載氯諾昔康殼聚糖關節腔注射用溫敏凝膠的制備及體外釋藥性觀察

田紅，黃桂華，朱圣俊，竇明金

(1濟南大學 山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南250022；2山東省醫學科學院附屬醫院；3 山東大學藥學院)

·藥學研究·

載氯諾昔康殼聚糖關節腔注射用溫敏凝膠的制備及體外釋藥性觀察

田紅1，2，黃桂華3，朱圣俊1,2，竇明金2

(1濟南大學 山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南250022；2山東省醫學科學院附屬醫院；3 山東大學藥學院)

目的 制備關節腔注射用載氯諾昔康(Lnxc)殼聚糖溫敏凝膠，觀察其理化性質及體外釋藥性。方法 以殼聚糖、β-甘油磷酸鈉(β-GP)為材料制備載Lnxc溫敏凝膠，以膠凝溫度、時間、通針性為評價指標，優化處方工藝；采用椎板法觀察凝膠的流變學性質，采用離心試驗、溫度試驗觀察凝膠的穩定性，采用動態膜透析法觀察載Lnxc溫敏凝膠和Lnxc溶液的體外釋藥特性。結果 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的最佳處方為Lnxc 2 mg、3% 殼聚糖、60%β-GP、pH 7.2，所制備的溫敏凝膠屬于非牛頓流體，離心后無分層現象，4 ℃和25 ℃條件下呈流動狀，37 ℃發生相變形成凝膠。Lnxc溶液8 h藥物累積釋放率86.70%，載Lnxc溫敏凝膠72 h藥物累積釋放率86.41% ，釋藥規律符合Higuchi方程。結論 成功制備載Lnxc殼聚糖關節腔用溫敏凝膠，其具有理想的膠凝溫度和較好的緩釋效果。

骨關節炎；氯諾昔康；殼聚糖；β-甘油磷酸鈉；溫敏凝膠；理化性質；釋藥特性

氯諾昔康(Lnxc)是治療骨關節炎的常用藥物，目前臨床上應用的主要是片劑和注射劑，其半衰期為3～5 h，為達到有效血藥濃度需頻繁給藥，患者依從性較差。溫敏凝膠可作為藥物的儲庫，具有緩慢釋放藥物、提高藥物療效的作用。2015年3月～2016年5月，我們以殼聚糖、β-甘油磷酸鈉(β-GP)為材料制備載Lnxc關節腔注射用溫敏凝膠，經優化處方工藝后觀察其理化性質及體外釋藥性。

1 儀器與試劑

ER-182A型電子天平(日本)，AL104-IC精密分析天平(瑞士梅特勒公司)；電磁攪拌儀，HZ-8812S恒溫振蕩器(華利達公司)，TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；移液器(德國Eppendorf公司) ，臺式 pH 計(梅特勒公司，瑞士)。殼聚糖(SIGMA-ALDRICH),β-甘油磷酸鈉(β-GP，上海恒斐生物科技有限公司)，Lnxc(湖北遠成賽創科技有限公司)，其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的預制備 稱取適量的殼聚糖溶解于0.1% mol/L的醋酸溶液1 mL中，在磁力攪拌作用下充分溶解；在冰浴條件下，將適量60%的β-GP溶液緩緩滴入殼聚糖醋酸溶液中，充分攪拌10 min后制備得空白溫敏凝膠。將Lnxc粉碎后過80目篩，稱取適量，將其混懸于空白溫敏凝膠中即得載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠。膠凝溫度(36.5±0.5)℃，膠凝時間(4±0.5)min，通針性良好。

2.2 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠制備工藝的優化

2.2.1 殼聚糖濃度 配制1%、2%、3%、4%的殼聚糖醋酸溶液各1 mL，冰浴攪拌條件下緩慢滴入相同量60%的β-GP溶液，調節pH到7.0。以膠凝溫度、膠凝時間及通針性作為評價指標，在水浴加熱條件下觀察不同濃度的殼聚糖對載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠形成的影響，采用倒置法觀察凝膠的形成。膠凝溫度隨著殼聚糖濃度的增大而降低，1%殼聚糖通針性較好，但直至50 ℃未形成凝膠；2%殼聚糖通針性良好，膠凝溫度46 ℃且膠凝時間較長(556 s)，不利于藥物在關節腔形成凝膠；3%殼聚糖通針性良好，膠凝溫度為37.8 ℃且膠凝時間為261 s；4%殼聚糖膠凝溫度31 ℃，膠凝時間268 s，但通針性較差，不宜注射。因此，以3%的殼聚糖為最佳。

