miRNAs在植物色澤調控中的研究進展

王榮+魏夢苒+趙大球

摘要：色澤是影響植物外觀品質及其商品價值的重要因素，目前關于植物色澤的研究主要集中于生理生化及轉錄水平上，而在轉錄后水平上報道較少。microRNA（miRNA）是一類在真核生物中廣泛存在的非編碼單鏈RNA分子，它可以通過對靶標mRNA的互補配對而降解或抑制mRNA的翻譯，從而在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控。簡述了miRNA的作用機理，并對近幾年miRNA在植物色澤調控中的研究進展進行了綜述，以期為植物色澤在轉錄后水平上的調控奠定基礎。

關鍵詞：色澤；miRNA；花青素；類胡蘿卜素

中圖分類號：Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1001-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.001

Abstract： Color is an important factor that influences the appearance quality of plants and their commodity value. Current studies on plant color are mainly focused on the physiological， biochemical and transcription level， while the post-transcriptional level is rarely reported. MicroRNAs （miRNAs） are short regulatory non-coding RNAs that guide gene silencing in most eukaryotes. They regulate gene expression by triggering sequence-specific cleavage or translational repression of target transcripts. This review briefly describes the mechanism of miRNA， and summarizes the advances on miRNAs in plant colors regulation， which would lay the foundation for the regulation of plant color in the post-transcriptional level.

Key words： color； miRNA； anthocyanin； carotenoid

色澤對于植物而言至關重要，它不但影響植株的外觀品質，而且直接關系到其商品價值[1]。植物色澤是由多種因素共同作用形成的，其中色素的種類及其含量最為重要[2]，主要包括葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿等四大類物質[3]。在這些物質中，類黃酮是最重要的色素類群，產生的顏色范圍最廣，可以從淺黃色到藍紫色，是眾多觀賞植物的主要呈色色素。作為類黃酮色素群的主要種類，花青素在植物色澤形成中起著不可替代的作用，其呈色范圍很廣，并且相較于其他色素而言研究得較為透徹[4]。

目前，對于植物色澤的研究主要集中在轉錄水平上。以調控花青素來影響植物色澤為例[5，6]，通過相關研究目前已經明確植物花青素的生物合成途徑，主要受到結構基因和調節基因共同調控[7]。其中，結構基因直接通過編碼相關酶來調控花青素的合成，而調節基因是通過轉錄因子（MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白[8]）調節結構基因的表達來影響色澤[9]。關于這方面的研究進展在很多綜述中均已被提及[10，11]。隨著現代分子生物學技術的快速發展，人們發現在轉錄后水平上microRNA（miRNA）對植物色澤形成具有不可替代的調控作用[12]，尤其是在花青素的生物合成方面，它通過負調控與花青素合成有關的轉錄因子等的轉錄或翻譯，抑制靶基因的表達，進而調控植物色澤[13]。目前，關于miRNA在植物色澤調控方面的研究進展一直未見報道，為此，本研究擬以花青素為突破口，對miRNA調控植物色澤的相關研究進行綜述，以期為植物色澤在轉錄后水平上的調控奠定基礎。

1 miRNA的作用機理

miRNA是生物體內長度為21或22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，其主要和轉錄因子通過相互協作來調節下游目標基因的表達[14]，在調節基因表達轉錄后水平和植物開發中起著重要的作用[15]。目前miRNA在許多生物過程都發揮著重要作用，特別是在癌癥診斷和治療方面，被人們認為是潛在的目標和生物標志物[16]。而與人體、動物相比，植物miRNA研究相對較少，主要集中于擬南芥、水稻等已經完成全基因組測序的模式植物上[17]，而研究方向也多集中于植物抗逆方面[18，19]。與動物有所不同，植物miRNA與靶位點的匹配程度更高，因此不僅可以通過阻止核糖體在mRNA上移動來抑制基因表達，還可以通過對mRNA進行降解、阻止mRNA的翻譯來調控基因的表達。研究表明，一個miRNA可以調控上百個靶基因[20-23]，并且已知的植物miRNA顯示了很強的靶向轉錄因子家族成員或其他控制發育基因的偏性[24-26]，其在植物生長發育、生殖分化和抵抗逆境脅迫中都發揮著顯著作用。此外，miRNA的表達還存在著基因型和組織部位的差異性[27]，不同的miRNA在植物根[28，29]、莖葉[30-35]、花發育[36-39]以及器官極性與分化[40-43]中的作用并不一致。

