基因組編輯技術及其安全管理

沈平，章秋艷，楊立桃，張麗，李文龍，梁晉剛，李夏瑩，王顥潛，沈曉玲，宋貴文

（1農業部科技發展中心，北京 100122；2農業部環境保護科研監測所，天津 300191；3上海交通大學，上海 200240；4中南民族大學生命科學學院，武漢 430074；5天津市農業科學院，天津 300381）

基因組編輯技術及其安全管理

沈平1，章秋艷2，楊立桃3，張麗4，李文龍1，梁晉剛1，李夏瑩1，王顥潛1，沈曉玲5，宋貴文1

（1農業部科技發展中心，北京 100122；2農業部環境保護科研監測所，天津 300191；3上海交通大學，上海 200240；4中南民族大學生命科學學院，武漢 430074；5天津市農業科學院，天津 300381）

基因組編輯技術利用核酸酶對生物體內的DNA雙鏈進行斷裂，并以非同源末端連接或同源重組的方式對基因組DNA特定位點進行突變、缺失或者基因的插入與替換。鋅指核酸酶、轉錄激活因子樣效應物核酸酶、成簇規律間隔短回文重復序列是目前基因組編輯技術應用中的3種關鍵核酸酶。基因組編輯技術已在植物基因功能、育種等領域廣泛應用，特別是基于成簇規律間隔短回文重復序列的基因編輯技術 CRISPR-Cas9。具有優良性狀的基因組編輯大豆、玉米等產品已逐步從實驗室走向田間，基因組編輯作物展現了較傳統轉基因作物更為優越的應用前景。本文簡要概述了主要使用的3種基因組編輯技術及其原理。對這些技術的優缺點進行了分析，并依據物種分類梳理了利用上述3種技術在動物、植物中突變體建立、基因功能研究、分子育種等方面的研究進展。同時，針對基因編輯產物的產業化應用前景，討論了基因編輯技術及其產品較傳統轉基因技術產品的優勢，分析了基因編輯技術及其產品可能因脫靶效應而引發的生物安全風險,介紹了美國、歐盟等國家對基因編輯技術及其產品安全管理和商業化應用的政策。文章結合中國現行法規對轉基因生物的定義及安全評價（實質等同、個案分析）原則，討論了基因編輯技術及其產品的安全管理，初步提出了基于傳統轉基因生物安全評價框架的基因編輯產品的安全評價和管理思路。針對基因編輯產品需要按照個案原則進行評價和管理，安全評價重點開展分子特征及食用安全評價；同時需要針對基因編輯技術的特點建立更加有效、特異的檢測新方法，實現對基因編輯產品的有效監測，以促進基因組編輯產品的商業化應用。

基因組編輯；轉基因生物；安全監管

隨著分子生物學的迅速發展，能夠實現對生物體基因組精確編輯的多種基因組編輯（genome editing）技術相繼出現。可對生物體基因組進行精確地敲除、插入或置換的這些技術已被用于動物、植物基因組的改造，作為一種新型技術展現出在基因工程技術育種中的巨大潛力。基因組編輯技術為“按需定制”的新型分子育種提供了技術保障，將會廣泛應用于現代農業育種。基因組編輯技術雖然具有高精確性，但由于其脫靶效應的存在，可能為基因組編輯技術產品帶來潛在的安全性問題，也為基因組編輯技術產品的安全管理帶來新的挑戰。

1 基因組編輯技術簡介

基因組編輯技術是指對基因組進行定點修飾和改變的技術。該技術主要利用序列特異性的DNA結合結構域和非特異性的 DNA修飾結構域組合而成的序列特異性核酸內切酶（sequence specific nuclease, SSN）在基因組特定位置對雙鏈DNA進行定向切割，進而激活細胞自身的修復機能來實現基因敲除、定點插入或替換等定向改造[1]。這種技術能夠在不改變目標生物基因組整體穩定性的基礎上，在目標位點產生堿基缺失或插入，實現對單一或多個性狀的消除或獲得，研究基因的功能，進而應用于生物育種、臨床治療等領域。

目前，基因編輯技術主要有：鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）[2]、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）系統[3]、規律成簇的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR關聯蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）系統[4]、格氏嗜鹽堿桿菌的 Argonaute蛋白（Natronobacterium gregoryi Argonaute, NgAgo）核酸酶[5]和結構引導的內切酶（structure-guided nuclease，SGN）系統[6]等，其基本原理是核酸內切酶在基因組的特定位點切割DNA雙鏈，然后利用細胞自身的DNA損傷應答機制，以同源重組修復（homologydirected repair，HDR）或非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）的方式修復斷裂DNA雙鏈，從而實現外源基因的插入、一個或多個堿基的缺失或替換，使目的基因的功能發生改變。上述5種基因組編輯技術的主要區別在于對序列的靶向識別方式和機制。ZFNs和 TALEN是利用蛋白與DNA結合方式靶向特定的基因組位點，而CIRISPR/ Cas9、NgAgo和 SGN系統則利用簡單的核苷酸互補配對方式識別結合基因組靶位點。

