大腸癌石蠟包埋組織中MiR-21表達變化及意義

嚴曉麗，杜夢楠，鄭紀寧

(承德醫學院，河北承德067000)

大腸癌石蠟包埋組織中MiR-21表達變化及意義

嚴曉麗，杜夢楠，鄭紀寧

(承德醫學院，河北承德067000)

目的 觀察大腸癌石蠟包埋組織中微小RNA-21(miR-21)的表達變化，并探討其臨床意義。方法 從40例大腸癌患者石蠟包埋的癌組織和癌旁5 cm范圍外的正常黏膜組織中抽提RNA，采用反轉錄實時熒光定量PCR法檢測miR-21，并分析癌組織中miR-21表達與大腸癌患者臨床病理特征的關系。結果 miR-21在癌組織中相對表達量為-4.28±1.67，在癌旁正常組織為-2.05±1.85，miR-21在癌組織中的相對表達量較癌旁正常黏膜組織升高(P<0.05)。在不同性別、腫瘤形態及發病部位患者的癌組織中miR-21相對表達量比較差異無統計學意義(P均>0.05)，在年齡大于中位年齡、存在淋巴結轉移、分化程度低及已浸透漿膜層患者的癌組織組中miR-21相對表達量高于年齡小于中位年齡、無淋巴結轉移、分化程度高及未浸透漿膜層患者的癌組織(P均<0.05)。結論 miR-21在大腸癌石蠟包埋組織中表達升高，其可能參與腫瘤的發生發展、分化及轉移等生物學行為的調節；石蠟包埋組織可能成為研究腫瘤微小RNA的一種重要資源。

大腸癌；微小核糖核酸21；石蠟包埋組織；聚合酶鏈反應

大腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，2015年美國癌癥協會進行的全球癌癥數據評估[1]結果顯示,大腸癌發病率在男性和女性中分別位列第3位和第2位。癌癥在我國的發病也呈逐年增長趨勢,在城市人口中大腸癌發病率已排在第2位[2]。早期大腸癌預后相對較好，但多數患者就診時已屬晚期。因此，早期診斷對于改善大腸癌患者的預后有非常重要的意義。近年來，有關大腸癌發病的分子機制及早期診斷的分子標志物研究受到了廣泛關注，且焦點集中在微小RNA(miRNA)的研究上。諸多實驗研究表明，miRNA在相同器官的正常組織和癌組織之間表達存在差異，且miRNA可作為癌基因或抑癌基因通過不同途徑導致腫瘤的形成。因此，miRNA與腫瘤的發生發展密切相關，miRNA很可能成為大腸癌早期診斷和預后判斷的新型分子標志物。諸多細胞水平的研究表明，miRNA-21(miR-21)可能與大腸癌的發生、發展、治療、預后及多藥耐藥等方面都有密切關系，但因細胞水平的實驗在臨床上缺乏驗證,不能為臨床提供可靠的指導，而目前以甲醛固定石蠟包埋組織為材料進行miR-21表達研究的實驗尚不多見。本實驗以石蠟組織為材料，采用逆轉錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測miR-21在大腸癌組織與相應5 cm范圍外正常黏膜組織中的表達，探討miR-21與大腸癌發生、發展及患者臨床病理學特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 標本來自2013年1月～2015年1月承德醫學院附屬醫院和承德市中心醫院40例大腸石蠟包埋組織，每例標本均包括大腸癌組織和相對應的5 cm范圍外正常大腸黏膜組織。患者中男22例，女18例；年齡35～86歲，中位年齡58.5歲；結腸癌20例，直腸癌20例；潰瘍型17例，隆起型23例；高分化25例，中低分化15例；浸潤深度未浸透漿膜層16例，浸透漿膜層24例；無淋巴結轉移25例，有淋巴結轉移15例。

1.2 石蠟包埋組織中miR-21檢測方法 采用RT-qPCR法，石蠟包埋組織總RNA純化試劑盒、Hairpin-itTMmicroRNA和U6 snRNA標準化RT-PCR定量試劑盒均購于蘇州吉瑪基因股份有限公司。操作方法：①RNA提取：所有石蠟組織先經過HE染色，顯微鏡下觀察。癌組織玻片劃出邊緣非癌組織范圍，正常組織劃出邊緣非黏膜層。根據圈出的組織范圍大小切片10～15張，每張切片厚度5 μm。癌組織玻片剔除邊緣非癌組織，正常組織玻片剔除邊緣非黏膜層。經過烤片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，乙醇Ⅰ、Ⅱ洗脫二甲苯，然后將組織收集到干凈的EP管中。接著按照試劑盒操作說明逐步提取RNA，提取出的RNA濃度采用紫外分光光度計進行測定。RNA樣品純度A260/A280值在1.9～2.1為純度符合標準的RNA，否則重新提取。②RT-qPCR：提取的總RNA采用20 μL逆轉錄反應加樣量體系進行逆轉錄獲取cDNA，加樣包括5×MMLV RT Buffer 4 μL、dNTP 0.75 μL、miR-21和U6 snRNA RT引物混合物各1.20 μL、MMLV逆轉錄酶0.2 μL、RNA樣品質量取0.2 μg，以無酶水加至20 μL。逆轉錄程序：25 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保存。miRNA 逆轉錄產物擴增采用20 μL逆轉錄反應加樣量體系進行PCR，加樣包括SYBR 10 μL、miR-21/U6 snRNA特異性引物各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶0.2 μL、miRNA 逆轉錄產物2 μL，以無菌水加至20 μL。每個樣品miR-21和U6均設3個復孔。實時熒光定量PCR反應程序：95 ℃ 3 min預變性；95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，40個循環，采集熒光信號。③結果判定：獨立3次重復試驗，每次作3個復孔，任何1個樣品的標準化基因的Ct值不能≥30，且每個樣品復孔間的差異不>1，否則重復試驗。為了使差異均一化，以ΔCt表示miR-21的相對表達量，ΔCt為miR-21 Ct平均值與內參U6 Ct 平均值的差值。

