乳清雪菊酒發酵工藝優化的研究

張亞南，付二冬，劉偉，王沛，王威，古麗娜孜，田歌，吳浩天，馬文瑞，張志臻，武運*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農業大學科學技術學院，新疆烏魯木齊830052）

乳清雪菊酒發酵工藝優化的研究

張亞南1，付二冬1，劉偉1，王沛1，王威1，古麗娜孜1，田歌1，吳浩天1，馬文瑞1，張志臻2，武運1*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農業大學科學技術學院，新疆烏魯木齊830052）

為探討乳清雪菊酒的加工技術，以新疆干酪副產物乳清與雪菊為原料，通過單因素試驗與響應面試驗設計優化乳清雪菊酒的發酵工藝條件。試驗結果表明，乳清雪菊酒的最佳發酵工藝為：馬克思克魯維酵母菌∶釀酒酵母菌∶干酪乳桿菌的接種比例6%∶6%∶2%，發酵時間102 h，發酵溫度30℃。在此條件下，乳清雪菊酒的酒精度可達5.93%vol，總酸為6.48 g/L，乳清雪菊酒呈淡橘黃色，擁有乳清與雪菊混合的芳香氣味，乳香與花香協調，酒體柔和。

乳清；雪菊；酒精發酵；工藝優化

乳清是制造干酪和干酪素的加工副產物，具有較高的營養價值，其中約含乳清干物質6%～8%，粗蛋白質1%，粗脂肪0.3%～0.4%，總糖3%～5%（乳糖占99.8%），此外還含有礦物質和多種維生素[1-3]。其含有的乳清蛋白能結合鈣以及一些疏水性分子（如視黃醇、維生素E），起到降血壓、抗應激、降低痛苦刺激的靈敏度、降低膽固醇、提高免疫力、提高認知性能和改善睡眠等作用[4-6]；乳糖能促進腸道內鈣、磷和錳等礦物質的吸收，抑制其他有害細菌的繁殖，調整菌群平衡[7]，但也易造成乳糖不耐癥。目前，全世界乳清產量每年約180×106～190×106t，其中只有50%得到了利用[8]，其余大部分被作為廢水直接排放，而據研究水污染的工作人員分析，由于乳清蛋白具有很高的生物需氧量（3800～46000mg/L），己遠遠超過200mg/L的生活污水容許極限[9]，對環境造成了較嚴重的污染。現今利用乳清生產含酒精飲料，具有工藝簡單、設備要求低、產品附加值高等優點，乳清經過酵母菌和乳酸菌等發酵作用，產生乙醇、乳酸及其他有機酸類，不僅使飲料產生良好的風味，而且營養價值也大幅度提高了，這是由于乳酸菌將大分子乳清蛋白分解，產生一些肽類更易于被人體吸收。另外乳酸菌和克魯維酵母菌能分解利用乳清中的乳糖，減少乳糖不耐癥的發生。

雪菊學名兩色金雞菊，又稱清三高花，是藥食兩用植物，含有多種黃酮類物質、多種人體必需的礦物元素、20多種氨基酸、數十種芳香族化合物、豐富的有機酸、維生素、酶類、多糖等，具有超過一般花茶的藥理功效。將雪菊沖泡，香味濃郁，具有清熱解毒、活血化疲、健脾胃、降血壓、降血脂和降血糖之功效，還可治療心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾等[10-13]，現已成為營養學家、藥理學家以及養生專家研究的熱點。

新疆是我國奶業發展較好的地區之一，隨著奶酪需求量的增大，乳清排放量較大造成了資源浪費與環境污染。本研究以新疆乳清與雪菊為原料，將發酵液的酒精度作為評價指標，運用響應面法優化乳清雪菊酒的發酵工藝參數，以期為新疆乳清與雪菊的新產品開發和產品附加值的提高提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清：新疆庫爾勒瑞源乳業提供；雪菊：烏魯木齊北園春市場；酵母菌、乳酸菌：新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室提供；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基、MRS培養基：青島海博生物技術有限公司；其他培養基均購于新疆阜瑞克生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2014N分析天平：北京東南儀誠實驗室設備有限公司；HR40-IIA2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；YBFJ110酒精計：冀州市耀華器械儀表廠；WFI-J型手持測糖儀：成都豪創光電儀器有限公司；JM-L型膠體磨：上海諾尼輕工機械有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；NCJJ.1/100納米超高壓均質機：廊坊通用機械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）原料處理：按照3 g/100 mL的比例將雪菊浸泡在無菌水中，獲得雪菊溶液，同時將新鮮乳清，使用無菌紗布過濾除去雜質，并準確量取一定量的乳清加入10%的蔗糖。