ZFNs是經過人工改造的核酸內切酶，由特異性DNA結合結構域和非特異性切割域核酸內切酶FokⅠ兩部分組成。結合結構域由一系列串聯的具有Cys2-His2結構的鋅指蛋白構成[2]。每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的堿基三聯體，結合域能識別一段 9—12 bp的堿基序列。在基因組靶標位點左右兩邊各設計1個ZFN，識別結構域會將2個ZFN結合到特定靶點，當2個識別位點間距為6—8 bp時，2個FokⅠ單體相互作用形成二聚體，行使酶切功能對目標 DNA雙鏈進行切割，實現基因組編輯。

TALEN的構成與ZFN相似，由改造的TALE蛋白 DNA結合域和 FokⅠ核酸酶兩部分融合而成，TALEN蛋白最初來源于黃單胞桿菌。TALEN和ZFNs的差別在于特異性的結合結構域，其DNA結合域由13—28個串聯的具有DNA識別特異性的高度保守的重復單元組成。每個重復單元含有大約34個氨基酸，且不同單元的氨基酸序列非常保守，僅第12和13位氨基酸不同。這兩個可變氨基酸被稱為重復可變的雙氨基酸殘基（repeat variable-diresidue，RVD），它們決定重復單元的DNA識別特異性。TALEN根據靶標位點兩側的序列設計一對TALEN，結合到對應的識別位點后，2個 FokⅠ單體相互作用形成二聚體，對靶標序列進行切割，實現基因修飾[3]。

CRISPR-Cas9系統基于細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制而產生，由CRISPR和及其相關Cas蛋白組成。該系統先產生與靶標序列對應的RNA序列，與病毒或質粒的DNA互補形成RNA-DNA復合結構，然后引導 Cas9內切酶對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂，進而對基因組進行編輯[4]。靶序列通常由23個堿基組成，包括與小向導RNA（small guide RNA，sgRNA）堿基配對的前20個堿基，以及3'端Cas9識別的三核苷酸NGG序列PAM（protospacer adjacent motifs，PAM）。Cas9切割位點位于PAM上游3nt處。靶序列的結合特異性是由sgRNA和PAM序列共同決定的。Cas9蛋白不需要形成蛋白二聚體起作用，而向導RNA（guide RNA，gRNA）通過堿基互補配對決定靶序列的特異性。因此，CRISPR/Cas9系統大大降低了技術門檻，一經面世就迅速得到廣泛應用。

NgAgo-gDNA系統的工作原理與 CRISPR-Cas9類似，都是在引導序列的引導下，核酸酶對特定位點的基因序列進行切割，從而進行基因編輯。不同的是NgAgo-gDNA系統中的內切酶是源自格氏嗜鹽堿桿菌的 Argonaute蛋白，引導工具是一段引導 DNA（guideDNA，gDNA）[5]。

SGN系統利用了一種能識別3′flap結構的內切酶FEN1（flapstructure-specific endonuclease1）。FEN1與Fn1（FokⅠ）的剪切結構域結合起來可以識別靶序列與gDNA形成的3′flap結構，通過Fn1二聚化對靶序列進行切割，實現基因組的編輯[6]。

新型基因組編輯技術的興起，已經開啟了基因組工程的一個新篇章。特別是CRISPR-Cas9系統已成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，為構建更高效的基因定點修飾技術提供了全新的平臺，是目前最高效的基因組編輯系統[7]。

2 國內外研究與應用現狀

基因組編輯技術已被廣泛應用于多種模式生物靶基因的定點斷裂、插入、缺失、替換等編輯，積極推動了生物體基因功能研究、作物遺傳改良和分子育種以及人類疾病的基因治療等領域的發展。2012年和2013年《Science》分別將TALEN和CRISRP/Ca9技術評為年度十大重要科學突破，2014年《Nature Methods》將基因組編輯技術評為過去十年中對生物學研究最有影響力的十項研究方法之一。ZFN、TALEN和CRISPR/CAS9技術已成功用于黑長尾猴、大鼠、線蟲、小鼠、中國倉鼠、非洲爪蟾卵細胞、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、煙草、玉米、大豆等模式生物的細胞或胚胎的內源基因的定點突變，特別是在果蠅、斑馬魚、大鼠等物種中獲得了可穩定遺傳的突變體[8-14]。部分已經報道的基因組編輯的物種和基因等信息見表1[15-30]。