2 結果

2.1 miR-21在大腸癌組織和癌旁正常組織中的表達比較 miR-21在癌組織中相對表達量為-4.28±1.67，在癌旁正常組織為-2.05±1.85，miR-21在癌組織中相對表達量較癌旁正常黏膜組織升高(P<0.05)。

2.2 miR-21表達與大腸癌臨床病理特征的關系 miR-21在不同性別、腫瘤形態、部位及浸潤深度患者的大腸癌組織間比較差異無統計學意義(P均>0.05)，在不同年齡、腫瘤分化程度及淋巴結是否轉移患者的大腸癌組織間比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

3 討論

以美國癌癥協會第6版定義的大腸癌分期為標準評估大腸癌5年生存率，結果顯示Ⅰ期結腸癌患者5年生存率為93.2%、Ⅱ期為82.5%、Ⅲ期為59.5%、Ⅳ期為8.1%[3]。可見早期大腸癌預后良好，但臨床上以中晚期病例為多，很多病例失去了手術機會，而化療又因多藥耐藥影響效果。因此，尋找出敏感和特異的分子標志物，建立相對完善的早期診斷、預后評估方案對于提高大腸癌患者5年生存率有非常重要的意義。近年來，與大腸癌關系密切的miRNA的研究已受到廣泛關注。

表1 miR-21表達與大腸癌患者臨床病理特征的關系

成熟的miRNA通過與mRNA誘導沉默復合物(RISC)結合形成RISC復合體，后者可特異性識別靶mRNA的3′-非編碼區，從而引起靶mRNA的降解、翻譯抑制，在轉錄后水平調控一個或多個基因的表達[4]。研究[5]顯示，有高達上千個人類miRNA已經證實，且多達92%的人類基因可能受miRNA調控[6]。有研究[7]顯示，miRNA能影響細胞的整個發育過程。Calin等[8]發現，超過50%的miRNA基因位于腫瘤基因相關區域或脆性位點。大量研究表明，miRNA通過調控多個mRNA的表達，在細胞的增生、分化、凋亡和發展過程中都有非常重要的作用。多項研究報道，與腫瘤相關的miRNA在相同器官的癌組織和正常組織之間表達存在差異。已經證實，miRNA可通過調控癌基因或抑癌基因表達發揮致癌作用，也可自身作為癌基因或抑癌基因通過不同途徑導致腫瘤的形成。其中，miR-21在結腸癌的發生過程中發揮著類似于癌基因的作用[9]，其在多種類型的癌癥包括大腸癌中表達上調[10,11]。多個實驗室采用分子生物技術和細胞技術，在體外實驗中對不同細胞系miR-21的致癌特性進行了廣泛研究[12～14]。并且多項研究報道，miR-21的表達水平與細胞凋亡、增殖和遷移、不良預后以及化療耐藥都密切相關[15～17]。Kang等[18]研究結果顯示，miR-21高表達的T3～T4a大腸癌患者的無瘤生存期較miR-21低表達的患者明顯縮短，且腫瘤復發的風險更高，miR-21在大腸癌中高表達與E-鈣黏素低表達和轉移相關蛋白1(MAP1)高表達相關。總之，miR-21通過負向調控Spry2、張力蛋白同源性磷酸酶(PTEN)、程序性細胞死亡因子4(PDCD4)，抑制細胞外信號調節蛋白磷酸化激酶(ERK)、蛋白激酶 (AKT)、c-Jun N端激酶(JNK) 等多個下游靶基因，進而發揮致癌作用[19]。通過檢索KEGG Pathway數據庫中MicroRNAs In Cancer(map05206)也可得知，miR-21參與大腸癌發生發展過程的多個環節。這些研究表明，miR-21可能作為一個具有高敏感性的分子標志物用于大腸癌多個方面的研究。

