不同冷凍方式對斑點叉尾鮰魚片品質的影響

彭歡歡，劉小莉，張金振，李瑩，周劍忠，劉源

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京210014；3.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

不同冷凍方式對斑點叉尾鮰魚片品質的影響

彭歡歡1，劉小莉2，*，張金振3，李瑩2，周劍忠2，劉源1

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京210014；3.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

研究不同的低溫冷凍預處理方式，即-20℃慢凍、-20℃、-40℃、-60℃速凍至-20℃，進行鮰魚片的冷凍，隨后于-20℃凍藏，考察儲藏期間鮰魚片理化性質的變化情況。結果表明，隨著凍藏時間的延長，不同方式的凍結鮰魚pH值、Ca2+-ATPase活性、活性巰基均呈下降趨勢，MDA值、TVB-N值、表面疏水性呈上升趨勢，速凍處理組的樣品各指標變化趨勢明顯低于或遲緩于慢凍組，且速凍溫度越低，效果越顯著。考慮到成本因素，可以結合其他保鮮手段適當提高凍結溫度至-20℃～-40℃以保證產品品質。

斑點叉尾鮰魚；速凍；溫度；品質

斑點叉尾鮰，又稱溝鯰、河鯰、美洲鯰，屬于鯰形目，鮰科，叉尾鮰屬，是一種原產于美洲的大型淡水魚類。鮰魚全身光滑無鱗，具有肉質細嫩、肉色白、無肉間細刺、易切片、營養價值高等優點，有人體必需的8種氨基酸和多種維生素以及大量的不飽和脂肪酸[1]，深受國內外消費者喜愛。

斑點叉尾鮰魚是美國主要淡水養殖品種之一，其產量超過美國淡水養殖總產量的一半以上[2]。我國于1978年和1984年相繼從日本和美國引進養殖，并于1987年獲得繁殖成功，目前已在我國20多個省市養殖，產量高達16.2 t/hm2[3]。但斑點叉尾鮰體脂含量非常高，鮮銷產量不及其他淡水魚類，為了解決供銷關系的平衡，保證養殖業的持續發展，需要對其進行加工處理，延長產業鏈，提高附加值。

冷凍魚片是目前較為普遍的一種斑點叉尾鮰加工方式，可用于出口或國內銷售延長貨架期。凍藏作為主要的保鮮、保藏方法，已廣泛應用于水產品的貯藏、運輸、銷售和加工中。然而魚類在凍藏過程中會發生一系列的變化，例如蛋白質變性、ATP降解、脂肪氧化等，嚴重影響著凍品的質量，降低了魚類的商品價值和營養價值[4]。尤其是斑點叉尾鮰魚脂肪含量高，更易在長期低溫貯藏過程中發生脂肪氧化，進而加速蛋白質變性。

冷凍加工過程中凍結速率是影響冰晶形成數量、大小和分布的一個重要因素。多項研究表明[5-7]，凍結速率越高，原料質構特性保持得越好。合理的凍結方式對生產高質量產品具有重要意義。

本文采用4種不同的凍結方式（-20℃慢凍、-20℃、-40℃、-60℃速凍），以pH值、丙二醛（MDA）、揮發性鹽基氮（TVB-N）、Ca2+-ATPase活性、活性巰基、表面疏水性等指標來研究預處理過程中凍結速率對鮰魚品質的影響，為魚片的加工利用提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮮活斑點叉尾鮰魚[每條（1 500±150）g]：南京佳鴻水產商行。

高氯酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：國產分析純；5，5’-二硫代雙-硝基苯甲酸（DTNB）、1-苯胺基-8-奈基磺酸鹽（ANS）：Sigma公司。BCA法蛋白定量測試盒、丙二醛（MDA）試劑盒、超微量Ca2+-ATP酶測試盒：南京建成生物工程研究所。

DW-150低溫試驗箱：南京泰斯特試驗設備；DW-4OL278醫用低溫保存箱：海爾集團；SynergyH1酶標儀：美國柏騰儀器有限公司；T25勻質分散機：德國IKA公司；UV-1600PC紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；3K15高速離心機：北京五洲東方科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理