（2）成分調整：將10%的雪菊溶液與90%的乳清溶液進行混合，置于85℃的水浴鍋中，水浴30 min，冷卻至室溫。

（3）菌種活化：將保存于4℃冰箱中的斜面酵母菌與乳酸菌在無菌條件下接種于YEPD與MRS肉湯液體培養基中，將接種好的活化菌液，置于28℃活化培養24 h傳代，活化2代后使用。

（4）酒精發酵：將酵母菌與乳酸菌按一定的比例加入乳清雪菊溶液中，30℃發酵4 d。

（5）將發酵完成的乳清雪菊酒加熱至溫度為50～70℃時，分別添加不同的穩定劑，經膠體磨處理2～3 min，再將處理后的樣液在20MPa下均質10min，進行灌裝，并于85℃條件下殺菌20 min，冷卻儲藏。

1.3.3 乳清雪菊酒發酵試驗

（1）單因素試驗

分別選取馬克思克魯維酵母菌、釀酒酵母菌和干酪乳桿菌的接種比例為3%∶3%∶5%、4%∶4%∶4%、5%∶5%∶3%、6%∶6%∶2%、7%∶7%∶1%，蔗糖添加量為6%、8%、10%、12%、14%，發酵溫度為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，發酵時間為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，雪菊浸提液為10%、20%、30%、40%、50%進行單因素試驗，測定發酵液的酒精度、總酸、可溶性固形物含量，研究不同單因素對乳清雪菊酒發酵過程的影響。

（2）響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，采用Expert-Design8.05中的Box-Behnken的響應面設計，選取接種比例（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）為優化因素，以酒精度為響應值，對乳清雪菊酒發酵參數進行優化。響應面試驗設計因素和水平見表1。

表1 乳清雪菊酒發酵條件優化響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for wheyC.tintoriawine fermentation conditions optimization

1.3.4 檢測指標

酒精度的測定：根據國標GB/T 23546—2009《奶酒》中測定方法[14]；酸度（以乳酸計）的測定：酸堿直接滴定法；可溶性固形物含量測定：采用手持測糖儀測定；微生物指標的測定：根據國標GB 4789.3—2010《食品安全國家標準食品衛生微生物學檢驗大腸菌群計數》規定的方法進行。

2 結果與分析

2.1 乳清雪菊酒發酵工藝單因素試驗結果

2.1.1 不同菌種接種比例對乳清雪菊酒的影響

當發酵溫度為30℃，發酵時間為96 h，蔗糖添加量為10%，雪菊溶液添加量為10%時，不同接種比例對乳清雪菊酒各指標的影響見圖1。由圖1可知，在不同的菌種接種比例下，乳清雪菊酒的酒精度呈現逐漸升高的趨勢，可溶性固形物含量與總酸緩慢較低。當接種比例為6%∶6%∶2%時，酒精度達到最大值為5.7%vol，可溶性固形物含量下降為6.6°Bx，總酸下降為4.6 g/L；當接種比例為7%∶7%∶1%時，酒精度有所下降，而可溶性固形物與總酸基本不變。可能是因為菌種接種比例不同時，菌種的延滯期、起酵速度、發酵周期不同；菌種接種量較高時，菌種消耗大量營養物質進行了生長代謝，此時不利于酒精的轉化[15]。綜合考慮，選取菌種接種比例為6%∶6%∶2%進行發酵試驗。

圖1 不同接種比例對乳清雪菊酒的影響Fig.1 Effect of different inoculum ratio on whey C.tintoriawine

2.1.2 不同發酵時間對乳清雪菊酒的影響

在發酵溫度為30℃，菌種接種比例為6%∶6%∶2%，蔗糖添加量為10%，雪菊溶液添加量為10%的試驗條件下，不同發酵時間對乳清雪菊酒各指標的影響見圖2。由圖2可知，當發酵時間在24～96 h時，乳清雪菊酒的酒精度增加較快；發酵時間96 h時，酒精度達到最大值為6.3%vol，可溶性固形物為6.0°Bx，總酸為7.5 g/L，當發酵時間為96～144 h時，乳清雪菊酒的酒精度呈現緩慢下降趨勢，可溶性固形物含量未變化，總酸呈現上升趨勢，達到最大值為10.3 g/L。可能由于發酵時間較長，發酵液中營養物質不足，難以滿足菌種的生長，進入衰亡期；也許是由于發酵時間較長，有大量的副產物累積，增加了菌種的抑制作用。綜上所述，發酵時間選取96 h進行試驗。

