一種堿性γ-谷氨酰轉肽酶在Bacillus subtilis 168中的分泌表達與酶學性質分析

Bernard Gitura Kimani， 楊套偉， 饒志明*， 張 顯， 徐美娟， 和 斐

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

一種堿性γ-谷氨酰轉肽酶在Bacillus subtilis 168中的分泌表達與酶學性質分析

Bernard Gitura Kimani1，2， 楊套偉1，2， 饒志明*1，2， 張 顯1，2， 徐美娟1，2， 和 斐1，2

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

將γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）在Bacillus subtilis 168同源過量表達，發現該酶能夠自動分泌到細胞外，且重組菌酶活比原始菌提高了3 568倍。通過SDS-PAGE分析發酵液上清液發現，該γ-谷氨酰轉肽酶是由一個相對分子質量為42 000的大亞基和一個22 000的小亞基組成。通過酶學性質分析發現，該γ-谷氨酰轉肽酶是一個耐堿性的酶，最適反應pH為10；同時該酶具有良好的耐熱性，最適反應溫度達到50℃；另外，加入5.0 mmol/L的Mg2+、Ca2+、K+、La3+、Li+和 NH4+對GGT轉肽活力具有明顯的促進作用，其中添加的NH4+對GGT活力促進作用最為顯著，GGT活力提高45%以上，而Cu2+和Zn2+則對其具有抑制作用。

γ-谷氨酰轉肽酶；分泌表達；酶學特征；Bacillus subtilis 168

γ-谷氨酰轉肽酶 （γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC：2.3.2.2）屬于N-端親和水解酶系，普遍存在于生物體內[1]，參與體內谷胱甘肽的代謝，在抗氧化方面具有非常重要的作用[2]。GGT主要催化谷胱甘肽或其他含γ-谷氨酰的化合物中的γ-谷氨酰基團轉移至其他氨基酸等受體，形成新的含γ-谷氨酰基的氨基酸[3]。哺乳動物體內的GGT鑲嵌在細胞膜中，而作用位點位于細胞膜外部[4]，而細菌體內的GGT一般分布于細胞周質中或分泌到細胞外，如芽孢桿菌合成的GGT基本全部分泌到胞外[1，5]。所有的GGT均由單個基因編碼合成一條多肽鏈，然后分裂成含有兩個大小亞基的成熟酶，大亞基相對分子質量約38 000～72 000，而小亞基相對分子質量一般22 000～66 000[6]。

據報道，GGT主要用于合成多種食品及醫藥功能性γ-谷氨酰基化合物，例如L-茶氨酸、谷氨酰基牛磺酸、γ-L-谷氨酰基-L-多巴、γ-L-谷氨酰基-L-色氨酸等[7]，其中研究最廣泛的是合成L-茶氨酸。目前，大部分來自細菌的GGT通常在E.coli中過量表達和酶學表征，而在枯草芽孢桿菌（B.subtilis）中的研究還比較少。另外，近年來研究發現，L-茶氨酸具有鎮靜減壓、增強免疫力和預防腫瘤等重要作用，因此常作為食品添加劑為人類健康服務。目前，大部分研究是將GGT在E.coli中過量表達和合成L-茶氨酸[8-9]，但是，E.coli并不是食品安全菌株，因此并不符合食品安全生產的要求。而枯草芽孢桿菌是被美國FDA認可的安全菌株[10]，因此，利用枯草芽孢桿菌構建L-茶氨酸生產菌更符合食品安全生產的要求。另外，E.coli中的GGT一般是周質空間蛋白質，不利于分離純化；而枯草芽孢桿菌的GGT是胞外酶，分離純化步驟簡單、操作成本低。本研究首先將GGT克隆到B.subtilis168進行分泌表達，同時對其酶學性質進行分析，為后續用于合成L-茶氨酸提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

Bacillus subtilis168和E.coli JM109為作者所在研究室保藏菌株；基因ggt來源B.subtilis168，同時B.subtilis168也是基因ggt過量表達的宿主菌；載體pMD18-T，購自大連寶公司，用于ggt克隆；質粒pMA5為作者所在研究室保藏，用于ggt在B.subtilis168中的過量表達。

