68.00% to 6.67% in specific farms. The positive rate in specific regions was, in ascending order, 10.00% in East Henan, 10.78% in Zhengzhou, 12.04% in North Henan, 20.00% in West Henan, and 35.82% in South Henan. The positive rate varied in cows in different age groups, which was 3.57%,6.67%,23.53%,26.22%,14.55% and 28.57% in calves, reserve young cows, cows with 1 parity, cows with 2 parities, cows with 3 parities and cows with 4 or more parities, respectively. The positive rate was 28.13% in diseased cows, which was significantly higher than that in healthy cows, which was 13.23%. The results suggest that BHV-1 infection is prevalent in all of the 5 regions in Henan province in 2015, with the positive rate significantly higher in West Henan and South Henan than that in East Henan, Zhengzhou and North Henan. The positive rate presents a tendency toward rising with increasing age; BHV-1 infection is closely related to the clinical health of cows, and the positive rate is the highest in cows with mammitis. This study for the first time used qPCR for systemic etiological investigation on BHV-1, revealed the actual BHV-1 infection status in cows; and addressed the association between BHV-1 infection and animal age, health and geological environment of dairy farm.

Henan Province; Infectious bovine rhinotracheitis; qPCR; Infection status Corresponding author：SHI Dong-mei

2016-08-16

河南省重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(132102110053)；河南省教育廳科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(14B230006)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(HUAHE2015004)

皇甫和平(1977-)，男，講師，博士，主要從事動(dòng)物疾病發(fā)病機(jī)理研究，E-mail:hepinghf@163.com

石冬梅,E-mail: dongmeishi126@126.com

S858.23

A

0529-6005(2017)03-0010-03