圖2 不同發酵時間對乳清雪菊酒的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on whey C.tintoriawine

2.1.3 不同發酵溫度對乳清雪菊酒的影響

在菌種接種比例為6%∶6%∶2%，發酵時間為96 h，蔗糖添加量為10%，雪菊溶液添加量為10%的試驗條件下，不同發酵溫度對乳清雪菊酒各指標的影響見圖3。由圖3可知，當發酵溫度在26～30℃，酒精度與總酸上升，可溶性固形物含量下降。當發酵溫度為30℃時，發酵液的酒精度達到6.1%vol，可溶性固形物含量6.7°Bx，總酸為4.8 g/L。當發酵溫度為30℃以上時，乳清雪菊酒酒精度出現下降現象，可溶性固形物含量緩慢上升。可能是因為發酵溫度較低時，滿足不了菌種的生長溫度，使得菌種生長緩慢，起酵速度慢，發酵周期長；而發酵溫度過高時，加速了菌種衰老，產酒精率低，同時易引起雜菌污染[16]。綜上考慮，應選取發酵溫度30℃進行發酵試驗。

圖3 不同發酵溫度對乳清雪菊酒的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on wheyC.tintoriawine

2.1.4 不同雪菊溶液添加量對乳清雪菊酒的影響

在發酵溫度為30℃，發酵時間為96 h，菌種接種比例為6%∶6%∶2%，蔗糖添加量為10%的試驗條件下，不同雪菊溶液添加量對乳清雪菊酒各指標的影響見圖4。由圖4可知，隨著雪菊溶液添加量的增加，酒精度、可溶性固形物含量與總酸趨于穩定，對乳清雪菊酒的發酵特性影響不大，對乳清雪菊酒的風味影響較大，添加量過高時，雪菊香味過于濃郁，掩蓋了乳香味，綜合考慮，選擇雪菊溶液添加量為10%，以保證乳清雪菊酒香味的協調性。

圖4 不同雪菊溶液添加量對乳清雪菊酒的影響Fig.4 Effect of differentCoreopsis tintoriasolution addition on wheyC.tintoriawine

2.1.5 不同蔗糖添加量對乳清雪菊酒的影響

在發酵溫度為30℃，發酵時間為96 h，菌種接種比例為6%∶6%∶2%，蔗糖添加量為10%，雪菊溶液添加量為10%的試驗條件下，不同蔗糖添加量對乳清雪菊酒各指標的影響見圖5。由圖5可知，隨著發酵液中糖含量的增加，乳清雪菊酒的酒精度顯著升高；當糖添加量為10%時，酒精度達到最大值為6.02%vol，可溶性固形物含量為4.5°Bx，總酸為6.8 g/L；隨著蔗糖添加量繼續增加，乳清雪菊酒的酒精度有所下降，可溶性固形物含量隨之升高，總酸下降。可能是當蔗糖添加量較低時，菌種生長和酒精轉化的所需的碳源不足，酒精度較低；當蔗糖量過高時，形成了較高的滲透壓，對菌種的生長與代謝起到了阻礙作用，并且隨著發酵過程中酒精的積累，會加重對菌種代謝活動的阻礙[17]。綜合考慮，選取蔗糖添加量為10%進行發酵。

圖5 不同蔗糖添加量對乳清雪菊酒的影響Fig.5 Effect of different sucrose addition on whey C.tintoriawine

2.2 乳清雪菊酒發酵響應面優化試驗結果

由單因素試驗結果可知，試驗所設計的考察因素對總酸影響較小，而對可溶性固形物與酒精度的影響較大，可溶性固形物與酒精度又呈現反比例關系，酒精度越高可溶性固形物就越低，因此選取酒精度作為響應面優化的評定指標，可體現出乳清雪菊酒的發酵特性。在此基礎上，采用Box-Behnken進行響應面試驗設計，考察菌種接種比例（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）對乳清雪菊酒酒精度（Y）的影響，試驗設計及結果見表2。

對表2響應面試驗結果進行回歸分析，得到乳清雪菊酒酒精度對接種比例（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）的擬合方程為：Y=5.92+0.48A+0.16B+0.34C-0.20AB+0.10AC-0.12BC-0.85A2-0.42B2-0.67C2。

