HPLC法測定人血清伏立康唑濃度

李 輝，趙宇蕾，周國華，芮建中

HPLC法測定人血清伏立康唑濃度

李 輝，趙宇蕾，周國華，芮建中

目的 建立高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定人血清中伏立康唑的方法，為臨床伏立康唑的個體化用藥提供方法學基礎。 方法 采用7%高氯酸直接沉淀血清蛋白，色譜柱采用漢邦Hedera ODS?2（4.6 μm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈?20 mmol／L磷酸二氫鈉緩沖液（pH＝6.0）（60∶40，v／v），流速為1.0 mL／min，檢測波長為254 nm。 結果 伏立康唑在0.367～23.5 μg／mL間線性良好（r＝0.9964），批內、批間準確度偏差＜±5.0%，批內、批間精密度相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）＜11.1%，在室溫放置、冰凍、反復凍融條件下考察樣品穩定性，伏立康唑均保持穩定，偏差＜±12.5%。 結論 建立的HPLC測定人血清伏立康唑濃度的方法具有操作簡便、特異性高、靈敏度高、成本低的特點，更適合臨床中常規應用。

伏立康唑；高效液相色譜；血清濃度

真菌細胞膜中含有麥角甾醇，三唑類抗真菌藥通過抑制細胞色素氧化酶P450介導的14α?羊毛甾醇去甲基化而抑制麥角甾醇的合成，從而使真菌細胞膜合成受阻，破壞其穩定性，最終導致真菌細胞死亡［1］。伏立康唑作為第二代抗真菌藥，在第一代氟康唑結構的基礎上，通過丙基骨架引入一個甲基顯著增強其對CYP450依賴性羊毛甾醇14α?去甲基酶的親和力，并在嘧啶環引入一個氟原子提高其體內抗真菌活性，因此被廣泛應用于侵襲性真菌感染，并成為侵襲性曲霉菌感染的一線用藥［2］。

伏立康唑治療侵襲性曲霉病的Ⅲ期臨床試驗證實，其血藥谷濃度與藥?時曲線下面積正相關［3］；Meta分析證實，患者伏立康唑穩態血藥谷濃度＜0.5 μg／mL時，感染預防失敗率增加，而＞3 μg／mL時，肝毒性發生率隨濃度上升而顯著增加，并有可能出現神經毒性和視覺障礙［4］；多個研究顯示，伏立康唑谷濃度在個體內及個體間存在較大差異［5?6］。 以上結果均提示，在臨床實踐中十分有必須監測伏立康唑血藥濃度，穩態血藥谷濃度更能準確反映伏立康唑使用的有效性和安全性。本文建立臨床適用的快速、準確的血清伏立康唑高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定方法，并成功協助臨床科室開展真菌感染相關治療，為伏立康唑的合理使用提供有效的方法學基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜系統（G1322A在線脫氣機，G1312A泵，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器，Agilent ChemStation化學工作站，Agilent），電子分析天平（XS205DU，Mettler Tole?do），低速離心機（2?6E，Sigma），高速離心機（1?13，Sigma），渦旋振蕩器（WH?3，上海滬西分析儀器廠），pH計（PHS?3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司）等。

1.1.2 藥品與試劑 伏立康唑對照品（純度＞99%，中國藥品生物制品檢定所，批號：201402），乙腈（色譜純，Tedia，批號：609697），二水合磷酸二氫鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130502），其它試劑均為分析純，試驗用水為自制超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Hedera ODS?2（4.6 μm ×250 mm，5 μm），江蘇漢邦科技有限公司；流動相：乙腈?20 mmol／L磷酸二氫鈉緩沖液（pH＝6.0）（60∶40，v／v）；檢測波長：254 nm；柱溫40℃；流速：1.0 mL／min；進樣體積：20 μL。

1.2.2 血清樣本處理 取血清樣本200 μL置于新的EP管中，加入100 μL 7%高氯酸，渦旋混合15 s，13 000 r／min離心10 min后，取上清進樣分析。

