中國西南地區漢族人群PRSS1基因多態性與慢性胰腺炎的關系

朱雨田，姚伍秀，汪洋，嚴茂林，陳和平

(1電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院，成都610072；2電子科技大學醫學院)

中國西南地區漢族人群PRSS1基因多態性與慢性胰腺炎的關系

朱雨田1,2，姚伍秀1，汪洋1,2，嚴茂林1，陳和平1,2

(1電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院，成都610072；2電子科技大學醫學院)

目的 探討中國西南地區漢族人群中陽離子胰蛋白酶原(PRSS1)基因單核苷酸多態性(SNP)與慢性胰腺炎(CP)的關系。方法 收集西南地區漢族人群樣本864例，其中確診CP患者384例(CP組)，體檢健康者480例(對照組);選取PRSS1基因rs10273639、rs6667和rs2011216 3個位點，采用單堿基延伸法檢測SNP位點，分析其與CP的相關性。結果 rs6667位點G等位基因頻率在CP組和對照組中分別為37.8%、29.8%，GG基因型頻率分別為14.1%、7.5%，兩組比較P均<0.05；rs2011216 位點G等位基因頻率在CP組和對照組中分別為33.2%、26.5%，GG基因型頻率分別為10.4%、6.0%，兩組比較P均<0.05； rs10273639等位基因及基因型在CP組與對照組比較差異無統計學意義。二元Logistic回歸分析，rs6667位點G等位基因攜帶者患CP的風險是A等位基因的1.18倍，在顯性模式[(AG+GG)vsAA] 和隱性模式[GGvs(AG+AA)]下CP組患病風險分別是對照組的1.18、1.76倍；rs2011216 位點G等位基因攜帶者患CP的風險是A等位基因的1.16倍，在顯性模式[(AG+GG)vsAA]和隱性模式[GGvs(AG+AA)] 下CP組患病風險分別是對照組的1.17、1.34倍；rs10273639位點下顯性模式[(TC+CC)vsTT]和隱性模式[CCvs(TC+TT)]在CP組與對照組比較差異均無統計學意義。結論 PRSS1基因rs6667和rs2011216的SNP位點可能是中國西南地區漢族人群CP的易感基因位點。

慢性胰腺炎；陽離子胰蛋白酶原；單核苷酸多態性；漢族；中國西南地區

研究顯示，慢性胰腺炎(CP)是一種由遺傳因素與環境因素共同作用的多因素疾病。陽離子胰蛋白酶原(PRSS1)基因，亦稱絲氨酸蛋白酶1基因，是編碼絲氨酸蛋白酶家族中的一種胰蛋白酶原。其由胰腺分泌進入小腸，并在腸激酶的激活下轉換為胰蛋白酶[1,2]。PRSS1基因功能獲得性突變，可以通過改變胰蛋白酶識別位點來阻止胰蛋白酶的失活，從而延續其活性，導致CP的患病風險大大增加[3]。國外已有2篇全基因組關聯研究(GWAS)[4,5]發現，PRSS1基因單核苷酸多態性(SNP)位點與CP具有顯著相關性，而目前國內尚未見PRSS1基因SNP與CP相關關系的報道。鑒于疾病的遺傳和表型在不同人種和地區有較大異質性，以及SNP位點最小等位基因頻率(MAF)的分布在不同人種中也存在差異，故在進行群體關聯研究相關基因或位點時,應在不同地區及人種中進一步驗證。因此，本研究通過應用單堿基延伸法(SNaPshot)法對384例CP患者和480例健康對照者PRSS1基因rs10273639、rs6667和rs2011216 3個SNP位點進行基因分型，探討西南地區漢族人群PRSS1基因與CP的關聯性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集中國西南地區漢族人群樣本864例，其中2010年10月～2016年6月在四川省人民醫院和四川省人民醫院崇州分院確診的CP患者384例(CP組)，同期健康體檢者480例(對照組)。CP組中男242例、女142例，年齡(55.46±17.91)歲，診斷符合2014年由中華醫學會外科學分會胰腺外科學組制定的《慢性胰腺炎診治指南》[6]，均排除腫瘤、高血壓、代謝性疾病、自身免疫性疾病等基礎疾病。對照組中男295例、女185例，年齡(54.42±18.95)歲，均體檢健康，無胰腺疾病及其他遺傳病。兩組均無親緣關系，且性別、年齡和地域分布具有可比性。本研究經四川省人民醫院倫理委員會批準，全部調查和取樣均征得受試者同意并簽署知情同意書。