鮰魚敲暈后切除魚頭，去內臟、魚皮，流水清洗干凈后瀝干10 min，剖片、清洗、整形、控水、分級、備用，切分成2 cm×2 cm×2 cm大小的魚片。

1.2.2 凍結、凍藏及解凍

將整理好的鮰魚片隨機分成4組并分別處理，處理方式如下并貯藏：

1）慢速凍結：將魚片直接置于-20℃冰箱中緩慢凍結；

2）快速凍結：分別設置低溫試驗箱溫度為-20℃、-40℃、-60℃，待腔體溫度穩定至設置值后，將溫度記錄儀探頭插入魚片樣品中心進行凍結至-20℃，然后置于-20℃冰柜中貯藏；

凍藏過程中定期取樣測定。試驗時，取適量凍魚片置于（4±1）℃冰箱中解凍12 h，解凍后樣品用于各項指標的測定。

1.2.3 提取和測定方法

1.2.3.1 肌原纖維蛋白的提取[8]

稱取5 g樣品加10 mL、4℃預冷的去離子水，12 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min、4℃離心20 min，棄去上清液，沉淀中加入去離子水，再重復提取一次。沉淀中再加入20 mL、4℃預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）（其中補充0.6 mol/L的NaCl），12 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清液。沉淀用上述步驟再重復提取一次，合并上清即為肌原纖維蛋白粗提取液，其濃度采用BCA試劑盒測定。

1.2.3.2 pH值的測定

取魚肉樣品2 g，加入9倍體積的煮沸冷卻后的純水，勻漿，10000r/min離心10min，取上清液測定pH值。

1.2.3.3 丙二醛（MDA）含量測定

取魚肉樣品2 g，加入9倍體積的煮沸冷卻后的純水，勻漿，取勻漿液測丙二醛含量采用MDA試劑盒進行測定。

1.2.3.4 揮發性鹽基氮的測定

揮發性鹽基氮（TVB-N）測定采用GB/T 5009.44-2003半微量定氮法進行測定，略有改動。事先配制5%高氯酸溶液，樣品5 g，加入20 mL高氯酸提取，勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清。沉淀中再加入20 mL高氯酸重復上述提取步驟2次，合并上清，定容到65 mL。上清用于測TVB-N。

1.2.3.5 Ca2+-ATPase活性的測定

準確稱取待測樣品，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下12 000 r/min勻漿30 s，2 500 r/min，離心10 min，取上清液用生理鹽水稀釋至適當濃度，采用超微量Ca2+-ATPase測試盒測定。

1.2.3.6 活性巰基（SH）的測定[9]

取1.2.3.1中提取的蛋白溶液0.5 mL，加入4.5 mL的0.2mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）。取該混合液1mL，加入0.1 mL 0.1%DTNB，40℃溫育25 min，測定412 nm處的吸光度。空白樣用0.6 mol/L KCl（pH 7.0）代替樣品。SH基團含量的計算公式如下：

-SH含量（nmol/mg蛋白質）=（A×n）/（ε×p）×106

式中：A表示412 nm波長處的吸光度；n表示稀釋倍數；ε表示摩爾吸光系數13 600 L/（mol·cm）；p表示蛋白質質量濃度，mg/mL。

1.2.3.7 表面疏水性的測定[9]

取1.2.3.1中提取的蛋白溶液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液溶解，ANS濃度為8 mmol/L備用。用10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.0，含0.6 mol/L NaCl）稀釋至0.125、0.25、0.5、1 mg/mL。取4 mL上述各濃度的肌原纖維蛋白溶液，與30 μL ANS混合。測定ANS-蛋白結合體的熒光強度，激發波長374 nm、發射波長485 nm。以熒光強度對肌原纖維蛋白濃度做圖，所得到的曲線斜率即表示為蛋白表面疏水性指數SoANS。

1.3 數據差異性分析

本試驗數據為3次重復的平均值。采用SPSS 13.0軟件進行數據統計和方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 凍結速率對鮰魚pH值的影響

