低聚葡萄籽原花青素聯合順鉑對A549細胞增殖及細胞周期的影響

王 海，連燕娜，高麗萍*

（北京聯合大學應用文理學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100083）

低聚葡萄籽原花青素聯合順鉑對A549細胞增殖及細胞周期的影響

王 海，連燕娜，高麗萍*

（北京聯合大學應用文理學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100083）

目的：探討低聚葡萄籽原花青素（oligomer grape seed proanthocyanidins，O-GSP）聯合順鉑（cisdichlorodiamineplatinum(Ⅱ)，DDP）對A549細胞增殖、細胞周期及細胞周期相關蛋白表達的影響。方法：體外培養A549細胞，四甲基偶氮唑藍法檢測DDP和O-GSP單獨及聯合用藥對A549細胞存活率的影響；流式細胞儀檢測O-GSP聯合DDP對A549細胞周期的影響；Western Blot檢測促細胞周期相關蛋白CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達。結果：DDP（≥5 mg/L）和O-GSP（≥16 mg/L）單獨用藥均對A549細胞增殖有抑制作用，且兩者同時作用對細胞增殖抑制具有聯合作用。5 mg/L DDP單獨用藥可以于S期阻滯A549細胞，4 mg/L O-GSP單獨用藥可以于G0/G1期阻滯A549細胞，兩者聯合可顯著降低細胞周期調控蛋白CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達（P＜0.05）。結論：O-GSP可以聯合DDP抑制A549細胞增殖，且這種聯合作用與Cyclin D1-CDK 4-Rb通路介導的細胞周期調控有關。

低聚葡萄籽原花青素；順鉑；細胞增殖；細胞周期

肺癌是目前世界上發病率和死亡率極高的癌癥之一，給人類的健康和生命帶來了極大的威脅[1]。非小細胞肺癌患者占總肺癌患者的80%左右。與小細胞肺癌相比，由于非小細胞肺癌細胞生長分裂較慢，擴散轉移相對較晚，診斷時多處于中晚期，錯過了手術最佳治療時機，因此化療成為其主要治療方式。自1978年被美國食品藥品監督管理局批準使用以來[2]，順鉑（cisdichlorodiamineplatinum(Ⅱ)，DDP）已成為臨床上應用最廣泛的抗腫瘤藥物之一，在多種癌癥的治療中取得了顯著的療效，如乳腺癌、肝癌、卵巢癌等[3-5]。DDP對肺癌的化療效果也得到國內外一致認可[6]。但隨著DDP的大量使用，患者也出現了明顯的耐藥性和毒副作用，如腎毒性、肝毒性和耳毒性等[7-9]。

葡萄籽原花青素是指從葡萄籽中提取的、由不同數量的結構單體（兒茶素、表兒茶素或表兒茶素沒食子酸酯）縮合而成的聚合體的混合物[10]，具有抗腫瘤、抗炎、抗輻射、保護心血管系統、抗衰老等廣泛的藥理學作用[11-14]，尤其在抗腫瘤研究方面近年來備受關注，已有研究結果顯示原花青素對多種癌細胞都有不同程度的抑制作用[15]。葡萄籽原花青素中活性較強的是聚合度≤4的低聚葡萄籽原花青素（oligomer grape seed proanthocyanidins，O-GSP）[16]。

本課題組前期研究結果表明，O-GSP對DDP所致的腎毒性、心肌毒性和生殖毒性具有很好的保護作用[17-19]，但O-GSP與DDP是否具有聯合抗癌作用至今鮮見報道，因此本研究初步探討了O-GSP聯合DDP對A549細胞增殖及細胞周期的影響，以期為臨床上聯合化療藥物的使用提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌細胞（A549）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院細胞中心。

