合方鯽肌間骨骨化過程及形態學觀察

王 靜，張 俏，趙 瓊，趙飛躍，韓 慧，林雅楠，羅凱坤，劉少軍

(湖南師范大學生命科學學院, 省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室,中國 長沙 410081)

合方鯽肌間骨骨化過程及形態學觀察

王 靜?，張 俏?，趙 瓊，趙飛躍，韓 慧，林雅楠，羅凱坤，劉少軍

(湖南師范大學生命科學學院, 省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室,中國 長沙 410081)

利用整體骨骼染色和形態學解剖方法，對合方鯽仔稚魚肌間骨出現時期、形態發育以及成魚肌間骨數目、形態、分布進行觀察.結果表明合方鯽肌間骨是在主體骨骼完全形成后開始出現，隨著生長肌間骨形態逐漸復雜化；肌間骨從尾部往軀體前端逐漸出現,形態由簡單到復雜，尾部末端骨化明顯；肌間骨數量和形態在體軸中呈現梯度差異.

合方鯽；肌間骨；形態發育

肌間骨是魚類中特有的一種膜性硬骨,位于肌間隔中，由肌隔結締組織不經過軟骨階段直接骨化而成，其功能目前尚未有定論.肌間骨分為髓弓小骨、脈弓小骨以及椎體小骨[1-2].肌間骨的演化過程與魚類的系統進化有密切聯系.目前，國內外對魚類肌間骨的研究多處于形態方面，如秉志[3]、房連聰[4]、柯中和[5]、呂耀平[6]和BIRD等[7]分別對鯉科魚類的鯉、淇河鯽、鰱、唇、斑馬魚肌間骨的骨化時間及發育進行了描述.這些不同種類魚的肌間骨骨化時間具有顯著差異.

鯽屬鯉科，鯉亞科，鯽屬.湖南師范大學魚類發育生物學研究室以雌性日本白鯽和雄性紅鯽為親本進行雜交, 獲得了雜交子代二倍體合方鯽.二倍體合方鯽體色為青灰色，具有生長速度快、肉質鮮嫩、抗逆性強等特征[8].利用雌性二倍體合方鯽與雄性四倍體鯽鯉(紅鯽(♀)×鯉魚(♂))交配還培育出不育的三倍體合方鯽.本研究選取二倍體和三倍體合方鯽為材料，利用整體骨骼染色法對合方鯽仔稚魚肌間骨的發育過程進行系統觀察，并對成魚進行形態解剖，分析不同倍性的合方鯽肌間骨數目和形態差異，了解合方鯽肌間骨骨化的基本規律以及形態分布特點,為后期基因敲除培育無肌間骨的優質鯽奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究中的二倍體合方鯽和三倍體合方鯽均取自教育部“多倍體繁殖及育種技術”工程研究中心.從受精后13天開始，每隔3天選取發育正常的仔、稚魚作為樣本用于骨骼染色.每隔3天取一次樣，每次每個樣本10尾，用4%多聚甲醛固定，取至肌間骨全部出現為止.用于解剖與形態觀察的樣本按月齡取材，每次8尾.

1.2 合方鯽仔、稚魚整體骨骼染色

結合柯中和[5]及呂耀平[6]等人的實驗方法，對合方鯽仔、稚魚進行整體骨骼染色.具體操作步驟如下： (1)用去離子水漂洗樣本3次，每次30 min，去除多聚甲醛；(2)將仔魚放置于TBST 溶液中(50 mmol/L Tris pH 7.4 ，150 mmol/L NaCl，體積分數為0.1%的Triton X-100)處理30 min，用去離子水漂洗10 min，以去除殘余的TBST溶液；(3)轉移標本至1%KOH溶液中浸泡10～30 min，使組織透明(具體時間根據魚體大小調整)；(4)經透明的標本轉移至新的1%KOH 溶液中，滴加茜素紅染色液(1 g茜素紅溶于100 mL 1%KOH溶液中配制成染色液)，直至溶液顏色變為深紫色，染色1～3 h (具體時間根據魚體大小和季節溫度調整)，倒掉染色液，用1%KOH溶液洗去組織中殘余的染色液；(5)用1%KOH 溶液覆蓋標本，加入少量體積分數為1%的雙氧水，放置在強光下照射，褪去色素，當標本表面出現氣泡時終止反應，倒掉溶液，加1%KOH 溶液漂洗(若魚體透明度足夠或太小則不需要).染色好的標本放置于倒置顯微鏡下觀察，并拍照記錄.

