口蹄疫病毒直接實時熒光RT—qPCR檢測方法的建立

吳曉衛+翟建新+杜維+鐘文楊+張利

摘要：根據口蹄疫病毒VP1基因保守序列，設計出1對口蹄疫病毒引物FMD-F、FMD-R及特異性探針FMD-Pb序列，建立了一種簡便、快速、高效的口蹄疫病的直接實時熒光RT-qPCR（dRT-qPCR）檢測方法。結果表明，在特異性方面，對口蹄疫病毒7個血清型的檢出率100%；在靈敏度方面，其與常規提取RNA方法對比，陽性檢出率差別很小；在對133份未知樣本檢測方面，dRT-qPCR方法檢出陽性88份，常規方法檢出陽性84份。dRT-qPCR方法的檢測結果更可靠，適于對大量樣本進行檢測。

關鍵詞：口蹄疫病毒；直接實時熒光RT-qPCR；特異性；診斷檢測

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1165-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.043

Abstract：According to the Foot-and-Mouth disease virus （FMDV） VP1 gene conserved sequence，primers （FMD-F， FMD-R） and specific probe（FMD-Pb） were designed respectively. FMDV was detected fast and conveniently by directly real-time quantitative reverse transcriptase fluorescence PCR（dRT-qPCR）. The results showed that the detection rate of 7 serotype of FMDV by dRT-qPCR was 100%. Moreover， there wasnt significantly difference between dRT-qPCR and conventional method. In the unknown-sample-detection， by dRT-qPCR method， 88 positive samples could be detected in the 133 unknown samples， while only 84 positive samples were detected by conventional method. dRT-qPCR method， with rapid， accurate， specific and sensitive advantage， can be used for the diagnosis detection and real-time monitoring of FMDV.

Key words：Foot-and-Mouth disease virus； directly real-time quantitative reverse transcriptase fluorescence PCR（dRT-qPCR）； specificity； diagnosis detection

口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）是口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）的病源體，能夠感染豬、牛、羊等偶蹄獸引起急性、烈性、接觸性傳染病[1]。研究表明，感染口蹄疫病毒的牲畜常呈現進食量下降，機體抵抗力和免疫力降低，并容易繼發其他病毒性疾病和細菌性疾病，從而造成受感染動物的生產性能下降，危害畜牧業正常生產和發展[2]。世界動物衛生組織（OIE）將口蹄疫列為必須報告的動物傳染病，中國將其歸為一類動物疫病[3]。

FMDV共有7個血清型，即C型、A型、O型、 Asia Ⅰ型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型和SAT Ⅲ型，每個血清型又有許多不同的亞型，且各血清型之間沒有交叉性免疫，同一血清型的各亞型之間僅有部分交叉免疫，使得口蹄疫的診斷和控制更加困難[4]。目前，口蹄疫病毒感染的特異性診斷技術包括病原學、免疫學、分子生物學等6種方法[5]，即病毒分離法、血清學檢測技術、免疫熒光法、酶聯免疫吸附（ELISA）以及反轉錄聚合酶鏈式反應（Quantitative reverse transcriptase PCR，RT-qPCR）和基因芯片技術。病毒的分離培養、血清學檢測、免疫熒光法、酶聯免疫吸附（ELISA）法存在耗時長、陽性檢出率低、敏感性較差、不易標準化等缺點[6]，在實際應用中具有一定的局限性，無法滿足大量樣本的快速診斷。反轉錄聚合酶鏈（RT-qPCR）的檢測技術需要提取病毒RNA，再進行qPCR擴增和后續產物處理，在處理痕量樣本上，提取病毒RNA過程容易發生RNA降解或交叉污染等事件，仍存在較大困難，無法高通量、低成本、高效率地快速檢測[7]。基因芯片技術對引物探針設計要求非常高，成本消耗大、結果假陽性率偏高、重復性差等缺陷，并且現有的基因芯片技術不及其他檢測技術[8]。

本研究采用直接擴增反轉錄聚合酶鏈（directly Quantitative reverse transcrip-tase PCR，dRT-qPCR）的檢測技術，直接將樣本加入反應管內進行檢測，達到快速、準確檢測口蹄疫病毒的目的，同時可以節省成本和降低交叉污染的風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

口蹄疫A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個血清型的病毒株，均為滅活的細胞培養毒，-80 ℃冰箱保存備用。待測牛血清樣品44份、牛皰疹液樣品28份、豬血清樣品22份、豬皰疹液樣品19份共計113份田間樣品，-80 ℃冰箱保存。所有材料均為深圳市某衛生監督所贈送的口蹄疫樣品，樣品保存于澳東檢驗檢測科技有限公司研發實驗室-80 ℃冰箱。

1.2 引物探針設計

參考GenBank數據庫中的4 000余條口蹄疫病毒的VP1基因序列，選擇口蹄疫病毒VP1基因序列作為檢測的擴增區域。使用NCBI網站上的BLAST工具、DNAStar、PrimerExpress等軟件以及自行設計編寫的分析軟件設計特異性的引物和探針序列，分析引物之間的相互作用，優化和篩選引物探針組合，最大限度減少反應中二聚體的產生，以保證試劑的高特異性、高靈敏度和高基因型覆蓋率。

設計的引物探針包括上游引物FMD-F、下游引物FMD-R、探針FMD-Pb。其中探針FMD-Pb 5′端標記有FAM熒光報告基團，3′端標記有BHQ1熒光淬滅基團。設計的引物探針交由上海基康生物技術有限公司合成，序列如表1所示。