凍結速率對鮰魚pH值的影響見圖1。

圖1 凍結速率對鮰魚pH值的影響Fig.1 Effect of freezing methods on pH value of channel catfish fillets

由圖1可知：-20℃慢凍組pH值先下降后上升，-20℃速凍組pH值變化趨勢與慢凍組類似，但比較平緩。-40、-60℃速凍組在18周儲藏期內保持降低趨勢。pH值的下降是因為當動物呼吸停止時，血液停止循環引起供氧停止，組織呼吸轉變成無氧糖酵解途徑，體內糖原開始分解并產生乳酸，使肌肉的pH值下降。pH值達最低時，表明已達到僵硬高峰，隨后pH值又緩慢回升，說明僵硬過程結束，蛋白質在酶類作用下逐漸分解并產生氨基酸及其它堿性物質，此外，細菌也利用氨基酸和其它含氮小分子產生氨及胺類等堿性物質，使pH值回升并進入解僵階段[5]。

速凍條件下凍藏，pH值下降程度較小，特別是-40℃以下速凍條件凍藏pH值變化相對緩慢，最終pH值為6.7左右，更有利于品質的保證。胡亞芹等[6]研究發現，經過3種不同凍結方式（-40℃液氮凍結、-30℃平板凍結、-18℃冰柜直接凍結）凍結至中心溫度-18℃，并于-18℃環境中貯藏帶魚70 d，63 d左右pH值達到最低值時帶魚達到僵硬高峰，63 d后其pH值上升。

2.2 凍結速率對脂肪氧化的影響

硫代巴比妥酸試驗法（即TBA值法）是測定肉類食品中脂肪氧化情況通常采用的方法。丙二醛作為過氧化脂質降解的特征產物，能夠與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰，其強度和含量呈線性關系，能夠反映肉及肉類制品中脂肪氧化變質程度，是肉類食品安全性的重要指標。

很多試驗已經證明，即使在很低的溫度下，脂肪氧化也會進行[10]。鮰魚是一種高脂肪的魚類，其所含的脂肪酸大多數為不飽和脂肪酸，很容易發生脂質氧化，且在凍結過程中鮰魚的自由水在不斷減少，組織液的濃度逐漸增大，使其氧化速度加快。另外，凍結速率不同，形成的冰晶體大小不同，因而對組織機械損傷程度不同，暴露在空氣中的損傷面積會增加脂質氧化的可能。凍結速率對脂肪氧化的影響見圖2。

圖2 凍結速率對鮰魚片MDA值的影響Fig.2 Effect of freezing methods on MDA of channel catfish fillets

圖2結果顯示，4種凍結條件下凍藏的鮰魚，隨時間延長，其MDA值均呈上升趨勢，且-20℃慢凍處理的樣品比其它3種方式上升速率顯著加快。-40℃以下處理的樣品差異不顯著。-20℃慢凍處理的樣品在10周儲藏期后MDA含量又趨于降低，這可能是由于二級氧化產物醛、酮類物質進一步降解造成的。Aubourg等[11]研究也發現次級產物MDA可與魚肉中的氨基相互作用生成l-氨基-3-氨基丙烯，從而導致MDA含量的下降。

2.3 凍結速率對揮發性鹽基氮的影響

鮰魚蛋白質含量較高，在凍結過程中低溫雖然可以抑制大多數微生物的活動，但仍有部分微生物的生長繁殖和酶解作用會使鮰魚中蛋白質分解，蛋白質分解產生氨及胺類等堿性含氮物，揮發性鹽基氮含量（TVB-N值）可反映出蛋白質分解程度和腐敗程度。凍結速率對揮發性鹽基氮的影響見圖3。