1.2 基因ggt克隆與表達載體pMA5-ggt的構建

首先，根據NCBI公布的B.subtilis168的ggt基因設計以下2條引物：

P1：5’-ATCGGATCCATGAAAAGAACGTGGAA C-3’（BamHI）

P2：5’-GGCACGCGTTTATTTACGTTTTAAATT AA-3’（MluI）

以上引物由上海生工生物工程有限公司合成并測序驗證。然后采用Ezup細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）獲得的B.subtilis168基因組DNA為模板，利用引物P1和P2通過PCR擴增獲得。

PCR擴增體系50 μL：B.subtilis168基因組模板2 μL，10X buffer 5 μL，dNTP 4 μL，引物P1、P2各0.5 μL，ExTaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。

ggt基因PCR擴增條件：94℃預變性5 min，95℃變性10 s，56℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。

PCR反應產物用0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒（Takara）回收目的條帶，回收的基因片段與pMD18-T連接，轉化E.coli JM109，經過氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽性轉化子。提取質粒酶切驗證，重組質粒命名為T-ggt，擴增獲得的DNA測序驗證由上海生工生物工程有限公司完成。經測序驗證正確的重組質粒T-ggt，用BamHI和MluI雙酶切后，與經過相同酶切的pMA5質粒連接，構建表達載體pMA5-ggt。

1.3 在B.subtilis168中的表達

首先，取1 μLpMA5-ggt通過化學轉化法轉化至B.subtilis168中[11]，挑取陽性轉化子單菌落接種于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃、160 r/min培養10 h，然后以6%的接種體積分數轉接于50 mL含有25 g蔗糖，5 g蛋白胨，15 g玉米漿，0.5 g MgSO4·7H2O和1 g K2HPO4·3H2O（pH 7.2）的發酵培養基中，37℃、200 r/min培養60 h。

1.4 GGT純化與表達分析

將培養60 h的菌液在4℃、10 000 g離心30 min，上清液采用0.45 μm濾膜過濾后，采用Ni-NTA蛋白純化柱純化目的蛋白質，經過兩次上樣，蛋白質末端的6個His與Ni-NTA的金屬離子進行螯合。洗脫過程：首先用不含有咪唑的緩沖液洗柱，除去未與Ni-NTA結合的細胞體及雜蛋白質，然后用不同濃度的咪唑（20～300 mmol/L）緩沖液進行梯度洗脫，在一定的咪唑濃度條件下，可以得到較純的酶液。利用SDS-PAGE分析GGT表達及純化情況，首先用5 g/dL的濃縮膠及12～15 g/dL分離膠的不連續垂直平板電泳進行蛋白質分離，然后用考馬斯亮蘭R-250染色。總蛋白質質量濃度采用Brandford方法，以牛血清蛋白（BSA）作為標準蛋白質[12]。

1.5 GGT酶活力測定

GGT酶活力采用分光光度計法測定[13]。反應體系 （1 mL）：2.5 mmol/L γ-谷氨酰對硝基苯胺，60 mmol/L雙甘二肽，750 mmol/L NaCl，50 mmol/L硼酸-NaOH（pH 10），10 μl適當稀釋的酶液，在37℃反應10 min后，加入2 mL 3.5 mol/L的醋酸溶液終止反應，在410 nm處測定吸光值。該條件下每分鐘生成1 μmol γ-谷氨酰對硝基苯胺所需的酶量定義為一個酶活單位。

1.6 酶學性質分析

1.6.1 最適反應pH及pH穩定性 將酶液分別置于pH 8～11的緩沖液中，在37℃反應10 min后測定剩余酶活力，確定其最適反應pH。另外，將酶液分別置于pH 3～12的緩沖液中，在37℃反應20 h后，測定剩余酶活力，考察其pH穩定性。

1.6.2 最適反應溫度及溫度穩定性 確定最適pH后，將酶液分別置于20～70℃條件測定酶活力，確定其最適反應溫度。另外，將酶液分別置于50、60、70℃條件下測定酶活力，考察其溫度穩定性。