1.2.3 方法專屬性試驗 在本試驗所采用的色譜條件下，按1.2.2項下方法操作，分別記錄空白血清、空白血清＋伏立康唑、伏立康唑患者血清色譜圖，確定分析方法的專屬性，排除雜質干擾。

1.2.4 標準曲線與定量下限 精密稱取伏立康唑對照品4.7 mg置于5 mL容量瓶中，加少量乙腈完全溶解后加適量水定容，配成濃度為940 μg／mL的標準儲備液。加水稀釋標準儲備液，依次配成3.67、7.34、14.69、29.38、58.75、117.5、235.0 μg／mL的系列工作液。分別在180 μL空白血清中加入20 μL工作液，使血清中藥物濃度依次為 0.367、0.734、1.469、2.938、5.875、11.75、23.5 μg／mL；按1.2.2項下方法操作，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得標準曲線和定量下限。

1.2.5 精密度與準確度試驗 加水稀釋標準儲備液，依次配成5.4、37.8、188.8 μg／mL的系列工作液。分別于180 μL空白血清中加入20 μL工作液，精確配制成含低、中、高（0.54、3.78、18.88 μg／mL）3種不同伏立康唑濃度的血清樣品，每種濃度5份。按1.2.2項下方法處理，記錄色譜圖。根據當日的標準曲線計算伏立康唑的血清濃度，考察批內準確度、批內精密度；連續3 d同法操作，考察批間準確度、批間精密度。

1.2.6 提取回收率試驗 分別于180 μL空白血清中加入20 μL 2.5項下的工作液，精確配制成含低、中、高（0.54、3.78、18.88 μg／mL）3種不同伏立康唑濃度的血清樣品，每種濃度5份。用水代替空白血清配置對照品溶液，每種濃度5份。按1.2.2項下方法處理，記錄色譜圖。以每一濃度兩者峰面積之比計算提取回收率。

1.2.7 樣本穩定性考察 血清樣品分別在室溫放置8 h、凍融3次、－20℃放置15 d以及處理好室溫放置24 h進行測定，記錄色譜圖，考察樣本的穩定性。

2 結 果

2.1 方法的專屬性 在本實驗所采用的色譜條件下，伏立康唑保留時間在5.5 min左右，樣品峰形良好，無雜峰干擾測定。色譜圖見圖1。

2.2 標準曲線和定量下限 標準曲線的直線回歸方程：Y＝4.600X－0.052（r＝0.9964）。結果表明，伏立康唑血藥濃度在0.367～23.5 μg／mL范圍內線性關系良好。伏立康唑在血清中的定量下限為：0.367 μg／mL。

2.3 精密度與準確度 批內、批間準確度和精密度見表1。批內、批間準確度偏差＜±5.0%，批內、批間精密度相對標準偏差（RSD）＜11.1%，符合生物樣品分析要求。

圖1 伏立康唑色譜圖

表1 不同濃度批內、批間準確度和精密度（n＝5）

2.4 提取回收率 提取回收率結果見表2。絕對回收率＞95.6%。

表2 不同濃度回收率比較（n＝5）

2.5 樣本穩定性 樣本穩定性結果見表3。在室溫放置8 h、凍融3次、－20℃放置15 d以及處理好后室溫放置24 h條件下，伏立康唑均保持穩定，未出現明顯變化，偏差均＜±12.5%，符合生物樣品分析要求。

表3 不同條件下樣品穩定性（n＝5）

2.6 臨床應用 本方法成功用于口服伏立康唑患者的血藥濃度監測。我院呼吸內科送樣患者主要目的為抗真菌感染。某患者服用常規劑量的伏立康唑后，穩態血藥谷濃度為12.22 μg／mL，高于推薦有效濃度1～5.5 μg／mL；主治醫生將劑量減半后，重新測定穩態血藥谷濃度為5.49 μg／mL，成功調整至有效濃度范圍。