1.3 樣本處理

采用直接擴增技術，不需要對核酸樣本進行提取純化。取一定量血清樣本加入3倍體積的甲醇，混勻后靜置5 min，于3 000 r/min離心15 min，取上清液備用；水皰疹液樣本，直接將采集的水皰疹液，于6 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.4 擴增反應條件優化

根據最優反應體系組分的反應管放入熒光定量PCR儀中，對擴增反應條件進行探索。

1）病毒RNA釋放及反轉錄溫度（50～60 ℃），10～30 min。

2）預變性溫度（90～95 ℃），5～20 min。

3）變性溫度（90～95 ℃），5～20 s。

4）退火/延伸溫度（60～65 ℃）、退火/延伸時間（30～120 s）、qPCR循環數（35～45）。

1.5 dRT-qPCR特異性試驗

應用dRT-qPCR檢測方法對口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個亞型的核酸樣本和以DEPC水為樣本的陰性對照，進行檢測以觀察特異性結果。

1.6 dRT-qPCR分析靈敏度試驗

應用dRT-qPCR試劑盒（不提純樣本）和某公司產的試劑盒（提純樣本）對口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個血清型的核酸樣本稀釋至10 pg/μL的核酸濃度各40份進行RT-qPCR擴增檢測，觀察分析靈敏度結果。

1.7 dRT-qPCR樣品檢測試驗

分別采用dRT-qPCR檢測方法和常規方法對深圳市光明新區疾病預防控制中心保存的113份口蹄疫樣本進行檢測，以已知的A型核酸樣本作為陽性對照，DEPC水為樣本作為陰性對照。

1.8 結果判定

FAM通道均無擴增曲線結果判定為陰性；FAM通道Ct值≤35.0，且出現明顯的指數增長期，表示樣本為陽性；病毒檢測結果的Ct值在35.0

2 結果與分析

2.1 試劑盒組分確定

經過摸索，確定了dRT-qPCR的反應體系試劑盒。總反應體系為25 μL，主要包含：12 μL 2×Buffer Mix，2 μL dRT-qPCR 酶混液（Taq酶0.5 μL，M-MLV酶0.4 μL，酶保存液1.1 μL），0.8 μmol/L口蹄疫病毒引物探針混合液（FMD-F∶FMD-R∶FMD-Pb=3∶3∶2），0.4 μmol/L dNTPs，RNA酶抑制劑10 U，5 μL檢測樣本，DEPC水補足至25 μL。

2.2 最優反應條件確定

確定了最優擴增反應條件，見表2。熒光信號收集設定在40循環的退火/延伸時。

2.3 dRT-qPCR擴增特異性結果

口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個血清型的核酸樣本和以DEPC水為樣本的陰性對照，25 μL反應體系和45循環（5循環+40循環）反應程序，擴增時間105 min，特異性檢測結果如圖1（閾值30 000）所示。從圖1可以看出，口蹄疫病毒7個亞型的核酸樣本都有擴增曲線，陰性對照為水平線，表明用dRT-qPCR方法能夠檢測出口蹄疫病毒7個血清型的核酸樣本，且特異性良好。

2.4 dRT-qPCR分析靈敏度結果

口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個血清型的核酸樣本稀釋至10 pg/μL的核酸濃度40份，用dRT-qPCR試劑盒和某公司試劑盒進行擴增檢測，結果如表3所示。從表3可知，dRT-qPCR試劑盒和某公司試劑盒對口蹄疫病毒進行擴增檢測。結果表明，這兩種方法所檢測出的陽性樣本數差別很小，說明它們具有相一致的分析靈敏度。

2.5 樣本檢測結果

對113份口蹄疫樣本進行檢測，得到檢測結果如表4、表5所示。從表4、表5中可以看出，dRT-qPCR檢測出的陽性樣本數88份，常規方法檢測出陽性樣本數84份，常規方法有可能出現漏檢情況或出現結果隨機性。結果表明，dRT-qPCR檢測方法對于樣本檢測可行。

3 小結與討論

口蹄疫病毒有7個血清型，且每個血清型又有多個不同的亞型，使對口蹄疫病毒的快速檢測非常困難。現有的病毒分離法、流行病學分析、蛋白質組學相關的免疫技術和ELISA等方法在檢測過程仍有部分缺陷[9]，目前使用較多的方法是核酸檢測技術，能直觀地反映病毒感染情況[10]，常用于檢測口蹄疫病毒檢測。核酸檢測技術主要通過RT-qPCR或qPCR方法進行，常規RT-qPCR或qPCR方法所檢測的樣本都需要經過提取純化，但某些特殊樣本會攜帶有肝素、血紅蛋白、鐵血紅蛋白等反轉錄酶抑制成分[11]，往往對結果造成影響；而對于某些低濃度的樣本，可能在純化后提取的樣本量非常少，容易造成陽性漏檢現象，這將對口蹄疫爆發時期很不利，無法進行實施監控[12-14]。

本研究建立的dRT-qPCR方法可以用來檢測病毒核酸樣本，且樣本檢出時間為1.5 h，常規檢測需要8 h[15]，dRT-qPCR方法大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，且具有快速、準確、特異、敏感的優點，為監測口蹄疫疫情以及國內各出入境與口岸機關對于口蹄疫病毒檢疫檢驗提供了一種非常方便的技術手段。

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