DDP（批號：406022CF）、注射用凍干粉劑 齊魯制藥有限公司；O-GSP（原花青素純度≥95%，色譜級，其中二聚體純度≥60%、原花青素B2純度≥4%） 天津尖峰天然產物研究開發有限公司；杜氏改良Eagle培養基：營養混合物F-12（Dulbecco’s modif i ed Eagle medium: nutrient mixture F-12，DMEM/F12）培養基、0.25 g/100 mL胰酶、細胞周期試劑盒 美國G e n v i e w公司；胎牛血清 美國Hycolon公司；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司；Phospho-Rb抗體、Cyclin D1抗體 碧云天生物技術有限公司；CDK 4抗體 中杉金橋生物技術有限公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記上樣抗兔（鼠）免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

酶標儀 美國Bio-Tek公司；FACS Calibar流式細胞儀 美國BD公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

② 劉堅,曹廣順,吳福祥.論誘發漢語詞匯語法化的若干因素[J].中國語文,1995.(3).第161-168頁.

1.3.1 O-GSP和DDP單獨使用對A549細胞增殖的影響

將100 μL（1×105個/mL）處于對數生長期的細胞接種到96 孔板中，待細胞生長至融合狀態時，棄原培養液，分別單獨加入100 μL含0、5、7.5、10、15、20、25、30 mg/L DDP或0、4、8、16、32、64、128 mg/L O-GSP的無血清培養基，其中對照組的培養基中不加O-GSP或DDP，每組設 6 個復孔，在 37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的孵育培養箱中培養24 h后，用酶標儀于570 nm波長處測定吸光度（A）。按照公式（1）計算細胞存活率。

式中：A實驗組為各加藥組的吸光度；A對照組為對照組的吸光度。

1.3.2 O-GSP與DDP聯合作用對A549細胞增殖的影響

將100 μL（1×105個/mL）處于對數生長期的細胞接種到96 孔板中，待細胞生長至融合狀態時，將細胞分為對照組、單獨用藥組和聯合用藥組，按照預設濃度加藥，聯合用藥組DDP質量濃度分別為0、5、10 mg/L，O-GSP質量濃度分別為0、4、8 mg/L。每組設6 個復孔，在 37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的孵育培養箱中培養24 h后，測定細胞存活率。按照公式（1）計算細胞存活率。

1.3.3 O-GSP與DDP聯合作用對A549細胞周期的影響

將2 mL（5×104個/mL）處于對數生長期的細胞接種到6孔板中，待細胞生長至融合狀態時，對各處理組進行藥物處理。細胞分為對照組、DDP組、O-GSP組和DDP+O-GSP組。除對照組，其余各組中DDP質量濃度為5 mg/L，O-GSP質量濃度為4 mg/L。在 37 ℃、含 5% CO2和飽和濕度的孵育培養箱中培養24 h，收集細胞后，按照試劑盒說明用70%乙醇4 ℃固定24 h，PI染色后用流式細胞儀進行檢測分析。

1.3.4 O-GSP與DDP聯合作用對A549細胞周期蛋白表達的影響

按照1.3.3節的方法對細胞進行分組處理后，每孔加入細胞裂解液200 μL，10 000 r/min離心10 min，BCA法測定總蛋白濃度，然后加入5×上樣緩沖液，沸水浴10 min使蛋白變性。12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）后，轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉印膜上，5%脫脂牛奶封閉75 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育75 min后，在凝膠成像系統曝光，按照公式（2）計算細胞周期相關蛋白CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的相對表達量。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 O-GSP和DDP單獨用藥對A549細胞增殖的抑制作用

圖1 DDP對A549細胞增殖的抑制作用（n＝5）Fig. 1 Inhibitory effect of DDP on A549 cells (n=5)

由圖1可知，隨著DDP質量濃度的升高，A549細胞存活率逐漸降低，當DDP質量濃度高于25 mg/L時，所測吸光度不再隨DDP質量濃度的升高而顯著降低。通過SPSS軟件計算，DDP對A549細胞的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值為10.68 mg/L。

n＝5）Fig. 2 Inhibitory effect of O-GSP on A549 cells (n = 5)圖2 O-GSP對A549細胞增殖的抑制作用（