在動物或人類的基因治療等應用中，由于現有的基因組編輯技術存在一定的脫靶效應，可能造成致命的后果，其安全性備受關注。在植物生產中，脫靶效應不是應用的主要制約因素。因此，在培育過程中可以通過全基因組測序、分子檢測等手段可評價是否存在脫靶，或通過與親本多次回交降低脫靶位點的頻率，從而可以有效避免因脫靶效應帶來的潛在風險[31]。因此，基因組編輯植物產品的開發和應用相對成熟。迄今為止，基因組編輯植物已經開始商業化生產和應用。2009年，SHUKLA等[32]利用ZFN將除草劑抗性基因導入玉米基因組的預設位點，破壞玉米中的ZmIPK1，抑制肌醇六磷酸的合成，獲得了抗除草劑和減少肌醇六磷酸水平的植株。CAI等[33]利用ZFN改變煙草植物細胞單個基因的序列，獲得了耐除草劑的煙草。2012年，愛荷華州立大學LI等[34]利用TALEN技術對水稻感病基因OsSWEET14進行編輯后，提高了水稻對白葉枯病的抗性；2012年，美國政府已經批準了首個基因組定向修飾的磷高效玉米，可以直接作為常規品種進行田間評價。2014年，美國Cellectis Plant Sciences公司利用基因組編輯敲除大豆脂肪脫氫酶2個基因家族，得到的大豆中油酸含量從20%提高到80%，并降低了儲存中易發生氧化的亞油酸含量，顯著改善了大豆油的品質[35]。2015年，美國Calyxt公司利用TALEN技術對一個馬鈴薯品系進行了基因編輯，降低了天門冬酰胺和單糖的含量，提高馬鈴薯的耐儲藏性，并減少高溫烹飪時產生的致癌物質丙烯酰胺[35]。Calyxt公司還利用TALEN技術研發了2種大豆改良品系，其單不飽和脂肪酸的含量與橄欖油和菜籽油相當。2016年，杜邦公司利用CRISPR技術將自然存在的糯玉米性狀直接引入優秀的高產雜交品種中，解決了糯玉米產量低的問題[36]。2016年，利用CRISPR技術對雙孢菇（Agaricusbisporus）中一類編碼導致褐變的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）基因家族進行了刪除，將PPO酶的活性降低了30%，讓雙孢菇抗褐變[37]。

中國基因組編輯技術進展迅速，特別是在轉基因動物領域。2016年，GAO等[5]和XU等[6]發明了新的基因組編輯技術NgAgo和SGN。高彩霞等通過基因組編輯水稻甜菜堿乙醛脫氫酶基因（OsBADH2），改善了稻米的香味品質[38]；在小麥中，同時敲除 A、B和 D基因組上 3個拷貝的白粉病基因（mildew resistance locus O，MLO），獲得了對白粉病具有廣譜和持久抗性的小麥材料[39-40]。2011年，YU等[41]通過ZFN技術成功地在牛上實現了基因定點突變，得到了β-乳球蛋白基因敲除牛。2012年，QIAN等[42]利用ZFN技術制備了肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）基因編輯梅山豬，該豬具有顯著的高瘦肉率表型，并進入轉基因生物安全評價的環境釋放階段；在2013年和2014年又利用TALEN技術制備了MSTN基因編輯梅山豬和大白豬（未發表），并進入轉基因生物安全評價的中間階段。2013年，LIU等[43]利用ZFN技術將溶葡萄球菌素（lysostaphin）基因插入到 β-酪蛋白（beta-casein）基因座，制備的基因編輯牛的乳腺能夠生成溶葡萄球菌素蛋白；2014年，LIU等[44]通過ZFN技術將人溶菌酶（human lysozyme，hlyz）基因插入到牛的β-酪蛋白基因座，獲得的轉基因牛的乳汁中可分泌人溶菌酶，具有殺死金黃色葡萄球菌的能力。2015年，WU等[45]利用TALENs技術將胞內病原體抗性基因1（intracellular pathogen resistance1，Ipr1）定點插入牛的基因組中，使轉基因牛獲得了抵抗結核病的能力，為中國抗結核病轉基因牛新品種培育奠定了良好的基礎。2016年，LUO等[46]利用TALEN技術將人血清白蛋白基因定點插入到牛β乳球蛋白座位上，并制備了轉基因牛。同時，中國學者利用基因組編輯技術，發掘了Rosa26[47]、H11[48]等“友好基因座”位點，制備了一批具有重要醫學價值的人類疾病模型[49-52]及生產人藥用蛋白的動物生物反應器[53-54]。

表1 使用ZFN、TALEN和CRISPR/Cas對生物體進行基因組修飾統計表Table1 List of the applications of genome editing using ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas systems

ZFN系統由于鋅指單元與靶序列結合的特異性有限，其脫靶效應較高，限制了ZFN技術的應用。TALEN和CRISPR/Cas9系統特異性高，脫靶效應較低，已經基本上代替了ZFN用于基因組編輯。特別是CRISPR/Cas9系統具有構建簡單、突變效率高、成本低、多靶點同時突變等優點，被廣泛地應用于動植物的精準遺傳改良[11-12]。2016年，NgAgo和SGN兩種新的基因組編輯技術被首次報道，引起了科學界的熱議，其有望成為繼CRISPR/Cas9技術之后的更具突破性和適用性的基因組編輯技術。但是，針對這兩種新編輯技術的未來還需要更多的試驗和實際應用來進行驗證。

3 基因組編輯技術主要優勢

3.1 較高的安全性

基因組編輯技術在進行基因敲除或替換時，序列和結構特異核酸酶的整合位點與靶基因位點通常不在同一染色體上，通過后代的自然分離即可獲得無轉基因痕跡的遺傳材料。如果采用序列特異核酸酶的瞬時表達等方法，可使人工核酸酶基因不整合到受體基因組的同時獲得基因定點敲除或替換突變體。基因組編輯獲得的突變體一般只有幾個堿基的刪除或者改變，與傳統的天然突變、人工誘變和種內雜交獲得的遺傳材料相類似，而且基因組編輯引發的突變是定向的，相比非定向的傳統誘變技術可以很大程度減少隨機突變所帶來的非預期效應。在定點插入方面，基因組編輯技術主要是利用同源重組的方式，可以做到外源DNA序列的定點插入整合，與傳統轉基因技術相比，極大地減少了由于隨機插入和整合所帶來的非預期效應產生的安全性風險。因此，從技術層面上基因組編輯技術比傳統的轉基因技術具有較高的安全性。

