藤茶黃酮通過影響AMPK信號通路改善大鼠血脂水平的研究*

徐 楊，王緯臻，周亞峰,3△

(1.蘇州大學附屬第一醫院心血管內科 310006;2.同濟大學附屬上海市第四人民醫院藥劑科 200434；3.蘇州大學附屬獨墅湖醫院 215000)

高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)是一種臨床常見病，主要由體內脂質代謝紊亂或者運轉異常導致，以血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)其中一種或多種高于正常水平為主要特征。近年來，隨著人們飲食結構的改變，HLP發病率明顯上升，且青少年高TG血癥發病率也明顯上升[1]。HLP與心腦血管類疾病關系密切，如何調節脂質代謝異常成為預防與治療HLP及其慢性并發癥的重要環節。臨床治療HLP多采用他汀類藥物，但他汀類藥物只能降低20%～35%的LDL-C，且存在增加患者不耐受的風險[2]，所以尋找安全可靠的降脂藥物迫在眉睫。藤茶是我國特有的藥用植物，富含二氫楊梅素等黃酮類物質，具有降糖降脂、保肝護肝、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用，對于調節血脂水平有良好效果[3-4]。臨床上藤茶常用來治療炎癥、脂肪肝、腫瘤、糖尿病等疾病，但其調節血脂的作用機制報道較少。本研究通過建立HLP大鼠模型，觀察藤茶黃酮對大鼠血脂的影響，旨在為藤茶降血脂藥物的開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

SD雄性大鼠60只，超級清潔(SPF)級，7周齡，體重(250±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2016-0006，使用許可證號：SYXK(京)2017-0022。動物實驗獲得動物倫理委員會的批準(IACUC號：201801260019)，符合3R原則。大鼠購入后自由飲食、飲水，保持溫度22～24 ℃，濕度65%～80%，適應性飼養7 d。

1.1.2藥物、試劑和儀器

藤茶黃酮提取物(88.76%，其中二氫楊梅素占89.56%，楊梅素占3.31%，張家界茅巖莓有限公司)，洛伐他汀片(批準文號：國藥準字H37020089，20 mg，山東魯抗醫藥股份有限公司)，兔抗大鼠腺苷酸活化蛋白激酶α(AMP activated protein kinase，AMPKα)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α(phospho-AMP-activated protein kinase，phospho-AMPKα)、肝激酶B1(liver kinaseB1，LKB1)、磷酸化肝激酶B1(phospho-liver kinase B1，phospho-LKB1)多抗(英國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，TC、TG、LDL-C和高密度脂蛋白膽固醇(high densitylipoprotein-cholesterol，HDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測試盒(南京建成生物工程研究所)，7100全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)，5804R大容量冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，Spectra Max190酶標儀(美國Molecular Device公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，高脂飼料(北京科奧協力飼料有限公司)。

1.2 方法

1.2.1HLP大鼠模型的建立

60只大鼠取10只作為正常對照組，飼喂普通飼料。參照文獻[5]，其余50只大鼠建立HLP模型，建模大鼠給予高脂飼料，飼喂前尾靜脈取血檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，連續喂養30 d后，建模大鼠禁食12 h，第2天尾靜脈取血檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，與飼喂高脂飼料前比較，TC、TG、LDL-C至少一種升高50%，提示模型成立。建模成功大鼠(47只，剔除升高不達標大鼠3只)分為模型組10只、TC-L組10只、TC-M組9只、TC-H組9只、陽性對照組9只。整個實驗過程所有大鼠均給予正常飲食、飲水。

1.2.2給藥方法

建模成功24 h后，尾靜脈取血檢測各組大鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。之后進行藥物干預，大鼠給藥用量根據文獻[6]，藤茶黃酮用80%甲醇超聲溶解后分別配成10、20、40 mg/mL的混懸液備用；洛伐他汀片用生理鹽水配制成終濃度2 mg/mL的溶液備用；TC-L組、TC-M組、TC-H組分別按照對應濃度按10 mL/kg灌胃藤茶黃酮混懸液，陽性對照組按10 mL/kg灌胃洛伐他丁溶液，正常對照組及模型組按10 mL/kg灌胃生理鹽水，每天1次，連續4周。

