非靶向代謝組學用于藜蘆妨害人參治療脾氣虛的機制研究

林賀 皮子鳳 門麗慧 陳維佳 劉志強 劉忠英

摘要 采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜（UPLC/QTOFMS）聯(lián)用技術，通過非靶向代謝組學方法分析大鼠尿液內(nèi)源性代謝物的變化，研究藜蘆妨害人參發(fā)揮藥效作用的機制。建立脾氣虛大鼠模型，連續(xù)給藥15天，測定力竭游泳時間及血液中白細胞、紅細胞、血紅蛋白的含量。結果表明，人參可顯著提高脾氣虛模型大鼠的力竭游泳時間（p<0.01），升高白細胞、紅細胞及血紅蛋白含量（p<0.05，p<0.01），藜蘆對脾氣虛模型大鼠各項指標無明顯影響（p>0.05），人參與藜蘆配伍后對脾氣虛模型大鼠各項指標均無顯著影響（p>0.05），表明藜蘆妨害了人參發(fā)揮藥效作用。采用UPLC/QTOFMS技術及非靶向代謝組學的方法分析了空白組、模型組、人參組、藜蘆組、參藜組對脾氣虛模型大鼠的尿液代謝組差異，其中主成分分析（PCA）得分圖顯示各組代謝輪廓有顯著差別，并通過正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）及數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出15種人參干預調(diào)節(jié)脾氣虛模型大鼠的潛在生物標志物，從中找出了7種人參藜蘆配伍后減弱人參上述干預作用的潛在生物標志物，并對其涉及的代謝通路進行了系統(tǒng)分析。上述研究結果表明，人參藜蘆配伍后妨害了人參對脾氣虛模型大鼠的治療作用，其機理可能是影響人參對體內(nèi)能量代謝、免疫平衡及氧化還原反應等相關代謝的調(diào)節(jié)。

關鍵詞人參；藜蘆；配伍禁忌；脾氣虛；非靶向代謝組學

1引言

“相反”是中藥七情配伍理論的重要組成部分，屬于配伍禁忌，歷代各家本草均指出“十八反”決不可用。金元時期的醫(yī)家張子和總結了前人各家之說創(chuàng)作了十八反的歌訣，其中人參作為“百草之王”應用于數(shù)萬方劑中，與藜蘆的相反作用也成為最有代表性配伍禁忌之一。

目前，關于“十八反”的作用機制的爭論主要集中在配伍后會增加毒性或降低藥效兩個方面[1～3＼]。但是在臨床應用、合用后化學成分變化、藥效毒理以及藥物吸收代謝等方面的研究表明，“十八反”都沒有明顯一致的規(guī)律[4＼]。因此有效地結合新的研究技術及方法對配伍的每一個環(huán)節(jié)，如體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄和生理病理變化等情況進行考察，挖掘其中的內(nèi)在聯(lián)系，有助于揭示“十八反”的科學內(nèi)涵[5，6＼]。

代謝組學作為系統(tǒng)生物學的分支，是研究代謝組在新陳代謝某一動態(tài)時刻的變化規(guī)律的一門學科[7＼]。它將人體作為一個完整的動態(tài)系統(tǒng)，因此被越來越多地應用于中醫(yī)中藥的相關研究中[8，9＼]。目前，最常用的分析方法是核磁共振（NMR）和各種質譜聯(lián)用，如液質聯(lián)用（LCMS，UPLCMS，UPLCMS/MS），JP氣質聯(lián)用（GCMS，GCQTOFMS/MS），電泳質譜聯(lián)用（CEMS）和等離子體質譜（ICPMS）等[9，10＼]。

代謝組學按其研究的目的可分為靶向和非靶向代謝組學。其中靶向代謝組學是研究少數(shù)幾種或幾類結構、性質相似或生化功能相關的內(nèi)源性代謝物。非靶向代謝組學則是針對生物樣品中盡可能多的內(nèi)源性代謝物進行研究[11＼]。

本研究擬通過采用非靶向代謝組學的研究方法，結合UPLCMS聯(lián)用技術，在病理生理條件下考察“十八反”中人參與藜蘆這一具有代表性的反藥配伍組合干擾、改變、降低或消除藥效的作用機制，為更好地詮釋中醫(yī)藥配伍禁忌傳統(tǒng)理論提供科學依據(jù)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

WatersAcquityUPLC液相色譜系統(tǒng)、QTOFSYNAPTG2HDMS質譜儀（美國Waters公司）；MilliQ超純水儀（美國Millipore公司）；BC5300Vet全自動血液細胞分析儀（中國深圳邁瑞公司生物醫(yī)療電子股份有限公司）；乙腈、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；紅細胞、白細胞、血紅蛋白生化測定試劑盒（中國長春匯力生物技術有限公司）。

