白芍總苷對肝癌耐藥細胞BEL-7402/ADM耐藥性的逆轉作用及機制探討

胡禮儀，侯永彬，余莉華，米永華，王科，劉北忠

(重慶醫科大學附屬永川醫院，重慶402160)

·論著·

白芍總苷對肝癌耐藥細胞BEL-7402/ADM耐藥性的逆轉作用及機制探討

胡禮儀，侯永彬，余莉華，米永華，王科，劉北忠

(重慶醫科大學附屬永川醫院，重慶402160)

目的 觀察白芍總苷(TPG)對肝癌耐藥細胞BEL-7402/ADM耐藥性的逆轉作用，并探討其作用機制。方法 體外培養人肝癌ADM敏感細胞BEL-7402(親本組)和ADM耐藥細胞BEL-7402/ADM(耐藥組)，將BEL-7402/ADM細胞轉染HDAC3基因siRNA干擾質粒(干擾組)及空載質粒(空載組)24 h，用白芍總苷孵育BEL-7402/ADM細胞48 h(用藥組)。取親本組、耐藥組、用藥組細胞，分別以不同濃度ADM作用48 h；MTT法測算增殖抑制率，計算各組ADM的半數抑制濃度(IC50)。取親本組、耐藥組、空載組、干擾組及用藥組細胞，分別采用RT-qPCR法和Western blot法檢測細胞多藥耐藥基因MDR1和去乙酰化酶(HDAC3)mRNA和蛋白。結果 親本組、耐藥組和用藥組細胞ADM的IC50分別為0.139、8.807、4.890 nmoL/L；用藥組細胞對ADM耐藥的逆轉倍數為1.80倍,逆轉率為45.23%。MDR1 mRNA及蛋白相對表達量耐藥組、空載組>用藥組>干擾組>親本組(P均<0.05或0.01)，HDAC3 mRNA及蛋白相對表達量耐藥組、空載組>干擾組>親本組、用藥組(P均<0.05或0.01)。結論 白芍總苷通過抑制HDAC3的表達，引起MDR1表達下調，從而逆轉BEL-7402/ADM細胞的耐藥性。

肝癌；白芍總苷；耐藥；siRNA干擾；半數抑制濃度；多藥耐藥基因；去乙酰化酶

肝癌的主要病因為肝炎和肝硬化[1],較其他癌癥病死率高。目前，藥物化療如阿霉素(ADM)是其常規治療方法，但腫瘤細胞的多藥耐藥(MDR)嚴重影響化療效果。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)通過表觀遺傳調控基因的轉錄和表達，增強癌細胞耐藥性，影響癌細胞的增殖和分化，是一類新型癌癥藥物靶點；肝癌組織中HDAC3表達顯著增高，且與肝癌預后呈負相關[2]。目前，臨床上主要應用環孢素A和異博定等來逆轉腫瘤細胞的耐藥作用，但不良反應較大，患者耐受程度較低。中藥在抗癌方面具有有效性高和不良反應低的特點，尋找能逆轉腫瘤細胞耐藥性且患者耐受程度高的中藥在臨床應用中具有重要價值[3，4]。有文獻[5]報道，白芍對肝炎和其他慢性肝病有治療作用，白芍總苷是其主要有效成分。2014年4月～2016年3月，我們探討白芍總苷對人肝癌耐藥細胞BEL-7402/ADM的逆轉作用，并以siRNA干擾HDAC3表達分析其作用機制，以期為臨床上逆轉耐藥提供更多的藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人肝癌ADM敏感細胞BEL-7402(親本組)和ADM耐藥細胞BEL-7402/ADM(耐藥組)均購買于中國科學院上海生命科學院生化細胞所，將細胞置于含10% FBS、1%青鏈霉素和1%谷氨酰胺的RPMI 1640培養液中，BEL-7402/ADM細胞培養液中含5 mg/L ADM(海正制藥)維持其耐藥性[6]，于5% CO2、37 ℃培養箱中培養。每2天換液1次，當細胞融合度達到90%時用0.25%胰酶消化進行細胞傳代；實驗前2周BEL-7402/ADM細胞換用無ADM的完全培養液培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。HDAC3基因siRNA干擾質粒及空載質粒由上海吉凱公司構建，參考質粒轉染手冊分別轉染BEL-7402/ADM細胞，培養24 h后獲得干擾組和空載組細胞用于后續實驗。