3.2 多位點突變

利用TALEN或CRISPR技術，可以將多個序列特異性核酸內切酶識別位點同時導入細胞，實現DNA片段刪除、倒位、易位等染色體重組及多基因敲除[11-12]。染色體重組和多基因敲除是反向遺傳學研究的重要技術手段。利用多基因敲除技術可提高復雜數量性狀基因功能研究的效率，構建多基因缺失突變體，實現多個關聯基因的功能網絡研究。同時，也可以通過構建成千上萬基因的大規模向導sgRNA文庫，從全基因組層面進行定點敲除、抑制、激活，再結合功能性篩選平臺和深度測序技術，實現高通量方式進行全基因組范圍的飽和篩選，全面認識基因的功能和相互作用網絡。

3.3 研發成本低

基因組編輯技術最顯著的特點是“精準靶定目標位點”，突破了傳統轉基因技術外源基因“隨機插入”受體基因組的瓶頸，直接將基因型和表現型聯系在一起，極大地減少了需要篩選的群體樣本數量，可準確判斷基因的功能和育種應用價值，提高了產品研發速度，降低了研發成本。另外，如CRISPR/Cas9系統通過不斷改進，其載體構建更加簡單易行，靶向效率更高，極大地降低了實驗室研發成本。

4 基因組編輯技術產品安全管理的探討

基因組編輯技術及其產品已經從實驗室研究階段逐步進入產業化應用階段，基因組編輯產品將對農牧漁業生產、糧食安全、醫療健康產業等國計民生產生重大而深遠的影響，其潛在經濟效益更是不可估量。在分子育種方面，基因組編輯技術已經展現了較傳統轉基因技術高效、精準、經濟等優勢，未來將會有大量的基因組編輯作物新品種出現。鑒于世界各國對于轉基因技術及轉基因產品的安全性的高度關注和爭議，通過基因組編輯技術獲得的產品的安全性將會同樣引起全社會的關注。中國在基因組編輯技術研究和應用方面已處于世界前列，理應盡早思考和規劃即將出現的基因組編輯技術產品和新品種的安全性及其安全性管理，促進其產業化應用，切實為國家的生物安全和糧食安全作出重要貢獻。

4.1 國外安全評價和管理現狀

自2014年開始，歐美等國多家公司相繼研發生產了源于基因組編輯技術的作物新品種，并向本國政府提交了這些新品種的商業化應用申請。由于基因組編輯技術作為一種新的技術，世界各國還沒有明確的、針對性的法律法規，目前，對于這類產品的安全性及其安全管理很大程度上還處于討論階段或者是發布初步的管理建議。

2015年7月，美國白宮表示，將對1992年頒發的《生物科技產品的審核框架》進行修訂，重新明確美國食品與藥物監督管理局（FDA）、美國農業部（USDA）和美國環境保護署（EPA）在判定轉基因動植物安全性中的地位和作用。此外，針對新型技術的審核過程也將進行更新修正。如對基因組編輯產品的監管遵循個案分析的原則，以科學為基礎開展。美國農業部認為某些基因組編輯作物與傳統育種得到的作物相似，基因組編輯作物不需要像轉基因產品那樣進行審批管理。2016年 5月，美國農業部宣布利用CRISPR-Cas9基因組編輯的蘑菇和玉米不屬于轉基因生物監管范疇[53]。2015年，阿根廷決定針對新的育種技術產品（包括基因組編輯技術產品），實施“個案分析”的管理審批政策，如果確認最終產品不含有外源基因，則不屬于轉基因生物監管范疇[56]。2013年，澳大利亞新西蘭食品標準局建議，簡單的堿基缺失的基因組編輯技術產品不屬于轉基因產品，但是有新的外源DNA插入的基因組編輯產品仍將被認為是轉基因產品進行管理。日本明確表示基因組編輯產品不屬于轉基因產品的范疇，和常規作物產品一樣。加拿大對于基因組編輯產品的管理基于產品管理的原則，關注其是否產生新的性狀，而不考慮利用什么樣的技術獲得新性狀[57]。歷來對轉基因產品持相對保守態度的歐盟也在審視其針對基因組編輯技術的政策。歐盟委員會已啟動了對“轉基因生物體”定義的法律審查程序，重新定義轉基因生物體。歐洲食品安全局轉基因生物小組則表示，如果新品種中無外源遺傳物質且基因組編輯產生改變與自然突變無法區分，不應作為轉基因產品對待。歐洲科學院科學咨詢委員會認為，需要對新產品進行評估，不對育種技術進行風險評估。