1.6.3 各種陽離子對GGT酶活的影響 將酶液分別置于含有5.0 mmol/L的Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+、La3+、Li+、Cu2+、Zn2+、NH4+的溶液中，在37℃反應10 min后，測定剩余酶活力，考察各種陽離子對GGT活力的影響。

2 結果與分析

2.1 基因克隆及其表達載體的構建

提取B.subtilis 168的基因組DNA為模板，以P1/P2引物進行PCR擴增，獲得包含18 bp His的GGT基因，基因大小與NCBI報道的一致 （見圖1（a）），將該基因克隆到pMD-18T載體上，獲得T-ggt重組質粒。隨后將T-ggt轉化至E.coli JM109中，提取質粒，經酶切和基因序列測序驗證（見圖1（b）），保證所克隆基因序列及酶切位點的準確性。重組表達載體構建示意圖如圖1（c）所示：將驗證正確的載體T-ggt經BamHI和MluI酶切，膠回收獲得的ggt基因與經同樣酶切的pMA5質粒連接，成功構建重組表達載體pMA5-ggt，并且轉化至B.subtilis 168，并提取質粒進行酶切驗證 （見圖1（d）），確保重組菌構建成功。

圖1 ggt基因克隆及其表達載體pMA5-ggt的構建Fig.1 Amplification of ggt gene and construction of pMA5-ggt recombinant vector

2.2 重組菌B.subtilis 168/pMA5-ggt表達

重組表達載體pMA5-ggt轉化B.subtilis 168，成功獲得重組菌B.subtilis 168/pMA5-ggt，挑取單菌落接種于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃、160 r/min培養10 h，然后以體積分數6%的接種量轉接于發酵培養基中，37℃、200 r/min培養60 h。菌液在4℃、10 000 g條件下離心30 min。由表1可知，重組菌胞外酶活為26.464 U/mL，比原始菌（0.007 415 U/mL）提高了3 568倍，且81%以上的GGT被分泌到胞外，說明GGT在B.subtilis 168中成功過量分泌表達。然后將上清液進行蛋白質電泳分析，結果如圖2所示，產物在42 000和 22 000處有條帶，與研究報道[17]的B.subtilis GGT大小亞基的相對分子質量及序列預測的相對分子質量相似，總相對分子質量約64 000。

表1 GGT在重組枯草芽孢桿菌過量表達分析Table 1 GGT production in recombinant B.subtilis

2.3 重組GGT分離純化

由于在重組蛋白質GGT的N端加入了6個組氨酸標簽，因此，可以采用Ni-NTA一步純化獲得目的蛋白質。離心獲得的上清液采用0.45 μm濾膜過濾后，采用Ni-NTA蛋白純化柱純化獲得電泳純的目的蛋白質。重組酶純化步驟及結果如表2所示，重組GGT純化倍數為2.57倍，回收率為21.9%，重組GGT的比酶活為49.8 U/mg。對純化的酶進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示，重組酶在42 000和22 000處有條帶，總相對分子質量約64 000，而基本上沒有其它條帶，說明成功獲得電泳純的重組酶。

表2 重組GGT純化步驟及結果分析Table 2 Purification summary of GGT

圖2 重組GGT純酶SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of the purified GGT

