牛樟芝發酵液提取物抗菌活性研究

摘要： 牛樟芝作為一種珍稀食用和藥用菌，具有極大的開發潛力。該研究以麥芽浸粉肉湯液體培養基（BD，美國BD公司）對牛樟芝菌絲體進行搖床培養60 d后，收獲發酵液并用乙酸乙酯對其進行萃取，濃縮至干獲得提取物；同時，采用抑菌圈法評價培養物對13種致病細菌抗菌活性（蠟樣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、無乳鏈球菌、短小芽孢桿菌、福氏志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌、銅尿假單胞菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌），并檢測相應致病細菌的最低抑制濃度（MIC）。結果表明：牛樟芝麥芽浸粉肉湯發酵液提取物對供試的13種致病菌均有抑菌活性；在供試的13種致病菌中，提取物對緩慢芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌、藤黃微球菌5種致病菌的最低抑制濃度值均小于80 μg·mL1，其中對藤黃微球菌的最低抑制濃度最低為66.5 μg·mL1；隨著培養時間的增加，提取物的抗菌活性也增加。這說明牛樟芝菌絲體在液體培養條件下，能夠產生廣譜高效抑菌活性的次生代謝產物。該研究結果為牛樟芝進一步的有效利用開發奠定了理論基礎。

關鍵詞： 牛樟芝菌絲體， 珍稀食藥用菌， 抑菌圈法， 最低抑制濃度， 致病細菌

中圖分類號： Q946文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）08106806

Abstract： Antrodia cinnamomea is an rare edible and medicinal fungus that has great potential useful value. In this study， malt extract broth liquid medium were selected to culture the mycelium of A. cinnamomea. Mycelium of A. cinnamomea was cultured in liquid malt extract at 150 r·min1 for 60 d， and the primary extract was obtained by extracting culture of A. cinnamomea with ethyl acetate. Meanwhile inoculating inhibition zone was used to evaluate the antibacterial activity of primary extract and minimum inhibitory concentration （MIC） was determined. The result showed the primary extract of A. cinnamomea cultured in liquid malt extract broth had significant antibacterial activity against the thirteen kinds of pathogenic bacteria （Bacillus cereus， B. lentus， Streptcococcus agalactiae， Bacillus pumilus， Shigella flexneri， Bacillus subtilis， Staphylococcus aureus， Micrococcus luteus， Vibrio parahaemolyticus， Straphylococcus haemolyticus， Pseudomonas aeruginosa， Salmonella paratyphi B， Escherichia coli）. The MIC of five kinds of bacteria （Bacillus lentus， B. pumilus， B. subtilis， Vibrio parahaemolyticus， Micrococcus luteus） were less than 80 μg·mL1. The least of MIC of Antrodia cinnamomea extractive against Micrococcus luteus could reach 66.5 μg·mL1. The influence of culture time to antibacterial activity was also detected. The results showed that the antibacterial activity of mycelial culture from Antrodia cinnamomea increased with the culture time in creasing. Mycelia of A. cinnamomea could be cultured in liquid medium and could produce effective components， this discovery provides information for development and utilization of A. cinnamomea.

Key words： mycelia of Antrodia cinnamomea， edible and medicinal fungi， inoculating inhibition zone， minimum inhibitory concentration， pathogenic bacteria