人參（PanaxginsengC.A.Mey.）購自吉林撫松縣萬良人參市場，藜蘆（VeratrumnigrumL.）購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，分別取人參、藜蘆及人參藜蘆（以人參：藜蘆10KG-3∶KG-51比例合用）藥材適量，加10倍體積水浸泡1h，加熱回流提取兩次，每次1.5h，合并提取液，濃縮后凍干，保存?zhèn)溆谩?/p>

Wistar大鼠（中國吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心），實驗動物許可證：SCXK（吉）20130001。

2.2動物實驗

雄性Wistar大鼠隨機分成5組，分別為空白組、模型組、人參組、藜蘆組、參藜組。空白組及模型組給予相同體積蒸餾水，其余各組分別灌胃給予相應藥物，每日1次，連續(xù)15d。

除空白組外，其余各組在給藥同時開始造模[13＼]。造模第1天灌胃50°白酒10mL/kg，第2天以后每天灌胃食醋10mL/kg，同時喂飼體質量5%的硝黃飼料（正常飼料、大黃粉、芒硝，以60KG-3∶KG-51KG-3∶KG-51的比例（質量比）混合均勻，即成），每日下午大鼠背部固定質量約為體質量10%的鐵絲，放入水深50cm、水溫25℃～27℃的水槽中游泳，以力竭為度（大鼠鼻尖沒入水面10s以上），共15d。期間空白組大鼠喂飼正常飼料并進行常規(guī)飼養(yǎng)。

第14d給藥1h后，測定各組大鼠力竭游泳時間，并放入代謝籠中收集24h尿液，離心，

80℃保存?zhèn)溆谩５?5d給藥1h后，麻醉大鼠，腹主動脈取血測定紅細胞、白細胞、血紅蛋白含量。

2.3色譜質譜條件及樣品分析

選用WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）。

色譜條件：A乙腈，B超純水（0.1%甲酸）；梯度洗脫：0～3min，5%～20%A；3～6min，20%～50%A；6～9min，50%～100%A。柱溫：30℃；流速：0.4mL/min，進樣量5μL。

質譜條件：離子源ESI；電離源溫度120℃；錐孔氣為氮氣，流速50L/h；去溶劑氣為氮氣，溫度350℃，流速800L/h。正離子模式下毛細管電壓3.0kV，錐孔電壓35V，提取錐孔電壓5.0V；負離子模式下毛細管電壓2.0kV，錐孔電壓35V，提取錐孔電壓5.0V。

在本實驗中，使用質控樣品（Qualitycontrol，QC）進行方法驗證，用以保證整個分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性。QC樣品是由每個樣品各取100μL混合得到，為降低誤差，樣品檢測為隨機進行。在對樣品進行分析前，為平衡系統(tǒng)先運行5次QC樣品。在樣品的檢測過程中，每檢測5個正常樣品后運行1次QC樣品，以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.4數(shù)據(jù)處理

采用MassLynxV4.1和MarkerLynxApplicationManager對UPLC/QTOFMS檢測得到的數(shù)據(jù)進行峰檢測、峰對齊以及歸一化。使用EZinfo2.0軟件中的PCA和OPLSDA進行多元變量分析。使用SPSS13.0軟件進行組間t檢驗。使用生物學數(shù)據(jù)庫HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、METLIN（http：//metlin.scripps.edu/）和KEGG（http：//www.kegg.com/）進行潛在生物標志物的鑒定和代謝通路的分析。JP

3結果與討論

3.1人參、藜蘆及人參藜蘆配伍合用對脾氣虛模型大鼠力竭游泳時間的影響

游泳耐力下降是脾氣虛證實驗動物模型最顯著的表現(xiàn)之一[14＼]。本實驗結果（表1）顯示，與空白組比較，模型組大鼠力竭游泳時間明顯降低；與模型組比較，人參組大鼠力竭游泳時間顯著延長，藜蘆組無明顯變化，表明人參能夠改善脾氣虛模型大鼠游泳耐力下降的狀況，但與藜蘆配伍合用后在一定程度上降低了這種作用。LM