1.3 成魚肌間骨的解剖與形態學觀察

實驗魚經測量后，用紗布將整個魚體包好，置沸水鍋中煮10～15 min(具體時間根據魚體大小調整).取出，冷卻后去除紗布，用鑷子小心剝去魚皮.將魚體以脊椎骨為界劃分為軸上肌和軸下肌兩個部分，從尾部向頭部順著肌節用鑷子小心地剝開肌肉，依次取出肌間骨.肌間骨按照按從頭部到尾部的順序排列整齊，魚體左側肌間骨在上，右側肌間骨在下.然后用數碼相機對已排列有序的肌間骨進行拍照記錄.

2 結果

2.1 二倍體合方鯽和三倍體合方鯽肌間骨的發育和骨化時間

通過肌間骨染色觀察后發現：受精后23 dpf(days post fertilization)內仔稚魚主骨骼逐漸形成，但沒有肌間骨存在(圖1A)；26 dpf的樣本中，仔稚魚主軸骨骼及附肢骨骼已骨化完全，并首次在尾部出現肌間骨，其形態呈“|”形；30 dpf，尾部處出現多條肌間骨，且都呈“|”形，之后肌間骨不斷由尾部向頭部方向分化出現(圖1B)；33 dpf，肌間骨明顯增多，已生長至背鰭后端且尾部出現“Y”形肌間骨(圖1D)；40 dpf，肌間骨已明顯骨化，形態清晰，數目增多，長度增長，軀干軸上部分出現大量“|”形肌間骨，尾部出現較多“Y”形肌間骨(圖1E)；在53 dpf，肌間骨全部出現.

A. 20 dpf，魚苗主體骨骼未發育完全；B.30 dpf，尾部出現較多肌間骨，呈“|”形；C. 33 dpf,尾部肌間骨增多，并出現“Y”形肌間骨；D. 33 dpf，背鰭后端逐漸出現肌間骨；E. 40 dpf，軀干軸上肌前端出現肌間骨肌間骨數目增多，長度增長；F. 40 dpf，尾部出現較多“Y”形肌間骨圖1 合方鯽肌間骨發育形態學觀察(箭頭所指為肌間骨)Fig.1 Morphological observation of intermuscular bone development of WR (arrows indicated the intermuscular bones)

2.2 二倍體合方鯽、三倍體合方鯽成魚肌間骨的形態與分布

根據呂耀平等人[6]對肌間骨形態的分類方法，可將肌間骨分為“|”形、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、兩端兩分叉形、兩端多叉形和樹枝形共7種類型(圖2A～G).通過解剖發現，合方鯽髓弓小骨具有這7種類型，而脈弓小骨多為“|”形、“卜”形、“Y”形和樹枝形.從整體來看，髓弓小骨的形態比脈弓小骨更復雜.合方鯽左右兩側肌間骨數目并不完全一致，形態上具有一定差異.在分布上，軸上肌中的肌間骨數目最多，從頭部后側至尾部均存在；軸下肌中的肌間骨相對較少，僅分布于尾柄范圍內(圖3，表1). 肌間骨有秩序地埋藏在椎體兩側的肌間隔中，髓弓小骨位于背部肌間隔中，脈弓小骨位于腹部肌間隔中.肌間骨沿運動方向順著肌隔分布，其長度從軀干部向尾部逐漸縮短.