牛樟芝（Antrodia cinnamomea）是一種珍稀食藥用菌，又名樟芝、牛樟菇、樟生薄孔菌， 屬擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬（胡鷗等， 2006）。由于其寄生在牛樟樹上，牛樟芝也因此而得名（Geethangili et al， 2011）。在臺灣地區，牛樟芝常被用作醒酒與緩解疲勞，除此之外，牛樟芝還具有免疫調節、保護肝臟等作用，因此在臺灣地區，牛樟芝被稱作“森林紅寶石”（陳體強等， 2003； 張毅紅等， 2015； 趙能等， 2016）。近年來，Lin et al（2006）研究表明牛樟芝的藥用價值要遠遠大于其食用價值，它不僅能夠作為保健食物增強人的抵抗力，保護肝臟，同時還能治療腹瀉、腹痛、高血壓等多種疾病，對抗癌也有一定作用。Chen et al（2003）前期研究發現，牛樟芝子實體內三萜類化合物含量高達63%。Geethangili et al（2010）從牛樟芝中分離并鑒定出化合物78個，在這78個化合物中，有39個都為三萜類化合物。大多三萜類化合物具有抗炎抗癌作用（Peek et al， 2002）。民間用藥主要是用牛樟芝的子實體，但由于牛樟芝生長緩慢且其寄主稀有，野生牛章芝子實體無法滿足目前對牛樟芝活性成分研究的需求。因此，牛樟芝野生子實體的市面價格每公斤為15 000～25 000美元·kg1（Lu et al， 2014）。Du et al（2012）發現利用深層發酵的方法培養的牛樟芝中三萜含量是野生牛樟芝的10～30倍，這一發現為培養牛樟芝并獲得有效成分提供了一種新思路。成熟牛樟芝具有子實體，雖然子實體是由菌絲體構成，但據研究發現其菌絲體與子實體的活性成分作用各不相同（Lu et al， 2013）。在牛樟芝菌絲體中發現具有無毒副作用的抗癌物，安卓奎諾爾（Antroquinonol），這種有效的抗癌物質僅在菌絲體中被發現，而在子實體中沒有檢測到該物質（Der et al， 2006）。由于野生牛樟芝資源稀少，目前已有文獻及專利探討各種培養方式及培養配方。研究人員已經發展出浸入發酵（submerged fermentation）、固體支持物培養（solid support culture）、椴木培養（cutting wood culture）和培養皿培養（dish culture）四種主要培養方法。其中，椴木培養由于牛樟樹資源也面臨緊缺的問題，而目前還沒找到能夠替代牛樟樹而不影響牛樟芝活性成分產生的其他樟科植物。相對于固體支持物培養和培養皿培養方法，發酵培養能夠相對便捷地大規模培養。利用發酵的方式，通過改變培養基、培養條件及培養方式不僅有可能獲得子實體加快菌絲體生長速度以及野生菌絲體所產生的活性化合物（Lu et al，2013），同時還有可能獲得新的活性及活性物質。因此，采用發酵培養的方法培養牛樟芝具有極大潛力。

牛樟芝作為一種可食用菌，其內含有大量的有效成分，這些有效成分具有抗癌、消炎等作用，但目前抗菌活性報道極少。Geethangili et al（2010）發現牛樟芝子實體提取物對引起胃炎的幽門螺桿菌具有抑制作用，之后Lien et al（2013）又發現牛樟芝子實體提取物對口腔細菌也具有抑制作用。目前尚未有對牛樟芝發酵液提取物抗菌活性的報道。本研究采用搖床發酵方式培養牛樟芝菌絲，獲得發酵液提取物，并對提取物進行抗菌活性檢測，該方法既能使牛樟芝菌絲快速生長，又能循環利用牛樟芝菌絲體，為有效利用牛樟芝菌絲體奠定了基礎。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

菌絲體：牛樟芝斜面菌種由昆明食用菌研究所提供。菌種鑒定采取ITS，βtubulin基因片段， elongation factor 1α基因片段進行比對鑒定方法。具體方法是提取菌絲體DNA后，利用通用引物PCR擴增獲得基因片段后進行雙向測序，并將測序結果與NCBI已知牛樟芝序列進行比對最終確定所獲菌種為牛樟芝。同時，通過菌絲和菌絲顏色觀察進行驗證，并將菌種命名為AC001。

抗菌實驗所用致病菌：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，BC）、緩慢芽孢桿菌（B. lentus，BL）、無乳鏈球菌（Streptcococcus agalactiae，SAG）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus，BP）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，SF）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BS）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SAU）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus，ML）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）、溶血性葡萄球菌（Straphylococcus haemolyticus，SH）、銅尿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi B，SP）、大腸埃希菌（Escherichia coli，EC）。由昆明市食品藥品檢驗所贈送。

培養基：麥芽浸粉肉湯培養基（美國，BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛樟芝菌種活化配制PDA固體培養基，滅菌冷卻后，在無菌條件下，鉤取母種接于斜面培養基上，于25 ℃恒溫暗培養，待菌絲長滿斜面后用于菌絲體的液體培養。

1.2.2 供試牛樟芝菌絲體培養按照麥芽浸粉肉湯培養基（美國，BD公司）的使用說明配制成100 mL液體培養基滅菌后備用。之后鉤取1 g牛樟芝菌絲體接種于麥芽浸粉肉湯液體培養基中，置于25 ℃，轉速為150 r·min1搖床中培養60 d。