圖3 凍結速率對鮰魚TVB-N值的影響Fig.3 Effect of freezing methods on TVB-N of channel catfish

由圖3看出，4種凍結條件下凍藏的鮰魚，隨著時間延長，其TVB-N值均呈上升趨勢，且-20℃慢凍條件凍藏明顯比其它3種上升速率快。前期TVB-N變化緩慢可能是氨基酸經脫氨基作用釋放出氨態氮，而二甲胺DMA和三甲胺TMA等低級胺類化合物產生的可能性不大，所以上升慢；而后期，微生物活動加強，大量的氨基酸被微生物分解，脫氨基作用加劇，導致TVB-N上升迅速[12-14]。速凍處理顯著延緩了TVB-N值的增加，根據GB 2733-2005《鮮、凍動物性水產品衛生標準》規定，淡水魚的揮發性鹽基氮≤20 mg/100 g，說明即使慢凍處理的鮰魚片也能很好地維持TVB-N在較低的水平，保持良好的新鮮度。

2.4 凍結速率對Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase活性源于肌球蛋白的球狀頭部結構，其活性與頭部區域密切相關，可作為判斷冷凍儲藏期間，肌原纖維蛋白結構特別是肌球蛋白頭部結構變化的較為靈敏的指標[15]。在凍藏過程中，肌球蛋白球狀頭部構象發生改變或者相互聚集，將造成肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的下降[16]。凍結速率對Ca2+-ATPase活性的影響見圖4。

圖4 凍結速率對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase性的影響Fig.4 Effect of freezing methods on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein

由圖4可知，隨著凍藏時間的延長，4種凍結條件下樣品的Ca2+-ATPase活性明顯降低，凍藏結束后，-20℃慢凍、-20℃速凍、-40℃速凍、-60℃速凍處理的樣品 Ca2+-ATPase活性分別為 0.21、0.61、0.88、0.97 μmol Pi/（mg蛋白·min），與初始樣品相比分別降低了85.5%、58.8%、40.3%和34.5%。本研究中速凍處理對延緩樣品中Ca2+-ATPase活性的下降有顯著的效果，且-40℃以下的低溫顯著優于-20℃，-40℃和-60℃處理間差異不顯著。很多研究得出了相似的結論。Xiong等[17]研究發現，在-18℃凍藏30 d后，草魚肉蛋白的Ca2+-ATPase活性降低了71.4%。Herrera等[18]在研究殼聚糖對狗母魚魚糜的抗凍作用時，發現在-25℃凍藏6個月期間，狗母魚魚糜的Ca2+-ATPase活性減小為初始的12.1%。陰曉菲[19]，Benjakul[20]等研究發現凍藏期間魚蟹類的Ca2+-ATPase活性均在前2～3月下降較快，后期變化不大，這與本試驗研究結果一致。

2.5 凍結速率對巰基含量的影響

巰基是肌原纖維蛋白中大量活性和功能基團的重要組成部分，具有較高反應活性，對于維持蛋白空間結構穩定、及其理化和功能性質具有重要意義[16，21]，其含量的變化能夠反映出蛋白質變性集合的程度，巰基含量下降的主要原因是疏基氧化形成二硫鍵所致[22]。大量研究發現，在蛋白質凍藏過程中，活性巰基易于氧化成二硫鍵，改變蛋白質的空間結構[16]。凍結速率對巰基含量的影響見圖5。

圖5 凍結速率對鮰魚肌原纖維蛋白活性巰基含量的影響Fig.5 Effect of freezing methods on active sulfhydryl content of myofibrillar protein

由圖5可知，隨著凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白樣品的巰基含量明顯降低，第2周和第10周分別出現速度下降拐點，-20℃慢凍、-20℃速凍、-40℃速凍和-60℃速凍巰基含量第2周結束時分別下降到初始值的78.8%、81.7%、84.0%、87.6%，10周后分別為初始值的57.1%、64.2%、65.5%、69.1%，18周儲藏期結束后殘余含量分別為42.1%、45.0%、49.9%、60.1%。在不同條件的凍藏下，鮰魚的活性巰基含量均在前10周有較快的下降速率。曾名湧等[23]認為，這種現象是因為肌原纖維蛋白中有一部分活性巰基位于分子外側，在凍藏初期蛋白質結構未發生重大變化時就能夠被氧化。此外，蛋白質分子聚合體的形成會覆蓋一些巰基，而使能夠檢測到的游離的巰基部分減少，導致了巰基含量下降。巰基的下降伴隨著Ca2+-ATPase活性的降低，這可能是因為肌球蛋白構象發生改變，特別是頭部區域的變化。這些變化導致了活性巰基的暴露，使其更易發生氧化或二硫鍵交換，從而巰基含量下降[24]。