1.2 白芍總苷用藥前后BEL-7402/ADM細胞對ADM耐藥逆轉情況觀察

1.2.1 白芍總苷用藥濃度篩選 白芍總苷片購自三九集團(批號20011201，每片0.3 g，含芍藥苷104 mg)，用PBS稀釋為40 mg/mL溶液分裝凍存備用。采用MTT法觀察白芍總苷對BEL-7402/ADM細胞增殖的影響：用完全培養液稀釋BEL-7402/ADM細胞至2×104/mL，吹打混勻后，接種200 μL于96孔培養板；將細胞分為觀察組和對照組，每組6個復孔；在5% CO2、37 ℃條件下培養24 h，吸去上清液。觀察組依次加入含不同濃度(10、20、40、80、160 μg/mL)白芍總苷的培養液，對照組培養液不含白芍總苷，繼續孵育48 h后棄培養液；每孔加入無血清培養液及5 mg/mL的MTT各20 μL，繼續培養4 h后棄培養液；每孔加入二甲亞颯(DMSO)200 μL，震蕩10 min，在全自動酶標儀(Bio-Rad公司，美國)測定490 nm波長時各孔吸光度值(A值)。重復實驗3次，取3次平均值。增殖抑制率=(觀察組A值-對照組A值)/對照組A值×100%。以增殖抑制率為y坐標，白芍藥苷濃度為x坐標,進行回歸分析，求得白芍藥苷對BEL-7402/ADM細胞的半數抑制濃度(IC50)為71.58 μg/mL。

1.2.2 BEL-7402/ADM細胞對ADM敏感性檢測 取親本組、耐藥組細胞，用藥組將BEL-7402/ADM細胞用71.58 μg/mL白芍總苷孵育48 h；三組均加入0.90、1.80、3.60、7.20、14.4、28.8、57.6 μmol/L的ADM作用48 h。采用MTT法測算增殖抑制率，方法同1.2.1。使用改良寇氏法計算各組細胞ADM的IC50，并計算逆轉倍數及逆轉率。

1.3 白芍總苷用藥前后BEL-7402/ADM細胞MDR1和HDAC3檢測

1.3.1 MDR1和HDAC3 mRNA檢測 采用RT-qPCR法。取親本組、耐藥組、空載組、干擾組及用藥組細胞，按照TRIzol試劑盒(Life Technologies,美國)說明書提取細胞總RNA，使用NanoDrop?ND-1000紫外吸收法測定RNA濃度與純度，A260/A280值1.8～2.1。按照Prime ScriptTMRT試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)說明合成cDNA。逆轉錄反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。MDR1上游引物5′-AAGCTTAGTACCAAAGAGGCTCTG-3′，下游引物5′-GGCTAGAAACAATAGYGAAAACAA-3′；HDAC3上游引物5′-TCTGGGCTGTGATCGATTG-3′，下游引物5′-CTTGACATATTCAACGCATTCC-3′；β-actin上游引物5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游引物5′-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′；均由大連寶生生物工程有限公司合成。PCR反應體系：10 μL SYBR?Primer Ex TaqⅡ qPCR，0.4 μL 10 μmol/L PCR上下游引物，2 μL cDNA模板和7.2 μL高壓水。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；溶解曲線溫度55～99 ℃，每2秒下降5 ℃。逆轉錄和實時定量PCR均在ABI Prism7900 System(Applied Biosystems,美國)儀器中進行。采用2-ΔΔCt法[7]計算基因表達量，以β-actin為內參基因校正得出相對表達量。