2.2.2 β-GP濃度 配制3%殼聚糖醋酸溶液2份各1 mL，分別滴加30%和60%的β-GP，調節pH到7.0。以膠凝溫度、膠凝時間及通針性作為評價指標，水浴加熱條件下觀察不同濃度的β-GP對載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的形成的影響。30%β-GP形成凝膠的膠凝溫度為37.5℃、膠凝時間為311 s，60%β-GP形成凝膠的膠凝溫度為37.3℃、膠凝時間為287 s。但是30%β-GP形成凝膠后體系外含有少量的流動狀液體，60%β-GP則形成了均一、穩定的凝膠，故以60%β-GP為最佳。

2.2.3 pH值 配制3%殼聚糖溶液4份各1 mL，分別滴加60%的β-GP調節pH值到6.6、6.8、7.0、7.2。水浴加熱條件下，載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的膠凝溫度分別為38.7、38.2、37.7、36.9 ℃，膠凝時間分別為283、276、259、236 s，通針性均較好。因此，應滴加60% β-GP調節pH值到7.2左右。

2.2.4 載藥量 配制3%殼聚糖溶液5份各1 mL，分別滴加60%的β-GP調節pH值到7.2，然后向其中分別加入1、1.5、2、2.5、3 mg的Lnxc。在水浴加熱條件下，載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的膠凝溫度分別為37.0、36.9、36.6、37.0、36.7 ℃，膠凝時間分別為241、239、223、267、228 s，通針性均較好。為后期釋放實驗中能達到紫外分光光度計的檢測限，故將載藥量定為2 mg。

2.3 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠流變學觀察 采用椎板法。取按最佳處方新鮮制備的載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠，將其置于平板和椎板之間的空隙中；然后，逐漸減小平板與椎體之間的距離使兩者閉合，設置穩態剪切速率(γ)為0～1 000/s。在固定γ為10/s的條件下，記錄黏度(η，Pas)隨溫度升高的變化[7]；在37 ℃恒溫條件下，記錄剪切應力(τ，Pa)和黏度(η，Pas)隨γ升高的變化。由圖1(a)可知，在γ不變的條件下，溫敏凝膠的η在10～27 ℃隨溫度升高而降低，27～40 ℃隨溫度升高而增大，溫度為32 ℃時的η大于10 ℃時的η。該現象與溫敏凝膠的物理狀態相符，即當溫敏凝膠處于低溫條件下時為溶液狀態。27 ℃后隨溫度升高溶液η逐漸增大，32 ℃即可形成凝膠，但膠凝時間較長，36 ℃下膠凝時間較為適宜。由圖1(b)可知，當溫敏凝膠處于37 ℃的環境下，τ隨γ增大而增大，η隨γ增大而減小，其流變學行為表現為假塑性流體的特征。依據Ostwald-Dewaele方程的對數形式[8]：ln η= ln k+ (n-1) ln γ。其中n值為非牛頓指數，n越小說明非牛頓流體的性質越顯著；k為稠度系數，表示與牛頓流體偏離的程度。將γ對數值和η對數值進行線性擬合，得方程ln η=6.0475-0.1872 ln γ 。其中n為0.81，n值小于1,說明載Lnxc溫敏凝膠屬于非牛頓流體，線性相關系數r為0.997(表明方程擬合度相對較好)。

注：a圖為溫敏凝膠的η隨溫度變化的趨勢；b圖為溫敏凝膠的τ、η隨γ變化的趨勢。

圖1 載Lnxc溫敏凝膠流變學性質分析

2.4 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的穩定性觀察

2.4.1 離心試驗 將新鮮制備的溫敏凝膠置于10 mL的離心管中，以3 000 r/min離心20 min，凝膠無分層現象。

2.4.2 溫度試驗 將新鮮制備的溫敏凝膠分裝于西林瓶中，密封后分別置于-20 ℃、4 ℃、25 ℃的條件下。第10天-20 ℃條件下的凝膠出現結冰現象，4 ℃和25 ℃條件下的凝膠無任何變化，因此該凝膠應貯存于4～25 ℃的環境中。

2.5 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的體外釋放試驗 采用動態膜透析法。制備載Lnxc溫敏凝膠和濃度為1 mg/mL Lnxc溶液，分別吸取1 mL和2 mL置于截留分子量為8 000～14 000 Da的透析袋中。將透析袋兩端用細繩扎緊，置于37 ℃恒溫水浴中平衡5 min，使載藥溫敏凝膠膠凝。將載藥凝膠和藥物溶液分別置于含28 mL PBS釋放介質釋放介質(含1%吐溫-80，pH 7.4)的離心管中，將離心管置于轉速為100 r/min、水浴溫度為37 ℃的搖床中震蕩，按以上操作平行3次試驗。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h取5 mL釋放介質，同時補充5 mL 37 ℃的新鮮釋放介質，采用紫外分光光度法測定Lnxc釋放量。