3.2人參、藜蘆及人參藜蘆配伍合用對ZH（脾氣虛模型大鼠血液中白細胞、紅細胞、血紅蛋白含量的影響

傳統(tǒng)中醫(yī)認為氣在機體內(nèi)具有防御作用，氣不足時會導致臟腑組織功能低下或衰退，其與現(xiàn)代免疫學有著相似之處，現(xiàn)代醫(yī)學認為紅細胞和血紅蛋白下降會影響人體氣體交換，進而影響中醫(yī)氣的生成[14＼]。本實驗結果（表2）表明，與空白組比較，模型組大鼠白細胞、紅細胞及血紅蛋白明顯降低（p<0.01）；與模ZH）型組比較，人參組大鼠白細胞、紅細胞及血紅蛋白均顯著升高（p<0.05，p<0.01），藜蘆組及參藜組大鼠無明顯變化，表明人參可明顯的調(diào)節(jié)脾氣虛模型大鼠血液中白細胞、紅細胞及血紅蛋白含量，但與藜蘆配伍合用后其調(diào)節(jié)作用明顯減弱。

3.3人參、藜蘆及人參藜蘆配伍合用對脾氣虛模型大鼠影響的尿液代謝組學研究

3.3.1尿液代謝輪廓分析采用UPLC/QTOFMS分別在正、負離子模式下對樣本進行分離和數(shù)據(jù)采集。圖1為各組典型的總離子流基峰強度色譜圖（BPI）。

應用主成分分析法（PCA）對QC樣本進行數(shù)據(jù)分析，從圖2可見，正離子和負離子模式下QC樣本與正常尿液樣本能夠明顯分離，且QC樣本之間聚集緊密，進一步驗證了分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

由空白組、模型組、人參組、藜蘆組和參藜組的PCA得分圖（圖3）可見，在正譜或負譜中，空白組、模型組和人參組大鼠尿液代謝物可明顯區(qū)分，說明與正常大鼠比較，脾氣虛模型大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)生了擾動，而人參能夠在一定程度上調(diào)節(jié)這一擾動趨于正常。而藜蘆組和參藜組代謝物與模型組區(qū)分不明顯，說明其對脾氣虛模型大鼠體內(nèi)的代謝擾動沒有調(diào)節(jié)作用或調(diào)節(jié)較小。在PCA及OPLSDA模型中，R2X和R2Y表示模型對于數(shù)據(jù)中自變量X和因變量Y的模擬程度，Q2表示模型對數(shù)據(jù)的預測程度，這兩個值越接近1表示模型越好。其中正離子模式下模型的R2X=0.902，Q2=0.816，負離子模式下模型的R2X=0.897，Q2=0.803。

3.3.2潛在標志物鑒定對人參組和模型組尿樣進行正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）。正離子模式下模型的R2Y=0.913，Q2=0.882，負離子模式下模型的R2Y=0.924，Q2=0.905，說明模式質量良好。如OPLSDA得分圖（圖4A1，4B1）所示，人參組和模型模型組可以明顯區(qū)分。其中遠離原點的化合物為潛在的標志物（如圖4A2，4B2），同時以p>1且有統(tǒng)計學意義的變量（p<0.05）作為標記物的判斷標準，并通過數(shù)據(jù)庫進行質譜信息匹配及標準品串聯(lián)質譜驗證的方法找出15種人參干預脾氣虛大鼠的潛在生物標志物。同時按照上述方法對參藜組尿樣進行了進行正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA），找出了7種人參藜蘆配伍合用后對人參上述調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生影響的潛在生物標志物（表3），并對其相對含量進行了統(tǒng)計分析（圖5）。結果表明，人參對于二氫硫辛酸、3氧肉豆蔻酸、15脫氧Δ12，14前列腺素J2、5羥基N甲酰犬尿氨酸、L谷氨酸、L乳酸、吲哚乙酸等潛在生物標志物具有顯著的調(diào)節(jié)作用，而與藜蘆配伍合用后對上述潛在生物標志物的調(diào)節(jié)作用明顯減弱，提示人參藜蘆配伍合用后可能在一定程度上降低了人參對脾氣虛模型大鼠的干預作用。

3.4生物標志物代謝通路分析

5羥基N甲酰犬尿氨酸（5HydroxyNformylkynurenine）、吲哚乙酸（Indoleaceticacid）是色氨酸代謝LM

通路下游代謝產(chǎn)物[15＼]。其中色氨酸是一種必需氨基酸，在機體中起著至關重要的作用，在能量代謝中是蛋白質合成或分解的中間體[16，17＼]。

通過犬尿氨酸途徑的色氨酸代謝被認為是免疫系統(tǒng)中不斷調(diào)節(jié)病原體和抗原之間平衡的機制之一[18＼]。人參給藥后尿液中5羥基N甲酰犬尿氨酸及吲哚乙酸含量增加，對脾氣虛模型大鼠體內(nèi)色氨酸代謝具有促進作用，間接表明人參對能量代謝具有一定促進作用，此外，Li等[19＼]在對人參總皂苷抗應激作用的代謝組學研究中也發(fā)現(xiàn)人參對5hydroxyNformylkynurenine含量具有調(diào)節(jié)作用，與本研究結果相似。而當人參與藜蘆配伍合用后，尿液中這兩種物質含量有所降低，從而影響了人參的上述促進作用。