由圖2可知，當O-GSP質量濃度＜16 mg/L時，O-GSP對A549細胞存活率無顯著性影響（P＞0.05）。當O-GSP質量濃度≥16 mg/L時，A549細胞存活率顯著低于對照組（P＜0.05），說明O-GSP達到一定質量濃度時能夠顯著抑制A549細胞的增殖。

2.2 O-GSP與DDP聯合用藥對A549細胞增殖的抑制作用

表1 O-GSP與DDP聯合用藥對A549細胞存活率的影響（n＝5）Table 1 Effect of co-treatment with O-GSP and DDP on A549 cell survival (n= 5)

表2 析因分析結果Table 2 Results of factorial analysis

由表1可知，DDP單獨用藥于A549細胞時，能夠抑制A549細胞的增殖，使細胞存活率顯著降低（P＜0.05）。由表2可知，當O-GSP和DDP共同作用于A549細胞時，其兩者的互作效應對A549細胞的存活率也有顯著性影響（P＜0.05），結合表1中A549細胞存活率的變化，可知O-GSP和DDP對A549細胞增殖的抑制具有聯合作用。DDP對A549細胞的1/2 IC50約為5 mg/L，且O-GSP質量濃度≥4 mg/L時，可以顯著增強DDP對A549細胞的抑制作用，當DDP質量濃度為5 mg/L，O-GSP質量濃度為4 mg/L時，A549細胞存活率為（51.0±6.3）%，最接近50%。加藥后細胞存活率太低，則在后期細胞進行流式檢測時，細胞碎片太多，影響檢測；細胞存活率太高，則較難檢測出細胞損傷，因此選用此質量濃度用于后續實驗。

2.3 O-GSP與DDP聯合用藥對A549細胞周期的影響

圖3 O-GSP與DDP聯合用藥對A549細胞周期的影響Fig. 3 Effect of O-GSP combined with DDP on the cell cycle of A549 cells

表3 O-GSP與DDP聯合用藥對細胞周期中A549細胞比例的影響（n＝5）Table 3 Effect of O-GSP combined with DDP on cell populations at different cell cycle phases (n= 5)

在細胞周期中，G0/G1期細胞的DNA含量為2 N（N：染色體組數，下同），含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的DNA含量為4 N，而正在進行DNA復制的S期細胞的DNA含量理論上應在2～4 N之間。因此，可根據細胞中DNA含量的分布情況進行細胞周期分析。如圖3和表3所示，與對照組細胞相比，DDP組G0/G1期細胞比例顯著減少，S期細胞比例顯著增大（P＜0.05），說明DDP可將細胞周期阻滯在S期。而O-GSP組與對照組相比G0/G1期細胞比例顯著增大，S期細胞比例顯著減少（P＜0.05），說明O-GSP可將細胞周期阻滯在G0/G1期。DDP與O-GSP同時作用于A549細胞后，G0/G1期細胞與DDP組相比顯著增多，S期細胞比例與O-GSP組相比顯著增加，G2/M期細胞比例與對照組相比顯著減少（P＜0.05）。說明O-GSP聯合DDP作用后，既可以對A549細胞形成G0/G1期阻滯，又能形成S期阻滯，最終誘導細胞凋亡。

2.4 O-GSP與DDP聯合用藥對A549細胞周期蛋白表達的影響

為進一步證明O-GSP和DDP聯合用藥對A549細胞的周期阻滯作用，使用Western Blot分別檢測促細胞周期相關蛋白CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達。如表4所示，與對照組相比，DDP單獨用藥后，CDK 4和Cyclin D1蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），而p-Rb的表達量顯著升高（P＜0.05）。O-GSP單獨用藥后，CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達量均顯著降低（P＜0.05）。而DDP與O-GSP同時用藥后，與對照組相比CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達量均顯著降低（P＜0.05）；與DDP組相比，Cyclin D1和p-Rb的表達量顯著降低（P＜0.05）；與O-GSP組相比，Cyclin D1蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。說明O-GSP與DDP聯合阻滯A549細胞周期可能與Cyclin D1-CDK 4-Rb通路介導的細胞周期調控有關。