1.2.3 提取物制備培養物中具有抗菌活性的物質可能為帶有羥基的酚類物質，將所得培養物過濾后，調整pH值為2有利于之后酚類物質的萃取（Chiang et al， 2013）。按體積比1∶1加入乙酸乙酯振蕩混勻，30 min超聲2次，倒入分液漏斗靜置過夜。放出水相，上層乙酸乙酯層用旋轉蒸發儀濃縮致干，稱重后，加入1 mL二甲基亞砜（DMSO）備用。

1.2.4 提取物活性檢測供試菌株懸浮液制備：將13種致病菌分別接種于固體肉湯培養基中，于37 ℃，恒溫培養24 h。用接種鉤挑取已進行菌種斜面活化的培養基表面的菌塊，加入無菌生理鹽水，在組織研磨器中研磨均勻，并將菌懸液的濃度調節到1×106～6×106 cfu·mL1。

抑菌試驗：配制LuriaBertani固體培養基，將滅菌后還未凝固的培養基倒入20 mL于培養皿中冷卻、凝固，吸取250 μL的相應供試菌懸液滴加到固體培養基上，用無菌棉拭子分別均勻涂布培養基表面，制成含菌平板，每個菌種重復3次（Fang et al， 2014）。采用紙片法（黨悅方等， 2014；王軍等， 2013），將直徑5 mm的濾紙圓片，經高壓滅菌處理后干燥，分別滴加10 μL供試液作為試驗樣片，滴加DMSO液作為陰性對照樣片，用無菌鑷子將試驗樣片和1片陰性對照樣片貼放于每個培養皿表面，蓋好培養皿，于37 ℃培養24 h。

最小抑菌活性（MIC）的測定：采用二倍稀釋法（Lien et al， 2013； 趙敏等， 2011），測定相應具有活性提取物MIC值。

1.2.5 不同培養時間對抑菌活性影響的檢測分別配制12瓶100 mL麥芽浸粉肉湯液體培養基，每3瓶為一組，分別置于25 ℃，轉速為150 r·min1搖床中培養20、40、50、60 d后，將pH值按照1.2.3項下的方法調整為2，再按體積比1∶1加入乙酸乙酯振蕩混勻，30 min超聲2次，倒入分液漏斗靜置分層后，放出水相。然后再對水相連續萃取兩次后，將3次萃取的乙酸乙酯層合并用旋轉蒸發儀濃縮致干，加入1 mL DMSO溶解后供活性檢測。

1.2.6 數據統計將測定后的1.2.1至1.2.5中的抑菌圈直徑及MIC值列入Excel中，繪制柱狀表格。

2結果與分析

2.1 備試液濃度

麥芽浸粉肉湯培養基發酵提取物經乙酸乙酯（100 mL）萃取干燥后，最終獲得22.6 mg的干燥提取物，用1 mL DMSO全部溶解。

2.2 麥芽浸粉肉湯發酵液提取物活性比較

將牛樟芝菌絲體接種到麥芽浸粉肉湯培養基中進行培養，用13種致病細菌進行抗菌活性篩選，其抗菌活性如圖1所示。在BD培養基中生長的牛樟芝菌絲體發酵液初提物抗菌活性非常明顯，且具有廣譜抗菌活性，BD發酵液提取物對福氏志賀氏菌抑制效果最佳，對大腸埃希菌抑制效果最弱，對其余致病菌抑制效果均較為接近。說明用麥芽浸粉肉湯培養基培養牛樟芝菌絲體能夠使其產生抗菌活性物質。

2.3 麥芽浸粉肉湯發酵液提取物MIC

將BD培養基備試液用相應致病菌進行MIC值的測定，結果如圖1、2所示。圖2：A表示MIC值>1 mg·mL1的相應致病菌，圖2：B表示MIC值<1 mg·mL1的相應致病菌。在13種致病細菌中，MIC值超過1 mg·mL1有5個，其余8個致病菌MIC值都小于1 mg·mL1，MIC值最大為金黃色葡萄球菌，說明金黃色葡萄球菌對BD培養基中牛樟芝菌絲體所得的提取物不敏感，ML對應MIC值最小，說明BD發酵液提取物對藤黃微球菌有較好的抑制效果。在13種致病細菌對應的MIC中，緩慢芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、副溶血性弧菌對應的MIC值都在80 μg·mL1以下，可以推斷牛樟芝菌絲體在BD培養基中所得發酵液提取物對這5種致病菌具有較強抑制效果。