4.2 中國安全評價和管理探討

中國已利用基因組編輯技術研發了一系列的水稻、小麥和動物等新品系[38-54]，具有良好的商業化生產應用前景。為此，中國農業管理部門十分重視基因組編輯技術產品的安全性及其安全管理，努力為新產品的生產應用保駕護航。以李家洋院士牽頭的研究小組，提出了基因組編輯作物管理框架，包括5個關鍵點，即：（1）產品在實驗室和田間試驗階段，應該嚴格控制管理，避免向外界逃逸。（2）如果開發過程中基因編輯的元件以DNA載體的形式引入，必須確保基因組編輯作物中的外源DNA被完全去除。（3）準確報告記錄靶標位點處詳盡的DNA序列變化。如果通過同源重組引入了新的序列，需確定供體和受體的親緣關系，以此來表征引入的序列與遺傳背景是否有新的相互作用可能性。若通過同源重組引入的外源基因與受體親緣關系很遠，須具體情況具體分析。（4）確保產品中的主要靶點沒有發生非預期的二次編輯事件，并基于現有參考基因組信息和全基因組重測序技術，評價是否發生脫靶效應及其可能的安全性風險。（5）以上4點應在新品種登記資料中詳細說明備案。只有在滿足上述5個條件的基礎上，基因組編輯作物產品在進入市場之前才能和常規育種作物同等監管[55]。

在上述基因組編輯作物管理框架的基礎上，結合中國轉基因生物安全管理條例，從以下4個方面探討了中國今后對于基因組編輯作物的安全性評價和管理。

4.2.1 明確基因組編輯技術產品的安全管理范疇中國《農業轉基因生物安全管理條例》第三條明確定義，“本條例所稱的農業轉基因生物，是指利用基因工程技術改變基因組構成，用于農業生產或者農產品加工的動植物、微生物及其產品”。基因組編輯技術主要是對基因組DNA序列進行定向修飾的技術，其屬于基因工程技術范疇。根據上述定義，通過基因組編輯技術獲得的農作物其產品，應該屬于農業轉基因生物，應依法納入農業轉基因生物安全管理范疇。但由于《條例》主要是針對第一代轉基因技術而言，即通過基因工程技術，在受體基因組上插入整合了外源DNA序列，而獲得的具有新的性狀的產品。基因組編輯技術主要用來對靶標基因進行精準修飾或將目標基因定點整合到基因組中，對內源基因進行精準修飾時只在操作過程中涉及外源DNA的導入，篩選的后代中只有目標基因被修飾而不含有外源DNA，與傳統誘變育種獲得的最終產品相似，因此，建議將進行基因精準修飾獲得的少量堿基缺失、替換或者敲除的突變體類新產品視為特殊農業轉基因產品，可簡化這一類產品的安全評價和管理。通過基因組編輯技術進行定點整合有外源DNA插入的，則按傳統的轉基因生物進行安全評價和管理。

4.2.2 確定安全評價的內容 現階段，中國基于實質等同性和個案分析的原則，對轉基因產品進行安全性評價管理，主要包括3個方面的內容：分子特征評價、環境安全評價和食用安全評價。對于基因組編輯技術產品，仍然需要按照轉基因產品進行安全性評價管理。應重點關注是否存在非預期的基因編輯，是否產生新的環境安全和食用安全風險。其中，堿基缺失或敲除的突變體類基因組編輯技術產品可簡化安全性評價管理，重點開展分子特征評價和食用安全評價。安全性評價的具體內容可參考傳統的轉基因生物安全評價辦法和評價指南。但是，對分子特征的評價，可利用全基因組重測序等手段進行分析，以便清楚地解釋基因組編輯發生的位點，以及引起的缺失、插入、重組等。

4.2.3 建立分子檢測新方法 基因組編輯技術由于其定點編輯，且在改造的受體生物體內留下的痕跡較少，原有的分子生物學檢測技術方法，如蛋白質水平和核酸水平檢測方法，已經很難滿足基因組編輯產品的檢測，特別是單堿基或少量堿基缺失的基因組編輯產品。需要加強檢測新技術的研究，建立特異性的針對基因組編輯產品的檢測新方法，以保護研發人的知識產權，為國家安全監管監測提供有力的技術支撐。

4.2.4 完善配套的安全管理法律法規 2001年，中國頒布《農業轉基因生物安全管理條例》，2002年農業部發布了《農業轉基因生物安全評價管理辦法》、《農業轉基因生物進口安全管理辦法》和《農業轉基因生物標識管理辦法》等 3個配套管理辦法，對轉基因生物進行全程監控。近幾年，為規范管理轉基因生物，又制定了安全評價指南和一系列檢測標準，使轉基因生物研發人員、轉基因檢測機構和國家農業轉基因生物安全評價委員會工作有章可循、有據可依。隨著基因組編輯技術的研發應用，原有法規中規定的農業轉基因生物概念的范圍等已經不完全適合于基因組編輯技術產品。因此，中國亟需對已有的法律法規進行修改完善，參考國際上先進做法，相機而行。促進新技術的發展，推進第二代基因工程育種技術創新性革命，創制新農作物種質資源，培育突破性新品種。

[1] PAPAIOANNOU I, SIMONS J P, OWEN J S. Oligonucleotidedirected gene-editing technology: Mechanisms and future prospects. Expert Opinion on Biological Therapy, 2012, 12(3): 329-342.

[2] PABO C O, PEISACH E, GRANT R A. Design and selection of novel Cys2His2 Zinc finger proteins. Annual Review of Biochemistry, 2001, 70: 313-340.

[3] LI T, HUANG S, ZHAO X, WRIGHT D A, CARPENTER S, SPALDING M H, WEEKS D P, YANG B. Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic Acids Research, 2011, 39(14): 6315-6325.