表4 O-GSP與DDP聯合用藥對A549細胞周期蛋白表達的影響（n＝5）Table 4 Effect of O-GSP combined with DDP on the expression levels of cell cycle-related proteins in A549 cells (n= 5)

3 討 論

本課題組前期研究結果表明，O-GSP質量濃度為16 mg/L時，對DDP誘導的HEK293細胞損傷的保護作用最佳，與DDP損傷組有顯著性差異（P＜0.05）[20]。氧化應激是DDP造成腎毒性的主要原因，DDP含有的親核氨基能夠與水分子作用生產大量的自由基，造成線粒體的氧化損傷，功能喪失。另一方面，DDP可誘發機體抗氧化水平降低，DDP可通過直接或間接與GSH結合而引起細胞內GSH耗竭，同時還可抑制谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶等的活力，使細胞內抗氧化能力減弱而引發氧化應激[21]。O-GSP拮抗DDP腎細胞損傷的機制可能與其拮抗DDP所致腎細胞氧化應激反應和線粒體損傷有關[19]。而O-GSP與DDP聯合抗腫瘤機制還有待于進一步探討。

DDP抗腫瘤作用機制主要是DDP進入細胞后，氯原子能夠被水分子取代形成活化狀態。活化后的DDP與DNA分子嘌呤堿的N7活性中心結合形成DNA鏈內或鏈間加合產物，從而造成癌細胞DNA損傷，最終誘導細胞凋亡[22]。O-GSP屬于植物多酚類物質，研究表明，O-GSP具有很好的抗腫瘤作用，其作用機制包括促進腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期、降低腫瘤細胞轉移和擴散等[23-25]。本研究結果表明，單獨使用O-GSP和DDP均可抑制A549細胞的增殖，且兩者聯用時對A549細胞增殖抑制具有聯合作用。

細胞周期調控在細胞增殖和凋亡中起重要的作用。細胞周期可分為 G0/G1、S、G2/M 3 個階段，其中在G1期與G2期細胞進行RNA的復制與有關蛋白質的合成，S期進行DNA的復制[26]。S期阻滯可以為細胞的受損DNA修復提供充足的時間，當損傷DNA超過細胞的修復或耐受極限時，S期檢驗點的關卡功能靈敏度就會降低，最終由于細胞內DNA損傷不能得到有效修復而導致細胞凋亡或死亡。有研究結果顯示DDP可以使細胞產生S期阻滯，當用其他藥物去除S期阻滯后，可增加DDP的毒性[27]。因此推測S期阻滯與癌細胞對DDP的耐藥存在一定關系。本研究結果表明，DDP單獨用藥可以引起A549細胞S期阻滯，而O-GSP單獨用藥可以引起A549細胞G0/G1期阻滯，兩者聯用后既可以對A549細胞形成G0/G1期阻滯，又能形成S期阻滯。提示DDP和O-GSP對細胞周期的聯合阻滯作用進一步抑制了細胞增殖。