3氧肉豆蔻酸（3Oxotetradecanoicacid）、L乳酸（LLacticacid）分別是脂肪酸生物合成及丙酮酸代謝的合成代謝產(chǎn)物[20＼]。脂肪酸在人體中發(fā)揮著重要的生理作用，它通過β氧化直接生成乙酰輔酶A，而糖在體內(nèi)通過糖代謝可生成丙酮酸，也可進一步生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A進入到三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量，三羧酸循環(huán)是能量代謝的重要途徑之一[21～23＼]。人參給藥后尿液中3氧肉豆蔻酸及L乳酸含量增加，加速了脾氣虛模型大鼠體內(nèi)三羧酸循環(huán)，促進了能量代謝，而與藜蘆配伍合用后明顯抑制了這一促進作用。

L谷氨酸（LGlutamicacid）是谷胱甘肽的代謝產(chǎn)物，是機體內(nèi)十分重要的抗氧化劑和自由基清除劑[24＼]。人參能夠增加脾氣虛模型大鼠尿液中L谷氨酸的含量，加速谷胱甘肽代謝，進而起到增強抗氧化作用，而與藜蘆配伍合用后尿液中L谷氨酸的含量，降低了人參的上述作用。

15DeoxyΔ12，14PGJ2是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，花生四烯酸在體內(nèi)能夠起到第二信使的作用，能使腺苷酸環(huán)化酶活化致使細胞內(nèi)cAMP濃度增高。此外，還參與了體內(nèi)造血和免疫調(diào)節(jié)作用[25，26＼]。脾氣虛大鼠經(jīng)人參治療后，15DeoxyΔ12，14PGJ2的含量降低，在一定程度上抑制了花生四烯酸的代謝，表明人參促進了脾氣虛模型大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，而與藜蘆配伍合用后降低了人參對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

4結論

本研究采用UPLCQTOFMS聯(lián)用技術，對人參、藜蘆及人參藜蘆配伍合用后對脾氣虛模型大鼠尿液進行了非靶向代謝組學研究。共鑒定出15種人參干預脾氣虛大鼠的潛在生物標志物，同時在其中找出了7種人參藜蘆配伍合用后對人參上述調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生影響的潛在生物標志物，主要參與體內(nèi)脂肪酸生物合成、花生四烯酸代謝、色氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、丙酮酸代謝等代謝通路。表明人參藜蘆配伍合用后通過影響上述代謝途徑而妨害了人參對脾氣虛模型大鼠增強能量代謝、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等治療作用的發(fā)揮，初步闡明了人參藜蘆配伍禁忌的作用機理。

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AbstractAurinaryuntargetedmetabonomicsmethodbasedonUPLC/QTOFMSwasestablishedtoinvestigatethemechanismofcompatibilityofPanaxginsengandVeratrumnigruminSpleenqideficiencyrat.Spleenqideficiencyratmodelwasestablished，thentheexhaustiveswimmingtimeandthecontentofwhitebloodcells，redbloodcellandhemoglobininthebloodwasdetectedafteradministrationfor15days.TheresultsshowedthatPanaxginsengcouldincreasetheexhaustionswimmingtime（p<0.01）andthecontentofwhitebloodcells，redbloodcellandhemoglobinintheblood（p<0.05，p<0.01）ofspleenqideficiencyrats，andVeratrumnigrumorcompatibleapplicationhadnosignificanteffectindexmentionedabove（p>0.05）.TheurinarymetabolicprofilingwasanalyzedbyusingUPLC/QTOFMSandtheobtaineddatawereanalyzedbyPCA.ThescoreofPCAshowedthattherewassignificantdifferenceamongthemetabolicprofileofdifferentgroups.AccordingtotheresultsofOPLSDAandthedatabases，fifteenpotentialbiomarkerswereidentifiedasthetherapeuticeffectofPanaxginseng，andsevenofthemandtheirpathwayswereconsideredasreducingthetherapeuticeffectofPanaxginsengbycoadministrationwithVeratrumnigrum.TheresultsindicatedthattheeffectofPanaxginsengonpromotingenergymetabolism，regulatingimmuneandantioxidationinthespleenqideficiencyratsweredecreasedafterthecompatibilityofPanaxginsengandVeratrumnigrum.

KeywordsPanaxginseng；Veratrumnigrum；Incompatibility；Spleenqideficiency；Untargetedmetabonomics

HQWT6JY（Received24March2016；accepted12August2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalBasicResearchProgramofChina（973Program）（Nos.2011CB505300，2011CB505305）