1.3.2 MDR1和HDAC3蛋白檢測 采用Western blot法。取親本組、耐藥組、空載組、干擾組及用藥組細胞，用凱基全蛋白提取試劑盒(江蘇生物技術股份有限公司)提取細胞總蛋白；經Bradford法定量后制樣，濃度為1 μg/μL。每孔加20 μL蛋白于8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中90 V電泳2 h；采用半干轉，0.3 mA轉膜(PVDF膜)50 min；在室溫下用5%(W/V)的脫脂牛奶封閉膜2 h；切膜后孵育一抗：MDR1(CST公司；180 kD,1∶1 000)、HDAC3(CST公司，49 kD,1∶1 000)和β-actin(CST公司，42 kD,1∶3 000)，4 ℃冰箱孵育過夜；TBST漂洗3次，10 min/次。用山羊抗兔二體(CST公司，1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，10 min/次；膜與Beyo ECL Plus(碧云天生物技術研究所)反應1 min后，經Chemidoc XRS(Bio-Rad公司，美國)顯影，用Quantity One軟件分析處理。以β-actin蛋白的信號條帶為內參，對目的條帶(MDR1、HDAC3)光密度值進行半定量，得到目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 白芍總苷對BEL-7402/ADM細胞ADM耐藥性逆轉情況 親本組、耐藥組和用藥組細胞ADM的IC50分別為0.139、8.807、4.890 nmoL/L；用藥組細胞對ADM耐藥的逆轉倍數為1.80倍，逆轉率為45.23%。

2.2 白芍總苷對MDR1和HDAC3 mRNA及蛋白表達的影響 MDR1 mRNA及蛋白相對表達量耐藥組、空載組>用藥組>干擾組>親本組(P均<0.05或0.01)，HDAC3 mRNA及蛋白相對表達量耐藥組、空載組>干擾組>親本組、用藥組(P均<0.05或0.01)。見表1。

表1 各組細胞MDR1、HDAC3 mRNA及蛋白表達比較±s)

注：與親本組比較，aP<0.05,bP<0.01；與耐藥組、空載組比較,cP<0.05，dP<0.01；與干擾組比較，eP<0.05。

3 討論

白芍為毛莨科植物芍藥的干燥根，中醫學認為其有補血、補氣、止痹、疏通經絡的作用，可以治療自身免疫類疾病、風濕性疾病、肝炎及肝硬化等。白芍的主要藥效成分是一組糖苷類物質，其中芍藥苷占總苷量的90%以上[5]。通過對白芍總苷的藥理及臨床研究發現，白芍總苷可以通過多種途徑抑制機體免疫反應，從而發揮抗炎、止痛、保肝作用。晏雪生等[8]報道，芍藥苷可抑制BEL-7402細胞增殖。本研究發現，用藥組細胞對ADM耐藥的逆轉倍數為1.80倍,逆轉率為45.23%。說明白芍總苷對BEL-7402/ADM細胞的耐藥性有逆轉作用。

MDR1基因可編碼P-糖蛋白(P-gp)[9]，P-gp是一種位于細胞膜上的轉運蛋白，可通過水解ATP供能，逆濃度梯度將抗腫瘤藥物泵出細胞外來實現耐藥[10,11]。本研究結果顯示，白芍總苷可使耐藥細胞MDR1 mRNA和蛋白表達降低，可能導致P-gp在細胞膜上分布減少，使細胞泵出ADM的作用明顯減弱，細胞內ADM濃度升高，增強ADM對腫瘤細胞的作用，從而實現其逆轉耐藥作用。但是，白芍總苷是經過何種途徑降低MDR1 mRNA和蛋白表達尚不明確。