1.2 PRSS1基因多態性檢測方法

1.2.1 基因組DNA提取 抽取每位研究對象外周靜脈血(EDTA抗凝)4 mL，采用基因組DNA小量抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)提取靜脈血白細胞基因組DNA，并溶解于TE緩沖液中。NanoDrop 2000檢測DNA濃度和純度后，將DNA工作液校正至50 ng/μL，于-20 ℃保存備用。

1.2.2 PRSS1基因SNP位點的選擇 選取的PRSS1基因SNP位點信息來源于美國國立生物技術信息中心(NCBI)dbSNP，以連鎖不平衡(LD)相關系數r2>0.8、MAF>0.1為選擇標準，并結合現有國內外研究結果，研究較多的是rs10273639、rs6667、rs2011216、rs1985888、rs9969188、rs4726576；參考hapmap數據庫(http://www.hapmap.org)中漢族人PRSS1基因信息，選取其中有陽性意義的rs10273639、rs6667和rs2011216 3個SNP位點進行檢測。

1.2.3 目的片段擴增 從UCSC基因組數據庫網站(http://genome.ucsc.edu/index.html)檢索SNP序列，引物設計使用Primer 3.0在線軟件，并委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成，擴增反應采用MyCycler Thermal Cycler擴增儀(美國Bio-Rad公司)。PCR循環條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共進行35個循環；最后72 ℃延伸7 min，12 ℃保溫。DNA濃度為50 ng/μL，引物濃度為1 μmol/L。PRSS1基因SNP位點引物序列，見表1。

表1 PRSS1基因SNP位點引物序列

1.2.4 基因分型 采用SNaPshot法。6 μL的PCR產物(rs10273639、rs6667和rs2011216擴增產物各2 μL混合)中加入1 U堿性磷酸酶 (FastAP，美國Promega公司)以及1 U核酸外切酶(Exo I酶，英國Biolabs公司)混勻，37 ℃ 30 min、80 ℃ 15 min進行PCR產物純化。取純化混合產物2 μL，分別加入SNaPshot引物各0.2 μL，SNaPshot?RMultiplex試劑(美國ABI公司)1 μL，最后用ddH2O補足至5 μL。熒光PCR反應條件：96 ℃預變性1 min；96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，共進行25個循環；12 ℃保溫。最后吸取1 μL上述反應產物后加入10 μL ddH2O混勻，放入ABI3130型測序分析儀(美國ABI公司)檢測基因型，利用Gene Mapper4.0軟件進行基因型的判定和數據的收集整理。結果判讀：根據檢測到不同顏色的熒光信號來判斷堿基種類，從而確定樣本基因型。綠色代表堿基A、藍色代表堿基G、紅色代表堿基T、黑色代表堿基C，單峰表示基因型純合，雙峰表示基因型雜合。為確保分型結果的準確性，隨機選取5%的樣本通過直接測序法進行驗證。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。兩組人群基因型頻數均行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，兩組SNPs位點基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗；采用二元Logistic回歸分析等位基因及遺傳模型(顯性模式和隱性模式)與疾病的關系，并用比數比(OR)及其95%可信區間(95%CI)表示。P<0.05為差異有統計學意義。顯性模式 =(mm+Mm)/ MM，隱性模式=(Mm+MM)/mm。m為次要等位基因，M為主要等位基因。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果 所選PRSS1基因3個SNP位點均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)，說明樣本具有群體代表性。