2.4 培養時間對抑菌活性的影響

根據2.2實驗結果，在本研究的活性篩選中，只有BD培養基所得發酵液提取物具有活性。因此，選擇BD液體培養基對牛樟芝菌絲體進行時間梯度培養。不同時間發酵液提取物抗菌活性如圖3所示。從圖3可以看出，牛樟芝菌絲體在BD液體培養基所得發酵液提取物在不同培養時間影響下，抑菌活性有明顯差別，培養到20 d時，提取物幾乎都不具備活性，僅對蠟樣芽孢桿菌有微弱抑制活性。培養到40 d時，提取物已經可以對所有供試菌產生抑制活性，培養到60 d時，提取物對每種被試菌都有非常良好的抑菌活性。不同培養時間所得提取物對金黃色葡萄球菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的抑制效果在40 d后都呈指數增長，對福氏志賀氏菌的抑制效果在40 d前基本呈梯度增長，40-50 d后抑制活性卻有所降低，對其余8種致病菌的抑制效果都呈現梯度增長。這說明60 d內，有抗菌效果的活性成分應逐漸增加，且在培養到60 d時，能夠抑制最多致病菌。3討論與結論

本研究用牛樟芝發酵液提取物對13種食品中常見致病細菌進行活性篩選，發現抗菌活性顯著，同時發現培養時間對抗菌活性物質的產生影響非常顯著，抗菌活性隨著培養時間的增加而增加。本研究中，除了使用麥芽肉湯液體培養基培養牛樟芝菌絲體，同時還使用了另外8種培養基（馬鈴薯葡萄糖淀粉、馬鈴薯蔗糖培養基、酵母蛋白胨培養基、胰蛋白胨大豆肉湯、營養肉湯、沙氏葡萄糖液體培養基、乳糖蛋白胨培養基、酵母麥芽浸粉肉湯）對牛樟芝菌絲體進行了培養，但是最后只有在BD公司的麥芽浸粉肉湯發酵液提取物中檢測到抑菌效果。由于BD液體培養基培養的牛樟芝菌絲體次級代謝產物具有廣譜抗菌活性， 在下一步研究中可以考慮圖

對其進行大量培養分離其中的有效抗菌物質單體。在BD次級代謝產物的MIC值測定中發現，在初提物的狀態下，其MIC值能夠達到80 μg·mL1，說明其中的抗菌物質含量較高。

牛樟芝菌絲體在不同液體培養基中活性差異顯著，這種差別可能在于不同培養基沉默或者刺激了牛樟芝菌絲體內某些關鍵基因的表達，而這些基因的表達才能真正地促使牛樟芝菌絲體產生活性次級代謝產物。從時間對牛樟芝菌絲體培養物抑制活性上看，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅尿假單胞菌、乙型副傷寒沙門氏菌的抑制效果在40 d后都呈指數增長，出現這種現象的原因可能在于控制合成抗菌物質的基因在前40 d內沒有表達，而在40 d后，培養基內的某些物質被分解代謝成為其他物質，這些被分解的物質正好作為基因表達的底物刺激了基因自身表達從而產生了相應的抑菌活性。9種培養基中只有BD液體培養基培養的牛樟芝菌絲次級代謝產物體具有抗菌活性，而其余8種次級代謝產物都不具有活性，同樣都是牛樟芝菌絲體，但是次級代謝產物差別非常大，這種差別可能就是由培養基的配方中某些成分的不同而使得基因表達狀況不同所致而本文是首次報道牛樟芝發酵液提取物具有顯著抗菌活性。

牛樟芝深層發酵后的次級代謝產物抗菌活性至今還未見報道，加之牛樟芝由于生長速度緩慢，子實體難以培養（郭立忠等， 2011），且其專性寄生的牛樟樹作為臺灣保護樹種，使得直接利用成熟牛樟芝研究抗菌活性難度較大，但采用液體發酵的方式培養牛樟芝菌絲體不僅能夠使菌絲體迅速生長，如果改變培養基成分、培養條件和添加酶抑制劑等干擾因素來刺激牛樟芝，還有可能激活不同的合成基因簇，從而獲得骨架新穎，活性高的新化合物（Bode et al， 2002； Berdy， 2005）。因此，本研究既能使牛樟芝菌絲快速生長，又能循環利用牛樟芝菌絲體，為有效利用牛樟芝菌絲體奠定基礎。

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