[4] CONG L, RAN F A, COX D, LIN S, BARRETTO R, HABIB N, HSU P D, WU X, JIANG W, MARRAFFINI L A, ZHANG F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013, 339(6121): 819-823.

[5] GAO F, SHEN X Z, JIANG F, WU Y, HAN C. DNA-guided genome editing using the Natrono bacteriumgregoryi Argonaute. Nature Biotechnology, 2016, 34(7): 768-773.

[6] XU S, CAO S, ZOU B, YUE Y, GU C, CHEN X, WANG P, DONG X, XIANG Z, LI K, ZHU M, ZHAO Q, ZHOU G. An alternative novel tool for DNA editing without target sequence limitation: The structure-guided nuclease. Genome Biology, 2016, 17(1): 186.

[7] SINGH A, CHAKRABORTY D, MAITI S. CRISPR/Cas9: A historical and chemical biology perspective of targeted genome engineering. Chemical Society Reviews, 2016, 45(24): 6666-6684.

[8] JO Y I, KIM H, RAMAKRISHNA S. Recent developments and clinical studies utilizing engineered zinc finger nuclease technology. Cellular and Molecular Life Sciences, 2015, 72(20): 3819-3830.

[9] SPRINK T, METJE J, HARTUNG F. Plant genome editing by novel tools: TALEN and other sequence specific nucleases. Current Opinion in Biotechnology, 2015, 32: 47-53.

[10] CEASAR S A, RAJAN V, PRYKHOZHIJ S V, BERMAN J N, IGNACIMUTHU S. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9. Biochimica et Biophysica Acta, 2016, 1863(9): 2333-2344.

[11] 單奇偉, 高彩霞. 植物基因組編輯及衍生技術最新研究進展. 遺傳, 2015, 37(10): 953-973. SHAN Q W, GAO C X. Research progress of genome editing and derivative technologies in plants. Hereditas, 2015, 37(10): 953-973. (in Chinese)

[12] 周想春, 邢永忠. 基因組編輯技術在植物基因功能鑒定及作物育種中的應用. 遺傳, 2016, 38(3): 227-242. ZHOU X C, XING Y Z. The application of genome editing in identification of plant gene function and crop breeding. Hereditas, 2016, 38(3): 227-242. (in Chinese)

[13] 幸宇云, 楊強, 任軍. CRISPR/Cas9基因組編輯技術在農業動物中的應用. 遺傳, 2016, 38(3): 217-226. XING Y Y, YANG Q, REN J. Application of CRISPR/Cas9 mediated genome editing in farm animals. Hereditas, 2016, 38(3): 217-226. (in Chinese)

[14] 王干誠, 馬明, 葉延幀, 席建忠. 基于CRISPR/Cas9系統高通量篩選研究功能基因. 遺傳, 2016, 38(5): 391-401. WANG G C, MING M, YE Y Z, XI J Z. High-throughput functional screening using CRISPR/Cas9 system. Hereditas, 2016, 38(5): 391-401. (in Chinese)

[15] CHEN Y Y. Efficient gene editing in primary human T cells. Trends in Immunology, 2015, 36(11): 667-669.

[16] WHITELAW C B, SHEETS T P, LILLICO S G, TELUGU B P. Engineering large animal models of human disease. Journal of Pathology, 2016, 238(2): 247-256.

[17] WON M, RO H, DAWID I B. Lnx2 ubiquitin ligase is essential for exocrine cell differentiation in the early zebrafish pancreas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(40): 12426-12431.

[18] SOLIN S L, SHIVE H R, WOOLARD K D, ESSNER J J, MCGRAIL M. Rapid tumor induction in zebrafish by TALEN-mediated somaticinactivation of the retinoblastoma1 tumor suppressor rb1. Scientific Reports, 2015, 5: 13745.

[19] HENDRIKS W T, JIANG X, DAHERON L, COWAN C A. TALEN-and CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human pluripotent stem cells using lipid-based transfection. Current Protocols in Stem Cell Biology, 2015, 34: 5B.3.1-5B.3.25.

[20] LEE H B, SEBO Z L, PENG Y, GUO Y. An optimized TALEN application for mutagenesis and screening in Drosophila melanogaster. Cellular Logistics, 2015, 5(1): e1023423.

[21] DAIMON T, UCHIBORI M, NAKAO H, SEZUTSU H, SHINODA T. Knockout silkworms reveal a dispensable role for juvenile hormones in holometabolous life cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(31): 4226-4235.

[22] BUDHAGATAPALLI N, RUTTEN T, GURUSHIDZE M, KUMLEHN J, HENSEL G. Targeted modification of gene function exploiting homology-directed repair of TALEN-mediated double-strand breaks in barley. G3 (Bethesda), 2015, 5(9): 1857-1863.

[23] RANI R, YADAV P, BARBADIKAR K M, BALIYAN N, MALHOTRA E V, SINGH B K, KUMAR A, SINGH D. CRISPR/ Cas9: A promising way to exploit genetic variation in plants. Biotechnology Letters, 2016, 38(12): 1991-2006.

[24] XU R, WEI P, YANG J. Use of CRISPR/Cas genome editing technology for targeted mutagenesis in rice. Methods in Molecular Biology, 2017, 1498: 33-40.