A. “|”形；B. “卜” 形；C. “Y” 形；D. 一端多叉形；E. 兩端兩分叉形；F. 兩端多分叉形；G. 樹枝形圖2 合方鯽肌間骨形態圖Fig.2 Shapes of intermuscular bones of WR

注：肌間骨按從頭到尾順序依次排列.len:左側髓弓小骨；lep:左側脈弓小骨；ren:右側髓弓小骨；rep:右側脈弓小骨圖3 合方鯽肌間骨分布圖Fig.3 Distribution of intermuscular bones in WR

樣品位置總數“|”形“卜”形“Y”形一端多叉形兩端多叉形兩端兩分叉形樹枝形二倍體合方鯽左側軸上292253485左側軸下133242101右側軸上293243764右側軸下144152101三倍體合方鯽左側軸上267724222左側軸下148311001右側軸上288326531右側軸下149410000

3 討論

3.1 肌間骨的形態與分布

肌間骨根據自身直接或間接附著位置可分為髓弓小骨、椎體小骨、脈弓小骨3種類型.董在杰等[9]發現鰱、鳙、團頭魴和異育銀鯽這幾種鯉科魚類都含有這3種類型肌間骨.然而并不是所有魚類都包含這3種類型的肌間骨.本研究發現合方鯽只有髓弓小骨和脈弓小骨，沒有椎體小骨.這與柯中和[5]對鰱魚的觀察一致，推測可能與外界環境、基因變異等方面有關系[10].通過解剖觀察可以發現，合方鯽魚體兩側的肌間骨數目并不完全相同，其形態分布也略有差異，但十分相近.這與董在杰[9]所報道的其他幾種鯉科魚類的結果是一致的[9].二倍體和三倍體合方鯽的肌間骨數目無顯著差異(P>0.05)，肌間骨總數均為80～90.

肌間骨由肌隔結締組織不經過軟骨階段直接骨化而成.目前關于肌間骨的具體作用還沒有定論，但主流的觀點認為肌間骨起著支撐肌肉、傳導肌肉力量、幫助魚體運動的作用[2].本研究通過形態解剖發現合方鯽軸上肌中的肌間骨數目最多，從尾部至頭部均存在，其長度從軀干部向尾部逐漸縮短；軸下肌中的肌間骨僅分布在尾部至腹腔與尾部的過渡區域，靠近腹腔處的肌間骨長度最短，骨化程度最弱.因此，可以推斷肌間骨長度差異可能是因肌肉的分布差異造成的，如：軸下肌腹腔部分肌肉較少，且有肋骨支撐，因此肌間骨幾乎沒有分布；尾部肌間骨分布較多，推測是為了更好地傳導肌肉力量，加強魚尾部游動能力.

肌間骨的形態類型多樣.在合方鯽中，“卜”形很少出現，且存在另外一種“(”形肌間骨，根據其所處位置及形態，可認為“(”形和“卜”形是在肌間骨演化進程中介于“|”形和“Y”形的過渡類型.

3.2 肌間骨的骨化與發育過程

對于肌間骨的出現時機，本研究發現二倍體合方鯽和三倍體合方鯽的肌間骨是在主軸骨骼和附肢骨骼都已骨化完全后才開始出現(圖1C)，且髓弓小骨與脈弓小骨都是從尾部向前端依次出現(圖1E)，其形態隨其生長發育由尾部向頭部方向逐漸復雜化(圖1F).在肌間骨的發育過程中，二倍體和三倍體合方鯽的肌間骨發育時間基本相同，一般在26 dpf之后開始出現，但相同時期的三倍體合方鯽體型略長于二倍體合方鯽，因此相同位置的肌間骨三倍體略長于二倍體.

通過骨骼染色觀察發現，合方鯽在受精后第26天于尾部出現第一枚肌間骨，形態呈“|”型.與鰱在43 dpf (體長為10.50 mm)[5]，唇在35 dpf (體長為23.67 mm)時首次出現肌間骨[6]相比，合方鯽的肌間骨骨化時間較早，但肌間骨首次出現的部位都在尾部，且形態都為“|”型.姚文杰等[11]對斑馬魚和日本鰻魚的肌間骨骨化過程進行了深入研究，發現斑馬魚肌間骨骨化主要是從后端到前端區域，而呈典型的鰻狀游泳方式的日本鰻魚肌間骨則是從前往后骨化，提示不同魚類肌間骨的骨化過程不同可能與其游泳方式不同有關.