2.2 PRSS1基因SNPs位點基因型和等位基因分布情況 rs6667位點G等位基因頻率在CP組和對照組中分別為37.8%、29.8%，GG基因型頻率分別為14.1%、7.5%，兩組比較P均<0.05；rs2011216 位點G等位基因頻率在CP組和對照組中分別為33.2%、26.5%，GG基因型頻率分別為10.4%、6.0%，兩組比較P均<0.05； rs10273639等位基因及基因型在CP組與對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組PRSS1基因SNPs位點基因型和等位基因分布情況

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 PRSS1基因SNPs位點與CP的關系 二元Logistic回歸分析，rs6667位點G等位基因攜帶者患CP的風險是A等位基因的1.18倍(P=0.014，95%CI為1.03～1.35)，在顯性模式[(AG+GG)vsAA] 和隱性模式[GGvs(AG+AA)]下CP組患病風險分別是對照組的1.18倍(P=0.006，95%CI為1.05～1.33)、1.76倍(P=0.000，95%CI為1.44～2.15)；rs2011216 位點G等位基因攜帶者患CP的風險是A等位基因的1.16倍(P=0.034，95%CI為1.00～1.33)，在顯性模式[(AG+GG)vsAA]和隱性模式[GGvs(AG+AA)]下CP組患病風險分別是對照組的1.17倍(P=0.009，95%CI為1.04～1.32)、1.34倍(P=0.018，95%CI為1.10～1.66)；rs10273639位點下顯性模式[(TC+CC)vsTT]和隱性模式[CC vs(TC+TT)]在CP組與對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

3 討論

CP是一種進展性且不可逆轉的胰腺炎癥性疾病，長期的慢性炎癥刺激增加罹患胰腺癌的概率[7,8]。研究表明，CP是遺傳因素和環境因素交互作用的結果[2]，以基因突變和SNP為標記的關聯研究可以提示疾病的遺傳易感性，有助于CP發病機制的闡明和發現高危人群。

PRSS1基因是第一個確定的CP易感基因[9]，相繼在德國人群、法國人群、印度人群中驗證了PRSS1基因多態性與CP存在關聯[4,5, 10]。PRSS1基因定位在常染色體7q34，包含7個外顯子，目前已被發現的SNP位點有1 055個。該基因可編碼一種胰蛋白酶原，其作用是水解食物中含賴-精氨酸殘基的蛋白質，同時在激活或滅活其他消化酶的過程中起關鍵作用[11]。PRSS1基因異常將導致胰蛋白酶原過度催化并轉化成胰蛋白酶，引起腺泡細胞損傷或自溶，從而導致胰腺導管和間質受損[12],最終演變成慢性胰腺炎或胰腺疾病。在中國的一個遺傳性胰腺炎家系中發現， PRSS1基因3號外顯子區136位堿基的C→T雜合性突變可能與該病有關[13]；但是，Chandak等[14]的研究表明,在印度人群中PRSS1基因與CP的發病無關。這些不一致的研究結果表明,基因與疾病關聯的異質性與地區、人種等存在密切的關系。