3 討 論

伏立康唑作為一線抗真菌藥物，在臨床中受到廣泛應用。已有研究證實，伏立康唑的有效性和安全性與穩態血藥谷濃度密切相關［3?4］，因此，對其進行血藥濃度監測十分必要。利用藥物在流動相和固定相中分配系數的差別而分離藥物與雜質的色譜法是臨床常用的測定方法［7?10］，與近年興起的LC?MS／MS方法相比，HPLC方法操作簡便、成本低、基質效應小，因此更易于在臨床實際應用中得到推廣。

目前已有多篇文章采用HPLC方法分析血漿、血清中伏立康唑的濃度［11?12］，但仍存在一定問題。血漿、血清所含蛋白會造成色譜柱堵塞，降低其壽命，因此在色譜分析之前去除蛋白十分必要。已有文獻中多采用3倍體積乙腈方法沉淀血漿、血清蛋白［13?14］，但因加入體積過大而使樣本中伏立康唑濃度成倍下降，方法靈敏度顯著降低；如加入乙腈沉淀蛋白后吹干再用流動相溶解，會部分解決靈敏度問題，但處理步驟繁瑣，并容易帶來較大的操作誤差，影響測定方法的準確度和精密度；本文采用0.5倍體積7%高氯酸方法沉淀蛋白，在不影響伏立康唑結構和色譜行為的前提下，對樣本的稀釋作用較少，且可直接離心后上樣分析，操作簡便，靈敏度高。流動相中濃度過高的緩沖液易造成色譜柱堵塞，本文將文獻中常用的50～100 mmol／L磷酸二氫鈉調整為20 mmol／L［14?15］，在不影響伏立康唑色譜行為的前提下，顯著降低了色譜柱堵塞風險，延長色譜柱使用壽命，節約了試劑和測定成本。

綜上所述，本文所采用的伏立康唑HPLC測定方法操作簡便、特異性高、靈敏度高、成本低且色譜柱使用壽命長，更適合臨床實際應用。目前，該方法已在我院被廣泛用于監測伏立康唑的臨床應用，為其使用的有效性和安全性提供有力的技術保障。

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The determination of voriconazole concentration in human serum by HPLC

LI Hui，ZHAO Yu?lei，ZHOU Guo?hua，RUI Jian?zhong

（Department of Pharmacology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region，PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China）

Objective To establish an high performance liquid chromatography（HPLC） method to determine the voriconazole concentration in human serum，that will provide methodological foundation for individual medicine. Methods After the precipitation of serum proteins with 7%perchloric acid，the voriconazole concentration was determined by HPLC on a reversed phase Hedera ODS?2 column（4.6 μm×250 mm，5 μm）.The mobile phase was a mixture of acetonitrile and 20 mmol／L sodium dihydrogen phosphate buffer adjusted to pH 6.0，with the mix ratio 60∶40，and was delivered at a flow rate of 1.0 mL／min.The UV detection was set at 254 nm. Results The peak area for voriconazole was linearly related to its concentrations，which ranged from 0.367 to 23.5 μg／mL（r＝0.9964）.The intra?and inter?assay variations were within±5.0%and their relative standard deviation values were within 11.1%.The serum samples were stable when stored at room temperature，after frozen for 15 days and after 3 cycles of freeze and thaw processes；deviations were within±12.5%. Conclusion The established HPLC method is simple and fast with high specificity，high sensitivity and low cost.The improved method is more suitable for clinical routine use.

Voriconazole；High Performance Liquid Chromatography；Serum concentration

R969.3

A

1672?271X（2017）01?0030?04

10.3969／j.issn.1672?271X.2017.01.008

2016?07?05；

2016?07?26）

（本文編輯：張仲書； 英文編輯：王建東）

210002 南京，南京軍區南京總醫院藥理科

芮建中，E?mail：ruijianzhong＠126.com

李 輝，趙宇蕾，周國華，等.HPLC法測定人血清伏立康唑濃度［J］.東南國防醫藥，2017，19（1）：30?33.