合方鯽肌間骨在26 dpf開始骨化，53 dpf骨化完全.肌間骨骨化出現時，魚體主軸骨骼和附肢骨骼已經骨化完全，魚體運動覓食能力已基本完善，肌間骨出現前后魚體運動攝食能力并無顯著差異.此外，根據已有研究發現，肌間骨與魚類的系統演化是密切相關的.從低等到高等真骨魚類, 肌間骨的形態由簡單到復雜然后退化，肌間骨的出現與消失可認為是真骨魚類演化過程中某一特定階段的產物.因此，肌間骨實際是一種痕跡器官[5].從理論上說，在合方鯽肌間骨形成之前抑制其骨化出現，培育無肌間骨的合方鯽是可行的.合方鯽肌間骨出現時間為26 dpf，可以該時間點為依據，對該時間點之前和之后的轉錄組進行測定，分析差異表達基因，篩選出肌間骨發育相關的關鍵基因，為后期基因敲除培育無肌間骨魚類奠定基礎.

肌間骨的發育過程可以分為兩個途徑：①“|”形—“卜”形—“Y”形—一端多叉形.②“|”形—“卜”形—“Y”形—兩端兩分叉形—兩端多叉形—樹枝形[5].本研究發現在合方鯽中這兩種演化方向都有可能，且不存在直接由“Y”形演化為樹枝形的情況.在骨舌魚總目中最原始的肌間小骨形態是沒有分叉的，在此之后的骨鰾總目的肌間骨都是從“|”形肌間骨演化而來的[2].在低等真骨魚類中肌間骨的演化是從簡單的“|”形逐步演化為復雜的“卜”形、“Y”形、兩端多叉形和樹枝形.在對合方鯽仔稚魚肌間骨染色觀察發現， 合方鯽肌間骨首先在尾部以“|”形出現，然后按照“|”形—“Y”形—多叉形的方向不斷形成.53 dpf后，肌間骨完全出現，隨著合方鯽不斷生長發育，其肌間骨數目無明顯增加，但形態仍不斷復雜化.從整體來看，肌間骨從前向后呈現出從復雜到簡單的排列順序.形態越復雜的肌間骨越晚發生，這提示我們，合方鯽肌間骨的發育過程可能包括兩個步驟，首先是產生誘導肌間隔結締組織形態分化的信號，并從軀體前端向尾部呈梯度分布誘導肌間骨前體結締組織形態分化；然后是產生從尾部向頭部呈梯度分布的骨化信號，誘導形態已分化的結締組織從尾部向軀體前部依次骨化[5].本研究發現合方鯽尾部最后幾根肌間骨形態較粗，骨化程度強烈，端部分枝復雜，形態介于“|”形和樹枝形中間，這與其他魚中報道的尾部“|”形肌間骨存在一定差異.

3.3 前景展望

培育無肌間骨的優質鯽魚是魚類遺傳創新的目標之一.經過魚類遠緣雜交技術等遺傳改良方法可以獲得肌間刺少的優良品種[12-13].通過人工誘導雌核發育純合二倍體使突變基因的性狀得以表現，可篩選到無肌間骨草魚突變體[14].雖然目前對魚類肌間骨的研究有了很大的突破，但肌間骨的形成是一個復雜的程序性發生過程，這一現象涉及生命活動的各個水平，包括多個信號通路——TGFβ信號通路、Wnt信號通路以及PI3K通路等；多種細胞——間充質細胞、骨原細胞、成骨細胞、骨細胞[15]；多個組織——肌肉、結締組織、血液等；魚體發育的多個時期——胚胎期、魚苗階段、成魚階段.因此對肌間骨的研究還有待深入.

隨著高通量測序的發展，從基因組、轉錄組、表觀遺傳學方面能更加全面分析肌間骨發育的分子遺傳機制[16-17].利用現代生物技術，嘗試通過基因敲除、基因抑制、雌核發育、雄核發育、雜交選育等技術來獲得無肌間骨的魚，豐富魚類養殖新品種，促進水產養殖業的創新是對肌間骨進行研究的最終目標.本研究首次對雜交鯽肌間骨的發生發育過程進行了研究，從中探究雜交對肌間骨形成的影響，為后期無肌間骨魚類的研發奠定基礎.

[1] 孟慶聞, 蘇錦祥, 李婉端. 魚類比較解剖[M]. 北京:科學出版社, 1987.

[2] PATTERSON C, JOHNSON G D. The intermuscular bones and ligaments of teleostean fishes [J]. Smithson Contrib Zool, 1995,559:1-85.