[25] LI J, MENG X, ZONG Y, CHEN K, ZHANG H, LIU J, LI J, GAO C. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9. Nature Plants, 2016. 2: 16139.

[26] MA X, LIU Y G. CRISPR/CAS9-based multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Current Protocols in Molecular Biology, 2016, 115: 31.6.1-31.6.21.

[27] SCHIML S, FAUSER F, PUCHTA H. Repair of adjacent single-strand breaks is often accompanied by the formation of tandem sequence duplications in plant genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(26): 7266-7271.

[28] TANG X, ZHENG X, QI Y, ZHANG D, CHENG Y, TANG A, VOYTAS D F, ZHANG Y. A single transcript CRISPR-Cas9 system for efficient genome editing in plants. Molecular Plant, 2016, 9(7):1088-1091.

[29] PAN C, YE L, QIN L, LIU X, HE Y, WANG J, CHEN L, LU G. CRISPR/Cas9-mediated efficient and heritable targeted mutagenesis in tomato plants in the first and later generations. Scientific Reports, 2016, 6: 24765.

[30] LI M, LI X, ZHOU Z, WU P, FANG M, PAN X, LIN Q, LUO W, WU G, LI H. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 377.

[31] YEE J K. Off-target effects of engineered nucleases. Febs Journal, 2016, 283(17): 3239-3248.

[32] SHUKLA V K, DOYON Y, MILLER J C, DEKELVER R C, MOEHLE E A, WORDEN S E, MITCHELL J C, ARNOLD N L, GOPALAN S, MENG X, CHOI V M, ROCK J M, WU Y Y, KATIBAH G E, ZHIFANG G, MCCASKILL D, SIMPSON M A, BLAKESLEE B, GREENWALT S A, BUTLER H J, HINKLEY S J, ZHANG L, REBAR E J, GREGORY P D, URNOV F D. Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases. Nature, 2009, 459(7245): 437-441.

[33] CAI C Q, DOYON Y, AINLEY W M, MILLER J C, DEKELVER R C, MOEHLE E A, ROCK J M, LEE Y L, GARRISON R, SCHULENBERG L, BLUE R, WORDEN A, BAKER L, FARAJI F, ZHANG L, HOLMES M C, REBAR E J, COLLINGWOOD T N, RUBIN-WILSON B, GREGORY P D, URNOV F D, PETOLINO J F. Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases. Plant Molecular Biology, 2009, 69(6): 699-709.

[34] LI T, LIU B, SPALDING M H, WEEKS D P, YANG B. High efficiency TALEN-based gene editing produces disease resistant rice. Nature Biotechnology, 2012, 30(5): 390-392.

[35] JONES H D. Regulatory uncertainty over genome editing. Nature Plants, 2015, 1: 14011.

[36] LEDFORD H. US rethinks crop regulation. Nature, 2016, 532: 158-159.

[37] WALTZ E. Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation. Nature, 2016,532, 293.

[38] SHAN Q W, ZHANG Y, CHEN K L, ZHANG K, GAO C X. Creation of fragrant rice by targeted knockout of the OsBADH2 gene using TALEN technology. Plant Biotechnology Journal, 2015, 13(6): 791-800.

[39] SHAN Q W, WANG YP, LI J, ZHANG Y, CHEN K L, LIANG Z, ZHANG K, LIU J X, XI J J, QIU J L, GAO C X. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 2013, 31(8): 686-688.

[40] WANG Y P, CHENG X, SHAN Q W, ZHANG Y, LIU J X, GAO C X, QIU J L. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology, 2014, 32(9): 947-951.

[41] YU S, LUO J, SONG Z, DING F, DAI Y, LI N. Highly efficientmodification of beta-lactoglobulin (BLG) gene via zinc-finger nucleases in cattle. Cell Research, 2011, 21(21): 1638-1640.

[42] QIAN L, TANG M, YANG J, WANG Q, CAI C, JIANG S, LI H, JIANG K, GAO P, MA D, CHEN Y, AN X, LI K, CUI W. Targeted mutations in myostatin by zinc-finger nucleases result in doublemuscled phenotype in Meishan pigs. Scientific Reports, 2015, 5: 14435.

[43] LIU X, WANG Y, GUO W, CHANG B, LIU J, GUO Z, QUAN F, ZHANG Y. Zinc-finger nickase-mediated insertion of the lysostaphin gene into the beta-casein locus in cloned cows. Nature Communication, 2013, 4: 2565.

[44] LIU X, WANG Y, TIAN Y, YU Y, GAO M, HU G, SU F, PAN S, LUO Y, GUO Z, QUAN F, ZHANG Y. Generation of mastitis resistance in cows by targeting human lysozyme gene to β-casein locus using zinc-finger nucleases. Proceedings of the Royal Society, 2014, 281: 20133368.

[45] WU H, WANG Y, ZHANG Y, YANG M, LV J, LIU J, ZHANG Y. TALE nickase-mediated SP110 knockin endows cattle with increased resistance to tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(13): 1530-1539.

[46] LUO Y, WANG Y, LIU J, CUI C, WU Y, LAN H CHEN Q, LIU X, QUAN F, GUO Z, ZHANG Y. Generation of TALE nickase-mediated gene-targeted cows expressing human serum albumin in mammary glands. Scientific Reports, 2016, 6: 20657.