1.2.3血脂四項檢測

末次給藥后禁食12 h，腹腔注射質量分數1%戊巴比妥鈉進行麻醉，心臟采血，3 500 r/min離心10 min，分離血清備用。取血清20 μL采用酶法用全自動生化分析儀測定TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。

1.2.4血清MDA、SOD和GSH-Px檢測

取血清20 μL，檢測MDA、SOD和GSH-Px水平，其中MDA采用硫代巴比妥酸法，SOD采用連苯三酚自氧法，GSH-Px采用NADPH耦聯法，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書。

1.2.5肝組織AMPKα和LKB1 mRNA表達檢測

采血完畢后，處死各組大鼠，取右肝液氮保存備用。取液氮保存的肝組織80 mg，采用Trizol法提取肝組織總RNA，測定總RNA的濃度和純度。用逆轉錄試劑盒逆轉錄cDNA。反應體系：2 μL目的基因引物，2 μL cDNA模板，10 μL Taq DNA聚合酶，加雙蒸水至總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，65 ℃退火10 s，70 ℃延伸5 s，共40個循環。以β-actin為內參基因，最終讀取CT值，按照公式2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達水平。引物序列見表1。

1.2.6肝組織AMPKα、phospho-AMPKα、LKB1和phospho-LKB1蛋白表達檢測

取液氮保存的肝組織100 mg，加入組織蛋白抽提液勻漿處理，冰上孵育20 min，離心取上清液；BCA法檢測蛋白濃度。蛋白變性上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至PVDF膜；洗膜，5%脫脂牛奶搖床孵育2 h，加入一抗AMPKα(1∶1 000)、phospho-AMPKα(1∶1 000)、LKB1(1∶1 000)、phospho-LKB1(1∶1 000)、β-actin(1∶4 000)4 ℃封閉過夜；洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下搖床孵育1 h，洗膜，采用ECL試劑進行顯色反應，暗室下曝光成像。通過Image J軟件分析圖像，以內參β-actin蛋白條帶為對照，以目的條帶與β-actin條帶灰度的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

表1 引物序列

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

與正常對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，TC-L組、TC-M組、TC-H組及陽性對照組TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；藤茶黃酮各組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平變化呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.2 血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較

與正常對照組比較，模型組MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，TC-L組、TC-M組、TC-H組及陽性對照組MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；藤茶黃酮各組MDA、SOD、GSH-Px水平變化呈劑量依賴性(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較

2.3 肝組織AMPKα、LKB1 mRNA表達比較

各組肝組織AMPKα、LKB1 mRNA表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠肝組織AMPKα、LKB1 mRNA表達比較

2.4 肝組織AMPKα、phospho-AMPKα、LKB1及phospho-LKB1蛋白水平比較

與正常對照組比較，模型組phospho-AMPKα、phospho-LKB1蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，TC-L組、TC-M組、TC-H組及陽性對照組phospho-AMPKα、phospho-LKB1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；藤茶黃酮各組phospho-AMPKα、phospho-LKB1蛋白表達變化呈劑量依賴性(P<0.05)。AMPKα、LKB1蛋白表達組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5、圖1。

表5 各組大鼠肝組織AMPKα、phospho-AMPKα、LKB1、phospho-LKB1蛋白表達比較

A：正常對照組；B：模型組；C：TC-L組；D：TC-M組；E：TC-H組；F：陽性對照組。

3 討 論

HLP可引發多種疾病，TG和LDL-C升高在動脈粥樣硬化性心血管病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的發生、發展過程中起著關鍵作用，與心腦血管疾病關系密切[7-8]。血脂沉積，巨噬細胞吞噬脂質形成泡沫細胞，逐漸發展為斑塊，堵塞血管，影響血液循環，促進內皮細胞自由基釋放，引起動脈壁抗氧化功能下降，導致ASCVD發生，故血脂異常患者進行調脂治療對于降低和減少ASCVD發生、發展，維持心血管健康及延長壽命有著積極的意義[9-10]。中藥黃酮類化合物具有顯著的降血脂和抗氧化作用，且安全性可靠。藤茶的黃酮含量在目前被研究的植物中居首位，還含有維生素、氨基酸、蛋白質和礦物質等多種營養成分，在我國民間有著非常悠久的使用歷史，常用來預防和治療感冒發熱、高血壓、高血糖、心腦血管疾病[11]。