[3] 秉 志. 幼鯉大側肌肌隔骨針的觀察[J]. 動物學報, 1962,14(2):175-178.

[4] 房連聰.淇河鯽肌間骨及其形成相關基因SOST的研究[D]. 新鄉：河南師范大學, 2015.

[5] 柯中和, 張 煒, 蔣 燕, 等. 鰱肌間小骨發育的形態學觀察[J]. 動物學雜志, 2008,43(6):88-96.

[6] 呂耀平, 陳 潔, 鮑寶龍, 等. 唇魚骨肌間小骨的骨化過程[J]. 上海海洋大學學報, 2012,21(4):549-553.

[7] BIRD N C, MABEE P M. Developmental morphology of the axial skeleton of the Zebrafish,Daniorerio(Ostariophysi: Cyprinidae) [J]. Dev Dyn, 2003,228(3):337-357.

[8] WANG J, XIAO J, ZENG M,etal. Genomic variation in the hybrids of white crucian carp and red crucian carp: Evidence from ribosomal DNA[J]. Sci China Life Sci C: Life Sci, 2015,58(6):590-601.

[9] 董在杰, 黃代中, 李麗娟, 等. 幾種常見鯉科魚類肌間刺的初步研究[J]. 上海水產大學學報, 2006,15(4):425-429.

[10] SAMBROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T. Molecular cloning: a laboratory manual [M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[11] YAO W J, Lü Y P, GONG X L,etal. Different ossification patterns of intermuscular bones in fish with different swimming modes[J]. Biol Open, 2015,4(12):1727-1732.

[12] 黎 玲, 鐘澤州, 曾 鳴, 等. 不同倍性魚肌間骨的比較分析[J]. 中國科學:生命科學, 2013,43(3):189-200.

[13] 鐘澤洲．翹嘴鳊及其親本肌間骨的比較分析[D]. 長沙: 湖南師范大學, 2014．

[14] 徐曉鋒, 鄭建波, 錢葉青, 等. 生長發育正常的無肌間刺草魚突變體[J]. 科學通報, 2015,60(1):52-57.

[15] 房連聰, 李學軍．低等真骨魚類肌間骨發生的研究[J]. 水產科學, 2013,32(12):749-752．

[16] SHI M W, SHAO K Y, JIA Z,etal. Identification of microRNA for intermuscular bone development in blunt snout bream (megalobramaamblycephala)[J]. Int J Mol, 2015,16(5):10686-10703.

[17] 馬吉敏, 匡友誼, 鄭先虎, 等. 鏡鯉(Cyprinuscarpio)肌間刺數量微衛星標記篩選與相關性分析[J]. 動物學研究, 2013,34(4):406-410.

(編輯 WJ)

Ossification Process and Morphology of Intermuscular Bones in Hybrids Crucian Carp

WANGJing?,ZHANGQiao?,ZHAOQiong,ZHAOFei-yue,HANHui,LINYan-nan,LOUKai-kun,LIUShao-jun*

(State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish,College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

Applying the methods of overall skeletal staining and morphological anatomy, in the present study, we investigated the emergence time, morphogenesis, number, shape and distribution of intermuscular bones in the hybrid crucian carp derived from white crucian carp(♀)× red crucian carp(♂) (WR). Our results show that the intermuscular bones of WR appear after the formation of the main body skeleton. During the growth of WR, the shapes of intermuscular bones become more perplexed. The intermuscular bones first appear in the tail and then in the head. Their form change from simplicity to complexity is coincident with the appearance from the tail to the head. In addition, the intermuscular bones in tail highly ossify. A gradient difference pattern along the axis in the number and morphology of intermuscular bones is present.

hybrid crucian carp; intermuscular bone; morphological development

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.02.006

2016-06-19

國家自然科學基金資助項目(31201980)；湖南省自然科學基金資助項目(14JJ3072)；湖南省教育廳優秀青年資助項目(16B160);湖南師范大學大學生創新性實驗資助項目(2015-41)

Q959.46+8

A

1000-2537(2017)02-0039-05

?同等貢獻

*通訊作者,E-mail：lsj@hunnu.edu.cn