[47] LI X, YANG Y, BU L, GUO X, TANG C, SONG J, FAN N, ZHAO B, OUYANG Z, LIU Z, ZHAO Y, YI X, QUAN L, LIU S, YANG Z, OUYANG H, CHEN Y E, WANG Z, LAI L. Rosa26-targeted swine models for stable gene over-expression and Cre-mediated lineage tracing. Cell Research, 2014, 24(4): 501-504.

[48] RUAN J, LI H, XU K, WU T, WEI J, ZHOU R, LIU Z, MU Y, YANG S, OUYANG H, CHEN-TSAI R Y, LI K. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports, 2015, 5: 14253.

[49] HAI T, TENG F, GUO R, LI W, ZHOU Q. One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell Research, 2014, 24(3): 372-375.

[50] ZHOU X, XIN J, FAN N, ZOU Q, HUANG J, OUYANG Z, ZHAO Y, ZHAO B, LIU Z, LAI S, YI X, GUO L, ESTEBAN MA, ZENG Y, YANG H, LAI L. Generation of CRISPR/Cas9-mediated gene-targeted pigs via somatic cell nuclear transfer. Cellular and Molecular Life Sciences, 2015, 72(6): 1175-1184.

[51] YAO J, HUANG J, HAI T, WANG X, QIN G, ZHANG H, WU R, CAO C, XI J J, YUAN Z, ZHAO J. Efficient bi-allelic gene knockout and site-specific knock-in mediated by TALENs in pigs. Scientific Reports, 2014, 4: 6926.

[52] WANG X, CAO C, HUANG J, YAO J, HAI T, ZHENG Q, WANG X, ZHANG H, QIN G, CHENG J, WANG Y, YUAN Z, ZHOU Q, WANG H, ZHAO J. One-step generation of triple gene-targeted pigs using CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports, 2016, 6: 20620.

[53] PENG J, WANG Y, JIANG J, ZHOU X, SONG L, WANG L, DING C, QIN J, LIU L, WANG W, LIU J, HUANG X, WEI H, ZHANG P. Production of human albumin in pigs through CRISPR/Cas9-mediated knockin of human cDNA into swine albumin locus in the zygotes. Scientific Reports, 2015, 5: 16705.

[54] YANG Y, WANG K, WU H, JIN Q, RUAN D, OUYANG Z, ZHAO B, LIU Z, ZHAO Y, ZHANG Q, FAN N, LIU Q, GUO S, BU L, FAN Y, SUN X, LI X, LAI L. Genetically humanized pigs exclusively expressing human insulin are generated through custom endonucleasemediated seamless engineering. Journal of Molecular Cell Biology, 2016, 8(2): 174-177.

[55] WHELAN A I, LEMA M A. Regulatory framework for gene editing and other new breeding techniques (NBTs) in Argentina. GM Crops Food, 2015, 6(4): 253-265.

[56] HUANG S, WEIGEL D, BEACHY RN, LI J. A proposed regulatory framework for genome-edited crops. Nature Genetics, 2016, 48(2): 109-111.

[57] JONES H D. Future of breeding by genome editing is in the hands of regulators. GM Crops Food, 2015, 6(4): 223-232.

（責任編輯 李莉）

The Safety Management of Genome Editing Technology

SHEN Ping1, ZHANG QiuYan2, YANG LiTao3, ZHANG Li4, LI WenLong1, LIANG JinGang1, LI XiaYing1, WANG HaoQian1, SHEN XiaoLing5, SONG GuiWen1
(1Science and Technology Development Center, Ministry of Agriculture, Beijing 100122;2Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191;3Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240;4School of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074;5Tianjin Academy of Agriculture Science, Tianjin 300381)

Genome editing technologies using sequence-specific nuclease (SSN) creates DNA double-strand breaks (DSBs) in the genomic target sites, and the DSBs can be repaired by the non-homologous end joining (NHEJ) or homologous recombination (HR) pathways with the help of artificially engineered nucleases, which can be employed to achieve targeted genome modifications such as gene mutation, gene insertion, gene replacement or chromosome rearrangement. There are three major artificially engineered nucleases including zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) systems. The genome editing techniques have been widely used in the fields of plant gene function research, molecular breeding, and etc. The genome editing crops (GEC) showpromising application prospects compared with traditional genetically modified organism (GMO). The GECs with good traits have been gradually transferred from labs to fields. Herein, the principles, characters, and applications of these three mainly used techniques in animal and plants genome editing have been described. The advantages and disadvantages compared with conventional transgenic technique were also discussed, including the safety came from the off-target effects. The management regulations of GECs of different countries in global area were elaborated. Finally, the safety management of GECs and their products in China were discussed combined with Chinese current regulations on the safety management of GMOs, so as to facilitate the development and commercialization of GECs and their products.

genome editing; genetically modified organisms; safety management

2016-10-19；接受日期：2016-11-17

國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2016ZX08012-003）

聯系方式：沈平，Tel：010-59198111；E-mail：shenping84@Hotmail.com。通信作者宋貴文，Tel：010-59198150；E-mail：songguiwen@agri.gov.cn