2.4 重組GGT酶學性質

基于獲得的電泳純重組酶，對其進行酶學性質研究，包括最適反應pH及pH穩定性、最適反應溫度及溫度穩定性，以及各種離子對其活力的影響。

2.4.1 最適反應pH及pH穩定性 環境pH對酶的催化活性具有較大的影響，環境過酸或過堿都有可能導致酶發生不可逆變性失活，只有在最適pH環境中，才能保證酶和底物處于最佳解離狀態，最適宜相互作用，從而達到最佳的催化效果。因此，首先研究了GGT催化的最適反應pH及pH穩定性。結果如圖3（a）所示。GGT轉肽催化最適pH為10.0，在pH 9.0～10.5范圍內，GGT保持80%以上的活力，而當pH＜9或pH＞10.5，GGT轉肽催化活力迅速下降至50%以下，說明該酶催化范圍比較窄。而當pH為8.0時，GGT僅保持25%的活力，說明該酶對酸性環境非常敏感。由圖3（b）所示，GGT在pH 5～12范圍內保存20 h后，剩余酶活力達到80%以上，說明GGT在pH 5～12范圍內穩定性良好，同時說明該酶具有較寬泛的pH耐受范圍；然而，當環境pH低于5時，保存20 h后酶活力迅速下降，說明該酶在強酸性環境中穩定性較差。綜上所述，該GGT在堿性條件下能夠充分發揮作用，而合成茶氨酸過程中涉及到轉肽反應。堿性環境最有利于轉肽反應，因此，該堿性GGT非常適合用于茶氨酸的合成。

圖3 重組GGT最適pH及pH穩定性Fig.3 Effect of pH on activity and stability of GGT

2.4.2 最適反應溫度及溫度穩定性 環境溫度是影響酶催化效率的另一個重要因素。一般來說，溫度過低時，酶的活性也較低，酶的催化效率也隨之降低；適度提高溫度可以提高酶催化效率，而溫度過高會使酶發生不可逆的變性失活。因此，只有保持合適的溫度才能保證酶高效的催化作用。溫度對GGT活力的影響如圖4所示，GGT最適作用溫度為50℃，而當溫度低于或高于50℃，GGT活力迅速下降，說明GGT對環境溫度的變化非常敏感，而其溫度作用范圍也較窄，只是在50℃左右才能保持較高的活力。隨后，考察了GGT的熱穩定性，結果如圖5（a）所示，GGT在溫度低于50℃表現出良好的熱穩定性，即使在較高溫度50℃條件下（見圖5（b））連續保存6 h，仍保留85%以上的酶活力；而當環境溫度高于50℃時，GGT的熱穩定性迅速下降，如溫度升高至60℃時，GGT活力的半衰期只有12 min，在此條件下保存30 min，GGT殘留活力已經降至30%以下。當繼續升高溫度至70℃時，GGT活力在10 min內下降至10%以下。說明當環境溫度高于60℃時就可以使GGT快速變性失活。

圖4 溫度重組GGT活力的影響Fig.4 Effect of temperature on activity and thermostability of GGT

圖5 重組GGT熱穩定性研究Fig.5 Effect of temperature on GGT thermostability

2.4.3 各種陽離子對GGT酶活的影響 金屬離子對酶活力具有重要的影響，有的金屬離子可以顯著提高酶的活力，而有些離子則會嚴重抑制酶的催化活力。因此，考察以下常見離子Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+、La3+、Li+、Cu2+、Zn2+、NH4+對GGT轉肽活力的影響。結果如圖6所示，與對照組添加任何不外源離子的相比較，Cu2+和Zn2+對GGT活力具有明顯抑制作用，加入5.0 mmol/L的Cu2+或Zn2+時，GGT活力下降了20%以上；而5.0 mmol/L的Ba2+對GGT轉肽活力基本沒有影響；而同樣質量濃度的Mg2+、Ca2+、K+、La3+、Li+和 NH4+對GGT轉肽活力具有明顯的促進作用，其中添加5.0 mmol/L的NH4+對GGT活力促進作用最為顯著，GGT活力提高45%以上。Shuai等（2011）報道發現添加Ca2+、K+、Mg2+等能夠提高GGT活力，而添加Cu2+和Zn2+則會抑制GGT活力。而作者首次發現添加鑭系元素（La3+）對GGT活力具有促進作用。