一個新的腫瘤標記物的發現和研究通常需要新鮮冰凍組織，但由于倫理道德、保存問題、醫療環境等多種因素的影響，以新鮮組織為實驗材料用于研究不是非常方便，因此多數研究目前尚處于細胞和動物水平，這些實驗結果常常因在臨床上缺乏驗證而不能為臨床提供可靠的指導。石蠟包埋組織可克服研究中的這些缺點，它是臨床手術標本收集和存儲最常采用的方法，且常有比較詳細和完善的臨床隨訪信息，因此這對于人類疾病基因表達的研究是非常寶貴的資源。過去的實驗研究發現，從石蠟組織中分離的核酸通常在一定程度上發生化學結構斷裂或化學性質改變，因而經常不能用于分子水平研究。近年來發現，從石蠟組織中提取的RAN長度大約可達80個核苷酸，且僅有約1%的核苷酸發生化學結構和性質的改變。而內源性的具有基因調控功能的miRNA長度為18～25個核苷酸，其化學結構和性質很少受甲醛固定、石蠟包埋等操作過程的影響[20,21]。最近研究[22]發現，乳腺癌石蠟包埋組織和相應新鮮冰凍組織中基因表達譜很大程度上相類似。石蠟組織對于分子標志物的發現和驗證是非常重要的資源，而且以臨床歸檔的石蠟組織標本為材料對miRNA表達譜和腫瘤多方面機制進行研究分析，還可能擴大miRNA在腫瘤的臨床診斷、預后判斷及靶向治療等方面的應用范圍。相信在不久的將來，從石蠟組織中抽提純化RNA的技術會廣泛應用于大規模的臨床驗證研究中。

本研究從石蠟包埋的大腸癌組織和相應的癌旁正常黏膜組織中抽提純化RNA，采用RT-qPCR法檢測了miR-21的表達水平，發現miR-21在大腸癌組織中表達明顯高于相應的癌旁正常組織，與前人研究結果相一致；且miR-21的表達與大腸癌患者的發病年齡及腫瘤分化程度、淋巴結是否轉移、浸潤深度密切相關，提示其可能參與腫瘤的發生發展、分化及轉移等生物學行為的調節。隨著實驗方法的不斷改進，石蠟組織RNA提取技術日趨成熟，結合完善的臨床信息，我們可以推測miR-21與大腸癌臨床分期、病理分型、預后判斷、化療耐藥等多方面也存在聯系。

綜上所述，鑒于miRNA在石蠟包埋組織中化學結構和性質相對穩定，以及隨著miRNA的廣泛、深入研究，石蠟組織RNA提取技術日趨成熟，其在腫瘤的發生發展過程中的調節機制將進一步被闡明，特異性強、敏感性高的miRNA陸續被發現并在臨床的應用中取得突破性進展。屆時，石蠟包埋組織將成為miRNA研究的主要材料之一，miRNA真正應用于臨床的時代便正式到來。

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MiR-21 expression changes in paraffin-embedded tissues of colorectal cancer

YANXiaoli,DUMengnan,ZHENGJining

(ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

Objective To observe the expression changes of microRNA-21 (miR-21) in paraffin-embedded tissues of colorectal cancer, and to explore its clinical significance. Methods We extracted RNA from 40 cases of colorectal cancer samples and their corresponding cancer-adjacent normal tissues which were fixed by formalin and embedded by paraffin. MiR-21 expression was detected by reverse transcription quantitative real-time PCR, and we analyzed the relationship between the miR-21 expression and clinicopathologic features of colorectal cancer patients. Results The relative expression of miR-21 in the cancer tissues was -4.28±1.67, which was 4.69 times higher than that (-2.05±1.85) in the normal tissues adjacent to carcinoma (P<0.05).There was no significant difference in the expression of miR-21 among patients with different sex, tumor shape and position (allP>0.05). However, the level of miR-21 in patients with median age or higher, lymph node metastasis, low degree of differentiation and high infiltration depth of carcinoma was higher than that in patients with age lower than the median age, no lymph node metastasis, high degree of differentiation and low infiltration depth of carcinoma (allP<0.05).Conclusions MiR-21 expression is increased in paraffin-embedded tissues of colorectal cancer, indicating miR-21 may be involved in the regulation of biological behaviors, such as the occurrence, development, differentiation and metastasis of colorectal cancer. Paraffin-embedded tissue may be an important resource for studying tumor microRNAs.

colorectal carcinoma; microRNA-21; paraffin-embedded tissues; polymerase chain reaction

河北省高校重點學科建設資助項目(031412)；河北省教育廳重點課題資助項目(ZD2014013)；河北省研究生創新資助項目(2016-275)。

嚴曉麗(1989-)，女，碩士研究生，主要研究方向為大腸癌多藥耐藥。E-mail: 379024364@qq.com

鄭紀寧(1967-)，女，教授，研究生導師，主要研究方向為大腸癌多藥耐藥。E-mail: zhengjining196711@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.004

R735.3

A

1002-266X(2017)10-0011-04

2016-09-03)