由圖2可知，Lnxc溶液在釋放介質中釋放較為迅速，8 h的累積釋放率達到86.7%；而Lnxc凝膠釋放較為緩慢，8 h的累積釋放率為43.36%，72 h的累積釋放率達到86.41%，緩釋效果顯著。Lnxc溶液和載藥溫敏凝膠的體外釋藥均符合Higuchi方程，回歸系數r分別為0.992和0.990,說明藥物均勻的分布在載體中。采用Peppas方程[9]分析Lnxc溶液和載藥溫敏凝膠的釋藥機制,得方程Log Q=0.389 1 Log t+1.611和Log Q=0.324 2 Log t+1.342，釋藥系數n分別為0.381 9和0.324 2。對于圓柱形制劑，當n≤0.45時藥物的釋放機制為Fickian擴散，回歸系數r分別為0.997和0.993。

注：sol為Lnxc溶液；gel為載Lnxc溫敏凝膠

圖2 Lnxc溶液和載Lnxc溫敏凝膠的體外釋放曲線

3 討論

骨關節炎是一種最常見的關節疾病，主要是由關節軟骨變性，關節軟骨的蛋白多糖生物合成異常導致的退行性病變[1]，嚴重影響患者的生活質量。Lnxc是一種非甾體抗炎藥，通過抑制環氧合酶和誘導性一氧化氮合酶，防止炎癥介質的生成，廣泛應用于術后疼痛和類風濕關節炎[2]。溫敏凝膠是指以溶液狀態給藥后，通過高分子材料對外界溫度的響應而發生相轉變，由液態轉化為非化學交聯的半固體凝膠制劑[3]，用于病變部位的局部給藥可延長釋藥周期、降低給藥劑量和藥物不良反應，且工藝相對簡單[4]。殼聚糖是一種天然的陽離子生物多糖，其本身無溫敏性，但在其骨架上嫁接如異丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、β-GP后即具有顯著溫敏特性[5]。殼聚糖/β-GP溫敏凝膠具有生理中性、37 ℃即可凝膠化、延緩藥物釋放等特點，可以作為藥物的載體材料[6]。

因殼聚糖難溶于大部分的有機溶劑、水和堿，因此本文將殼聚糖溶解于0.1%的醋酸溶液中。在稀酸條件下，殼聚糖上的氨基被質子化，破壞了其分子內部的氫鍵和立體規整性，羥基與水分子發生水合作用，導致殼聚糖分子溶脹而溶解[10]。β-GP是一種弱堿，加入到含有醋酸的殼聚糖溶液中，首先中和游離的氫離子，使溶液的pH升高(pH≥6.2)；殼聚糖鏈上的電荷密度減少,降低了殼聚糖鏈間的靜電排斥力,使疏水鍵和氫鍵引力相對提高，從而出現沉淀；繼續加入β-GP ,弱堿作用使β-GP上的磷酸鹽和殼聚糖上的胺基相互吸引而使甘油部分暴露 ,殼聚糖鏈分離，因此殼聚糖在較高的 pH 值下仍然可以保持液態[11]。溫度升高后,由于分子熱運動加強，靜電斥力下降，殼聚糖與水之間的氫鍵作用降低，使得溫敏凝膠的η降低；當疏水鍵和殼聚糖鏈間氫鍵的引力大于鏈間的靜電排斥力時,殼聚糖分子相互聚集，η增加，發生物理結合形成凝膠。本研究結果顯示，載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的最佳處方為Lnxc 2 mg、3% 殼聚糖、60%β-GP、pH 7.2，所制備的溫敏凝膠屬于非牛頓流體，離心后無分層現象，4 ℃和25 ℃條件下呈流動狀，37 ℃發生相變形成凝膠。Lnxc溶液8 h藥物累積釋放率86.70%，載Lnxc溫敏凝膠72 h藥物累積釋放率86.41% ，釋藥規律符合Higuchi方程。

綜上所述，所制備的載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠性質穩定，體外釋放結果顯示具有良好的緩釋作用。盡管體外釋放條件已模擬體內條件，但是與體內真實情況依然具有一定的差異性，因此還需體內藥物動力學的評價進一步研究其緩釋效果。

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山東省科技發展計劃項目 (2014GSF121012)。

竇明金(E-mail: mingjindou1965@126.com)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.036

R944.9

A

1002-266X(2017)10-0100-03

2016-11-12)