2.6 凍結速率對表面疏水性的影響

蛋白質的表面疏水性反映的是蛋白質分子表面的疏水性殘基的相對含量，新鮮魚肉蛋白質的疏水性基團傾向位于蛋白質分子內部，具有較低的表面疏水性。凍藏初期，折疊態的肌原纖維蛋白分子開始伸展，原先位于蛋白質多肽鏈內部的疏水性基團外露，引起蛋白質分子表面疏水性的上升[25]。凍結速率對表面疏水性的影響見圖6。

圖6 凍結速率對鮰魚肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.6 Effect of freezing methods on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

由圖6可以看出，隨凍藏時間的延長，表面疏水性表現出增大的趨勢，凍藏結束時，-20℃慢凍樣品相對初始值增加了1.73倍，Zhou等[26]研究發現，羅非魚糜在-18℃凍藏24周后，樣品表面疏水性相對初始值增加了2倍。-20℃速凍樣品和-40℃速凍樣品分別增加了1.24倍和1.07倍，-60℃速凍樣品組變化比較緩慢，增加了57%，最終都遠大于凍藏前水平，表明凍藏改變了肌原纖維蛋白的結構。Ren等[27]研究發現，凍藏12周后，-18℃和-50℃下樣品疏水性相對初始值分別增加了54%和39%。

3 結論

凍結處理時，在緩慢凍結條件下，冰晶先在溶液溫度較低的細胞外液生成，隨著凍結溫度下降，細胞內部的水分也開始通過細胞膜往外遷移，使細胞外冰晶長大，這種凍結方式形成的冰晶量少且粗大，多呈塊狀或柱狀。凍結速度越快，則凍制產品溫度下降越快，魚肉組織中生成的冰晶越細小，且基本上均勻分布在細胞內，對魚肉品質破壞較小[28]。因此冷凍加工過程中應盡快使物料通過最大冰晶形成帶，迅速達到所需凍藏溫度，使生成的冰晶細小且分布均勻，從而減小蛋白質凍結中的變性程度。

本研究結果表明經過速凍的鮰魚片的各項理化指標顯著優于在冰柜中緩慢凍結的鮰魚，前者通過最大冰晶生成帶的時間短，形成的冰晶體小，對鮰魚造成的肌肉損傷小，但-40℃以下的低溫對品質變化的影響差異不大，且超低溫處理的成本相對較高。結合目前我國企業實際生產條件，在-20℃～-40℃范圍內盡可能采用低溫速凍，可以很好地保持鮰魚片的冷凍品質。

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Effects of Freezing Methods on Quality of Channel Catfish Fillets

PENG Huan-huan1，LIU Xiao-li2，*，ZHANG Jin-zhen3，LI Ying2，ZHOU Jian-zhong2，LIU Yuan1
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Institute of Agricultural Products Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Science，Nanjing 210014，Jiangsu，China；3.Institute of Apicultural Research，CAAS，Beijing 100093，China）

Effectsofdifferentfreezingmethods，including slow fridge freezing at-20℃，rapid freezing at-20℃，-40℃and-60℃respectively，on the quality of channel catfish fillets stored at-20℃，were evaluated.The results showed that during the storage at-20℃，pH value，Ca2+-ATPase activity and total sulfhydryl content decreased，while MDA contents，TVB-N contents and surface hydrophobicity increased continuously.The changing extents of each characteristic with rapid freezing methods were much lower than those with fridge freezing.With the consideration of cost，low temperature with the range between-20℃and-40℃would be suitable to maintain the quality of catfish fillets，with the combination of other preservative methods.

Channel Catfish fish；freezing methods；temperature；quality

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.042

2016-08-01

江蘇省農業科技自主創新資金項目（CX（15）1013）

彭歡歡（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：水產品加工與貯藏。

*通信作者：劉小莉（1981—），女（漢），副研究員，博士，研究方向：食品科學。