2 miRNA對花青素合成的調控

研究表明，miRNA對于植物色澤具有一定的調控作用，并且相關研究主要集中于花青素生物合成調控，目前已報道的miRNA家族有miR156、miR828、miR858、miR165/166和miR778，并且不同家族對花青素生物合成的調控機制各異[23，44-48]。miR156通過靶向SPL轉錄因子對花青素的生物合成起著負調控作用[44]；miR828通過介導調控靶基因TAS4，在缺磷條件下對PAP1/MYB75、PAP2/MYB90和MYB113的表達進行調控，進而影響花青素的積累[45]；miR858通過靶向MYB12參與花青素合成的調控[46]；miR165/166對花青素的合成具有負向調控的作用[47]；過量表達的miR778在缺磷條件下會促進花青素的積累[48]。下面著重對這幾類miRNA家族進行重點綜述，以利于今后對植物色澤的研究。

2.1 miR156

miR156長度為20個核苷酸，最早在擬南芥中被發現[23]，它被認定為是最保守的miRNA，在單子葉植物、雙子葉植物、蕨類植物和苔蘚植物中均存在[49]。miR156的靶基因為SPL轉錄因子[50]，在擬南芥中共發現17個SPL轉錄因子成員，其中11個是miR156的靶基因[51，52]。Gou等[44]研究發現在擬南芥中miR156的靶向基因SPL9負向調控花青素的合成，SPL9與PAP1蛋白相互作用，進而影響MYB-bHLH-WD40復合體的轉錄激活活性，從而抑制了花青素生物合成基因ANS和DFR等的表達[53]。Yan等[54]研究發現miR156通過靶向SPL9轉錄因子對MYB基因進行負調控，從而阻止了花青素的積累。此外，Franco-Zorrilla等[55]和Gou等[44]分別通過構建miR156過量表達載體和沉默表達載體轉化擬南芥植株來研究miR156在花青素合成中的功能。結果顯示，過量表達植株的花青素含量提高了4倍，而沉默表達植株的花青素含量僅為對照的1/10，這充分表明miR156可以通過調控花青素含量的積累來影響植物色澤。

2.2 miR828

外芥糖誘導花青素合成異常的突變體的 miR828是最初通過深度測序在擬南芥中發現的新miRNA[56，57]，目前在楊樹、大戟科植物中都有發現[58]。目前有關miR828生物學功能方面的研究雖然剛剛起步，但miR828在調控植物花青素合成方面的功能已經明確。在擬南芥中，miR828介導調控的靶基因TAS4與花青素合成有關，miR828能夠誘發TAS4轉錄本的剪切，進而調控下游靶基因所編碼的MYB轉錄因子以調控花青素的合成[57，59]。Yang等[60]研究發現野生擬南芥植株中花青素含量比miR828轉基因植物高2.5倍，這表明miR828抑制體內花青素的合成。謝燁等[61]發現miR828過表達擬南芥植株中蔗糖誘導的花青素積累比野生型少，其作用效果與miR828的靶基因TAS4導致花青素積累量高的結果一致，miR828負調控花青素合成。Luo等[62]通過蔗糖誘導花青素合成表型，建立了一種篩選擬南芥糖誘導花青素合成異常突變體的方法，從T-DNA插入突變體庫中篩選出一個新的miR828功能缺失的突變體，并通過構建miR828過表達株系證明miR828能夠在蔗糖誘導下負調控花青素的合成。此外，賈小云等[63]從模式植物擬南芥中分離到pri-miR828基因，在番茄植株過表達導致其靶基因myb-like1轉錄因子表達量和花青素含量降低，表明miR828可能通過類似的機制參與擬南芥和番茄植株體內花青素合成途徑的調控。