HDAC是一類基因表達調控重要的蛋白酶家族，在全身多處組織表達[12]。其中，HDAC3與多種腫瘤的發生、轉移和侵襲有關，是明確的致癌基因[2]。Liby等[13]研究發現，HDAC3在高級別膠質瘤細胞內呈強染色。有研究發現，肺腺癌組織中HDAC3高表達，且是患者預后的獨立預測因素。HDAC3也在結腸癌組織中高表達，在結腸癌的侵襲以及淋巴結轉移中起重要作用[14]。研究[2]發現，腫瘤抗原MageA2通過招募HDAC3到p53的轉錄位置形成復合物，能同時損害p53的乙酰化和p53結合位點周圍的組蛋白乙酰化，并顯著下調p53的轉錄水平，隨后使得黑色素瘤細胞對依托泊甙產生抗藥性。通常情況下，胞質內HDAC3與IκBα/NF-κB構成靜默復合體，HDAC3抑制NF-κB的功能作用，當靜默復合體解離時， HDAC3和NF-κB進入細胞核發揮調控作用。有研究發現，NF-κB在很多腫瘤中過度激活，對細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的調節失控[12]。有研究[15]報道，木蝴蝶素通過p53/NF-κB 通路抑制乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADM的增殖，從而減少MDR1基因編碼P-gp的表達，逆轉細胞對阿霉素的抵抗作用。本研究干擾組通過干擾BEL-7402/ADM細胞HDAC3的表達，發現MDR1基因表達顯著下調，這與用藥組結果趨勢一致。從而證明，白芍總苷通過下調BEL-7402/ADM細胞中HDAC3基因表達，降低其耐藥性。因此推測，白芍總苷具有HDAC3抑制劑活性，通過抑制HDAC3的表達，改變細胞內染色質中核小體組蛋白的乙酰化水平，進而下調MDR1基因的表達，從而逆轉肝癌耐藥細胞的耐藥性。本實驗的不足之處在于沒有進行體內實驗，同時沒有進一步探索HDAC3逆轉MDR1的分子機制，有待今后完善。

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Reversing effects of total glucosides of paeony on drug resistance of BEL-7402/ADM cells

HULiyi,HOUYongbin,YULihua,MIYonghua,WANGKe,LIUBeizhong

(YongchuanHospitalAffiliatedtoChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China)

Objective To observe the reversing effects of total glucosides of paeonia (TPG) on drug resistance of BEL-7402/ADM cells in hepatocellular carcinoma.Methods Human hepatocellular carcinoma ADM sensitive BEL-7402 cells (parent group) and ADM drug-resistant BEL-7402/ADM cells (drug resistance group) were cultured in vitro. BEL-7402/ADM cells were transfected with HDAC3 siRNA interference plasmid (interference group) and empty plasmid (empty plasmid group) for 24 h, respectively, and BEL-7402/ADM cells were incubated with TPG for 48 h (drug group). Different concentrations of ADM were administered to cells in the parent group, drug resistance group and drug group for 48 h respectively. Then MTT assay was used to detect the growth inhibition rates and IC50of ADM in each group. The mRNA and protein expression of MDR1 and histone deacetylase 3 (HDAC3) was detected by RT-qPCR and Western blotting in the above grovps. Results IC50of ADM was 0.139 nmoL/L in the parent group, 8.807 nmoL/L in the drug resistance group and 4.890 nmoL/L in the drug group. Drug reverse ratio was about 1.80 times higher and the reverse transcription ratio was 45.23% in the drug group. The relative expression of MDR1 mRNA and protein was: drug resistance group, empty plasmid group>drug group>interference group>parent group (allP<0.05, 0.01), the relative expression of HDAC3 and protein was: drug resistance group, empty plasmid group>interference group>parent group, drug group (allP<0.05, 0.01).Conclusion TPG induces the down-regulated expression of MDR1 by inhibiting the HDAC3 expression, thus reversing the drug resistance of BEL-7402/ADM cells.

hepatoma carcinoma; total glucosides of paeony; drug resistance; siRNA interference; 50% inhibition concentration; multidrug resistance gene; histone deacetylase

重慶醫科大學附屬永川醫院引進人才資助項目(YJYJ201306)。

胡禮儀(1972-)，男，碩士研究生，副主任技師，主要研究方向為腫瘤早期診斷的生物標志物。E-mail： hlyhhy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.001

R735.7

A

1002-266X(2017)10-0001-04

2016-09-24)