細胞周期的調控有外源性和內源性調控，外源性調控主要是由外界刺激引起的，在細胞周期內源性調控中，細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）具有關鍵性的調控作用[28]。Cyclin D1蛋白被認為是一種原癌基因表達的蛋白，在人類多種腫瘤組織中高表達或有突變。Rb是一種抑癌基因表達的蛋白，可以通過調控細胞周期G1期的檢驗點來調節細胞增殖。Rb蛋白的活性通過其磷酸化水平來調控。Cyclin D1-CDK 4-Rb通路在調控細胞周期的過程中起到關鍵作用[29]。Cyclin D1和CDK 4結合形成復合物后，能夠使Rb蛋白磷酸化形成p-Rb，進而促進S期所需基因的轉錄，使細胞由G0/G1期轉化到S期[30]。本研究結果顯示，DDP雖然可以使A549細胞中Cyclin D1和CDK 4蛋白水平下降，但卻使p-Rb蛋白水平升高，促進了細胞由G0/G1期向S期轉化。由于DDP又能形成DNA損傷，DNA復制過程受阻，從而使細胞形成了S期阻滯。與對照組相比，O-GSP單獨用藥后可以使Cyclin D1、CDK 4和p-Rb的蛋白表達水平均顯著降低，細胞形成G0/G1期阻滯。而DDP與O-GSP聯合用藥后，Cyclin D1、CDK 4和p-Rb蛋白表達水平降低幅度更大，說明O-GSP降低了DDP引起的p-Rb蛋白表達水平的升高。然而，DDP升高p-Rb蛋白表達水平的通路以及此通路與Cyclin D1-CDK 4-Rb通路的關系還有待進一步研究。

綜上，本研究顯示，O-GSP與DDP聯合作用可以增強DDP對A549細胞的殺傷作用，且這種聯合作用與Cyclin D1-CDK 4-Rb通路介導的細胞周期調控有關。該研究可為臨床上化療聯合用藥提供一定的參考。

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Effect of Oligomeric Proanthocyanidins from Grape Seeds Combined with Cisplatin on A549 Cell Proliferation and Cell Cycle

WANG Hai, LIAN Yanna, GAO Liping*
(Beijing Municipal Key Laboratory of Biologically Active Substances and Functional Food, College of Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100083, China)

Objective: To investigate the effect of oligomeric proanthocyanidins from grape seeds (O-GSP) combined with cisplatin (DDP) on the proliferation, cell cycle and cell cycle-related protein expression of A549 cells. Methods: A549 cells were cultured in vitro. The effects of DDP and O-GSP alone and in combination on the survival rate of A549 cells were observed by MTT assay; the combined effect of O-GSP and DDP on the cell cycle of A549 cells was detected by fl ow cytometry and the expression levels of the cell cycle-related proteins CDK 4, Cyclin D1 and p-Rb were detected by Western blot. Results: DDP (≥ 5 mg/L) and O-GSP (≥16 mg/L) treatments alone could inhibit A549 cell proliferation. The combined treatment had a synergistic effect on the inhibition of cell proliferation. DDP treatment alone at 5 mg/L arrested A549 cells at S phase and O-GSP at 4 mg/L arrested the cells at G0/G1phase. The combination of DDP at 5 mg/L and O-GSP at 4 mg/L significantly reduced the expression levels of the cell cycle regulatory proteins CDK 4, Cyclin D1 and p-Rb. Conclusion: DDP can inhibit the proliferation of A549 cells in combination with O-GSP through a mechanism related to the regulation of cell cycle progression mediated by the Cyclin D1-CDK 4-Rb pathway.

oligomeric proanthocyanidins from grape seeds; cisplatin; cell proliferation; cell cycle

10.7506/spkx1002-6630-201707034

Q946.8

A

1002-6630（2017）07-0213-06

王海, 連燕娜, 高麗萍. 低聚葡萄籽原花青素聯合順鉑對A549細胞增殖及細胞周期的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(7): 213-218. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707034. http://www.spkx.net.cn

WANG Hai, LIAN Yanna, GAO Liping. Effect of oligomeric proanthocyanidins from grape seeds combined with cisplatin on A549 cell proliferation and cell cycle[J]. Food Science, 2017, 38(7): 213-218. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707034. http://www.spkx.net.cn

2016-04-12

北京市自然科學基金資助項目（7163211）

王海（1992—），男，碩士研究生，研究方向為生物活性物質對機體的生化作用。E-mail：916319176@qq.com

*通信作者：高麗萍（1962—），女，教授，博士，研究方向為生物活性物質對機體的生化作用。E-mail：gaolip62@163.com