本研究采用病例-對照法,探討西南地區漢族人群PRSS1基因多態性與CP的關聯性,兩組中檢測的各多態性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，表明該樣本在一定程度上能較好地代表中國漢族人群的遺傳學特征。結果顯示，PRSS1基因rs6667和rs2011216位點GG基因型分布和G等位基因頻率在CP組和對照組比較差異有統計學意義，且兩組rs6667和rs2011216位點在顯性模式及隱性模式下差異同樣具有統計學意義，表明rs6667和rs2011216可能與中國西南漢族人群CP的發生存在相關性，與德國人群[15]中的研究結果一致。既往諸多研究[16～19]表明，同義突變雖然不改變蛋白的性狀，但可以影響蛋白的表達和功能。其機制包括：①同義突變改變mRNA的堿基組成，導致mRNA的二級結構發生變化，從而影響mRNA結構的穩定性；②同義突變有可能產生新的隱藏剪接位點或者影響調控元件，如沉默子、外顯子剪接增強子等，從而導致mRNA剪接的異常；③同義突變可以影響翻譯速率。rs6667和rs2011216位點均是PRSS1基因上的同義突變，很可能在一定程度上影響了PRSS1基因的蛋白表達水平，引起胰蛋白酶活性的改變，從而導致CP的發生。Whitcomb等[4]研究發現，攜帶rs10273639 T等位基因(CT+TT)的個體對于CP的易感性要顯著低于攜帶CC基因型的個體，但本研究結果顯示rs10273639與中國西南地區漢族CP無關，這可能是由于該位點基因型存在種族差異性。另外Boulling等[20]運用熒光素酶報告基因檢測的方法證實，是rs4726576的A等位基因在PRSS1-PRSS2基因中起到保護作用，而不是rs10273639的T等位基因，有待后續實驗進一步驗證。

總之，本研究結果初步驗證了PRSS1基因rs6667和rs2011216的SNP位點是中國西南漢族人群的易感基因位點，對后續的功能研究提供了理論依據；但本研究存在一定局限性，如樣本量較小、僅限于漢族人群，后續研究尚需擴大樣本量并收集多民族樣本，以進一步明確PRSS1基因多態性在CP遺傳易感性中的作用。

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Association between PRSS1 gene polymorphism and chronic pancreatitis in southwestern Chinese Han population

ZHUYutian1,YAOWuxiu,WANGYang,YANMaolin,CHENHeping

(1SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China)

Objective To investigate the association between PRSS1 single nucleotide polymorphism (SNP) and chronic pancreatitis (CP) in southwestern Chinese Han population. Methods Genomic DNA was prepared from 384 individuals with CP (CP group) and 480 healthy controls (control group). Three SNPs in the PRSS1 gene (rs10273639, rs6667 and rs2011216) were selected by case-control study. The SNPs were detected by single-base extension method and their correlation with CP was analyzed.Results All three SNPs conformed to Hardy-Weinberg equilibrium (allP>0.05). The G allele frequencies of rs6667 and rs2011216 were 37.8%, 33.2%, 29.8% and 26.5% in the CP group and control group, respectively. The GG genotype frequencies were 14.1%, 10.4%, 7.5% and 6.0% (allP<0.05). The allele and genotype of rs10273639 had no significant difference between the CP group and control group (allP>0.05). Binary logistic regression analysis showed that the risk of CP in rs6667 G allele was 1.18 times more than that in A allele, while in the dominant model [(AG+GG) vs AA] and recessive model [GG vs (AG+AA)] it was 1.18-fold and 1.76-fold higher in CP group than that of the control group, respectively. In the risk of developing CP, rs2011216 G allele carriers were1.16 times as high as the A allele carriers. In the dominant model [(AG + GG) vs AA] and recessive model [GG vs (AG + AA)], the risk of CP group was 1.17 times and 1.34 times higher than that of the control group, respectively. In addition, rs10273639 was not associated with CP susceptibility (P>0.05). Conclusion The rs6667 and rs2011216 loci of the PRSS1 gene may be associated with chronic pancreatitis among southwestern Chinese Han population.

chronic pancreatitis; PRSS1 gene; single nucleotide polymorphism; Han nationality; southwest of China

四川省干部保健科研基金(川干研2016-203);四川省科技廳基金資助項目(2011FZ0036)；四川省人民醫院青年基金(2015QN19)。

朱雨田(1993-)，女，碩士研究生，主要研究方向為消化系統疾病的機制。E-mail: zytlessismore@163.com

陳和平(1963-)，男，博士，博士生導師，主任醫師，主要研究方向為消化系統疾病的機制。E-mail: doctorchenhp@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.006

R394.3

A

1002-266X(2017)10-0020-04

2016-10-24)