動物實驗研究表明，藤茶可降低血清TC水平，減少脂質蓄積，有效預防和改善HLP及高血糖癥等代謝性疾病[12]。另有研究發現，藤茶黃酮能顯著降低小鼠血脂水平，維持體內糖脂代謝平衡[13]。本研究經過高脂飼料誘導后，造模大鼠血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高，建立了典型混合型HLP模型；干預后，藤茶黃酮各劑量組血清TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，各劑量組高脂血癥均有不同程度的改善，且以TC-H組改善最顯著，提示藤茶黃酮能有效改善HLP模型大鼠血脂水平，對HLP的脂質代謝紊亂有調節作用，有顯著降血脂作用。

MDA、SOD和GSH-Px能夠反映機體抗氧化酶體系功能狀態，MDA作為脂質過氧化物的產物，反映脂質過氧化程度；SOD可減輕過氧化物引起的氧化損傷，提高機體抗氧化能力；GSH-Px通過催化谷胱甘肽還原體內有害的過氧化物來保護細胞。本研究中，藤茶黃酮各劑量組能夠顯著降低MDA水平，提高SOD、GSH-Px水平，且以高劑量組作用最顯著，提示藤茶黃酮可以降低脂質過氧化，提高機體抗氧化能力。YE等[14]研究顯示，藤茶提取物及其主要成分二氫楊梅素在豆油和牛肉中具有明顯的抗氧化活性。ZHANG等[15]發現藤茶提取物可以抑制豬肉中脂質和蛋白質氧化，具有明顯的自由基清除活性。本研究得出相似結果，提示藤茶黃酮可以有效降低脂質過氧化，減少氧化損傷，提高機體抗氧化能力。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調節機體能量代謝，維持能量平衡，與HLP、肥胖癥、糖尿病等多種由能量代謝異常引起的疾病相關。AMPK包含α催化亞基和β、γ調節亞基，LKB1是AMPK的主要上游激酶，通過phoshpo-AMPKα上的蘇氨酸殘基(Thr172)而增強AMPK的磷酸化水平，從而激活AMPK，活化的AMPK可以磷酸化乙酰輔酶A羧化酶、羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶從而抑制脂肪酸和TC的合成，還可以抑制甘油-3-磷酸酰基轉移酶來抑制TG合成[16]。LKB1是磷酸化和活化AMPK的必要因素，LKB1表達降低，AMPK的磷酸化和活化隨之降低[17]。LKB1/AMPK通路是肝臟中最主要的磷酸化激活AMPK的信號通路，在脂質和糖代謝過程中起著重要作用，肝臟中AMPK活化，能改善TC和葡萄糖代謝，減輕肝臟氧化應激和脂質蓄積[18]。LI等[19]研究顯示，通過上調LKB1/AMPK通路可降低TC和TG水平，從而改善肝脂肪變性。XI等[20]研究表明，下丘腦LKB1過表達可以激活AMPK通路抑制肥胖癥的發展。本研究藤茶黃酮各劑量組phospho-AMPKα、phospho-LKB1蛋白表達明顯升高，提示藤茶黃酮通過活化AMPK信號通路，促進AMPKα、LBK1的磷酸化，調節脂質代謝，改善血脂水平。

綜上所述，藤茶黃酮能夠降低HLP大鼠TC、TG、LDL-C水平，提高HDL-C水平，降低脂質過氧化，提高機體抗氧化能力，其機制可能是通過激活AMPK信號通路促進AMPKα、LBK1的磷酸化從而發揮調控作用，為臨床應用藤茶黃酮治療HLP提供一定的理論依據。