圖6 金屬離子對GGT活力的影響Fig.6 Effect of ions on GGT activity

2.4.4 來源于芽孢桿菌屬GGT酶學性質特征比較目前已報道的GGT基本都是來源于枯草芽孢桿菌，而GGT來源的菌株不同，酶學性質也會存在差別。本研究中對來源于不同枯草芽孢桿菌的GGT酶學性質特征進行比較，結果如表3所示。Ogawa等在1991年報道了來源于枯草芽孢桿菌的GGT特征，發現該GGT由兩個不同大小的亞基組成，總相對分子質量約為62 000，這與本研究及Shuai等發現的GGT相對分子質量基本一致，而Wu等則發現來源于B.subtilis NX-2的GGT具有較大的相對分子質量，約為75 000。通過考察最適作用pH發現，不同芽孢桿菌來源最適作用pH存在一定差異，最適pH在 7.0～10.0之間。而本研究中來源于菌株 B. subtilis 168和 Shuai等發現的來源于 B.subtilis SK11.004的GGT均為堿性GGT，最適pH為10。但是，本研究報道的GGT最適作用溫度（50℃）高于Shuai等[14]發現的來源于 B.subtilis SK11.004的GGT的最適作用溫度 （37℃），而目前已報道的GGT最適作用溫度在37～60℃之間。

表3 不同來源的芽孢桿菌GGT酶學性質特征比較Table 3 Comparison of biochemical properties of GGTs from different Bacillus sp.

3 結語

本文首次報道將來源于枯草芽孢桿菌的GGT在B.subtilis 168進行同源過量表達，結果發現，該酶大部分都被分泌到細胞外（見表1），這為后續酶的分離純化提供了便利，降低了分離純化的成本。通過對來源于B.subtilis 168的GGT酶學性質的研究，發現該酶最適反應溫度達到50℃，而在低于50℃的環境中具有良好的熱穩定性，有利于后續催化反應操作的連續性，進而提高產物產量。另外，研究發現，該GGT是一種堿性酶，在催化L-谷氨酰胺合成L-茶氨酸的過程中，需要加入乙胺，從而造成反應體系pH升高，為了使催化反應快速有效進行，需要加入大量鹽酸調節pH。而本文報道的GGT最適反應pH為10，屬于較強堿性環境。因此，用本課題研究的GGT催化L-谷氨酰胺合成L-茶氨酸時，與最適反應pH＜10的GGT比較，需要添加較少量的鹽酸即可進行有效催化反應，從而降低生產成本。因此，本文報道的堿性GGT更具有工業應用價值。在后續研究中，作者將對該GGT催化L-谷氨酰胺合成L-茶氨酸催化條件深入研究，進一步提升其工業化合成L-茶氨酸的應用價值。

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Homologous Cloning and Characterization of Bacillus subtilis 168 γ-Glutamyltranspeptidase

Bernard Gitura Kimani1，2， YANG Taowei1，2， RAO Zhiming*1，2， ZHANG Xian1，2， XU Meijuan1，2， HE Fei1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Gammaglutamyltranspeptidase gene from Bacillussubtilis168 was cloned and overexpressed with pMA5 vector in Bacillus subtilis 168 for overproduction of GGT.GGT was secreted in the extracellular space.The overexpressed enzyme was 3568 fold higher in activity than that from the parent strain and exhibited a specific transpeptidase activity of 49.8 U/mg.The molecular mass of two sub-units was estimated to be 42 000 and 22 000 respectively，by SDS-PAGE. The overexpressed GGT was a very versatile enzyme in alkaline pH.Its optimal temperature was 50℃ showing a moderately high thermostability.The effect of ions on purified GGT was also examined.Results showed that NH4+had the highest activation effect on GGT（＞45%），other ions such as Ca2+、K+、Mg2+、Li+and La3+had a significant activation effect on the enzyme，whereas Cu2+and Zn4+recorded the highest deactivation on GGT activity.

γ-Glutamyltranspeptidase，homologous cloning，enzymatic characterization，Bacillus subtilis 168

Q 78

A

1673—1689（2017）02—0149—07

2015-04-17

國家973計劃項目（2012CB725202）；國家863計劃項目（2015AA021004）；國家自然科學基金項目（31400082）；教育部重點項目（113033A）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。

*通信作者：饒志明（1975—），男，江西臨川人，農學博士，教授，博士研究生導師，主要從事工業微生物育種發酵代謝方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn

Bernard Gitura Kimani，楊套偉，饒志明，等.一種堿性γ-谷氨酰轉肽酶在Bacillus subtilis 168中的分泌表達與酶學性質分析[J].食品與生物技術學報，2017，36（02）：149-155.