2.3 miR858

miR858也是近來發現生物功能還未完全探究的miRNA[64]，同時在番茄、葡萄和擬南芥中均獲得了其靶基因MYB12，而MYB12對花青素的合成具有重要調控作用[65-67]。在番茄中，Ballester等[68]通過病毒介導的MYB12基因沉默使果實變為粉紅色，結果顯示在果皮中的MYB12表達量與所有類黃酮物質的表達量均相關。在葡萄中，Matus等[69]發現MYB12基因表達量的下降直接導致黃酮醇含量的減少。而在擬南芥中，Mehrtens等[67]使用高效液相色譜法比較分析了MYB12過量表達植株和MYB12缺失表達植株，發現MYB12過量表達植株中類黃酮物質含量較高，而MYB12功能缺失突變體的植株中類黃酮物質含量較少，通過進一步的研究表明，MYB12是調控CHS和FLS的轉錄調控因子，而這兩個基因對黃酮醇合成起著不可或缺的作用，由此可以推測，miR858可以通過調控黃酮醇的合成來影響花青素的含量，進而影響色澤。此外，沈潔[64]對T1代miR858減低表達轉基因番茄植株進行了研究，結果顯示，miR858較對照野生型下調表達的同時，其靶基因MYB12和Sly-myb-like上調表達，與花青素合成有關的酶基因也均上調表達，花青素含量增加。

2.4 miR165/166

與miR828家族類似，miR165/166也是通過其靶基因調控花青素代謝中的關鍵酶基因來影響花青素的合成。而目前研究miR165/166家族對花青素的調控作用主要是利用STTM（Short tandem target mimic）技術構建miRNA功能缺失突變體來進行。這種技術是在TM（Target mimic）技術的基礎上，將miRNA sponge和同源性競爭RNA相結合創立的一種新技術，其能夠有效抑制miRNA活性，使miRNA的沉默效率達到95%以上[70]。Tang等[47]通過STTM技術沉默了擬南芥葉片內源的miR165/166，發現與花青素生物合成有關的一些基因大量表達，從而引起植株體內的花青素含量顯著增加，色澤發生改變。這表明miR165/166基因主要是通過負向調控花青素的生物合成來影響植物色澤。

2.5 miR778

miR778同樣是在擬南芥中通過高通量測序被確定的[71，72]，Hsieh等[45]利用小RNA深度測序的方法研究發現在擬南芥中miR778在低磷脅迫下上調表達。此外，Wang等[48]發現在缺磷條件下，miR778不僅能夠適度增強主根和側根的生長，還能促進花青素的積累，轉miR778擬南芥植株中積累的花青素含量比野生型株高1.9倍，相反地，構建使miR778沉默表達的MIM778轉基因擬南芥植株積累的花青素含量與野生型植株并無差別，這也證明了在磷不足的條件下，過量表達的miR778能夠促進花青素的積累。

3 miRNA對其他色素合成的調控

與調控花青素的合成相比，miRNA在調控其他色素合成上的研究較少。Xu等[73]通過使用Illumina公司測序方法來識別和定量紅色果肉甜橙突變體及其野生型miRNA，發現51個與甜橙轉錄調控、蛋白質修飾和光合作用相關的miRNA顯著調節番茄紅素等類胡蘿卜素含量，其中miR1857的差異表達可能是引起突變體中番茄紅素的異常積累，從而改變了果肉的顏色。此外，He等[74]發現擬南芥在低氮環境條件下，miR826和miR5090高表達植株生長更快，能夠積累更多的葉綠素。

4 展望

色澤作為植物的一個重要性狀，目前關于其形成機理研究在生理生化和轉錄水平上已經較為透徹，而在轉錄后水平上探知較少。隨著現代基因工程技術的快速發展，利用miRNA調控植物色澤已成為一個研究熱點。經過研究者的不懈努力，在miRNA調控植物色澤上雖然取得了一定的成果，但這些研究主要集中于擬南芥等模式植物上，而針對觀賞植物開展的研究并不多見，因此miRNA調控觀賞植物色澤方面的研究還有待加強。與此同時，隨著miRNA在植物上的研究越來越多，很多問題也接踵而至。例如，miRNA與靶基因兩者之間并不是完全互補匹配，因此對預測的靶基因需要開展一系列的驗證工作。此外，雖然植物miRNA相比動物而言更具保守性，但不同植物中存在大量自身特異的miRNA，這些miRNA急待被發現，而這都將依賴于日后更為深入的研究。

綜上所述，利用miRNA調控植物色澤的研究方興未艾，層出不窮的新方法、新手段將為今后深入研究提供可靠的技術支撐。前人在模式植物上開展的miRNA調控色澤研究為今后在觀賞植物上的研究提供了大量參考。相信在不久的將來，利用miRNA技術在轉錄后水平上定向地改造植物的色澤、甚至創造出自然界中不存在的珍稀色澤品種都將成為可能。

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