由表3可知，本實驗建立的回歸模型極顯著（P＜0.0001）；而模型失擬項P=0.223 4＞0.05，說明模型失擬項不顯著，由此說明所建立的模型具有良好的顯著性。模型決定系數R2=0.992 1，校正決定系數R2Adj=0.981 9，表明該模型能較好擬合實際試驗中響應值的變化，表明乳清雪菊酒酒精度的實測值與預測值之間具有良好的擬合度，能夠利用該模型對乳清雪菊酒酒精發酵過程進行分析和預測。

表2 乳清雪菊酒發酵條件優化響應面試驗設計結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for wheyC.tintoriawine fermentation condition optimization

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equations

由表3可知，一次項A、B、C，交互項AB和二次項A2、B2、C2對響應值均存在極顯著的影響（P＜0.01），交互項BC對響應值存在顯著的影響（P＜0.05）。

2.3 響應面分析與優化

為了考察各個交互項對乳清雪菊酒的酒精度的影響，利用Design-Expert 8.05軟件對回歸模型進行響應面優化，并對交互作用顯著的因素繪制交互項三維響應面圖，能比較直觀的解釋各個變量和變量之間對響應值的影響，結果見圖6。通過Design-Expert 8.05對建立的回歸方程進行參數最優化分析，可以得出最佳發酵工藝條件為接種比例6.1%∶6.1%∶1.9%、發酵溫度30.17℃、發酵時間102.33 h，在此條件下乳清雪菊酒酒精度預測值為6.04%vol。

圖6 接種比例、發酵溫度與發酵時間交互作用對乳清雪菊酒酒精度影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum ratio,fermentation temperature and time on alcohol content of wheyC.tintoriawine

2.4 驗證試驗

為檢驗該方法的可靠性，根據實際操作條件，將最佳發酵工藝修正為菌種接種比例為6%∶6%∶2%、發酵溫度30℃、發酵時間102 h，經過3組平行試驗，最終測得的樣品平均酒精度為5.93%vol，可見該模型準確可靠，利用該模型在實踐中進行預測是可行的。

2.5 產品質量指標

2.5.1 感官指標

乳清雪菊酒呈淡橘黃色，有少量的沉淀現象，擁有乳清與雪菊混合的芳香氣味，無異味，酒體柔和。

2.5.2 理化指標

酒精度：5.93%vol，總酸：6.48 g/L。

2.5.3 微生物指標

致病菌：沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌未檢出。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken響應面優化法，得出乳清雪菊酒最佳發酵條件為馬克思克魯維酵母菌∶釀酒酵母菌∶干酪乳桿菌接種比例6%∶6%∶2%，發酵時間102 h，發酵溫度30℃。在優化的最佳條件下，所得的乳清雪菊酒酒精度可達5.93%vol，總酸為6.48 g/L，乳清雪菊酒色澤呈淡橘黃色，擁有乳清與雪菊混合的芳香氣味，無異味，酒體柔和。

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Optimization of fermentation process of wheyCoreopsis tintoriawine

ZHANG Yanan1,FU Erdong1,LIU Wei1,WANG Pei1,WANG Wei1,GULINAZI1,TIAN Ge1,WU Haotian1,MA Wenrui1, ZHANG Zhizhen2,WU Yun1*
(1.College of Food Sciences and Pharmaceutical Sciences,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.College of Science and Technology,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

To research the technology of wheyCoreopsis tintoriawine,using whey(a by-product from Xinjiang cheese-making)andC.tintoriaas raw material,the optimum technological conditions were optimized through single factor experiments and response surface methodology.Experimental results showed that the optimum wheyC.tintoriawine fermentation process wereKluyveromyces marxianus∶Saccharomyces cerevisiae∶Lactobacillus caseiinoculum ratio 6%∶6%∶2%,fermentation time 102 h and temperature 30℃.Under the conditions,the alcohol content of the wine was 5.93%vol, total acid content was 6.48 g/L.The wheyC.tintoriawine was soft with pale orange color,had the aroma of whey mixed withC.tintoria,frankincense,coordinated with flowers.

whey;Coreopsis tintoria;alcoholic fermentation;process optimization

R284.2

0254-5071（2017）04-0109-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.023

2016-10-20

“十二五”國家科技支撐項目（2012BAD44B01-05）；企業橫向合作項目（XJNDRY-002）；新疆農業大學自治區級大學生創新訓練項目（201610758080）

張亞南（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：武運（1965-），女，教授，碩士，研究方向為食品生物技術與食品安全。