黑骨藤皂苷對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠的治療作用及對(duì)Th1型免疫反應(yīng)的影響

鮑春梅，孫廣臣(桂林醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，廣西桂林54000；桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院)

黑骨藤皂苷對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠的治療作用及對(duì)Th1型免疫反應(yīng)的影響

鮑春梅1，孫廣臣2
(1桂林醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，廣西桂林541000；2桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院)

目的 探討黑骨藤皂苷對(duì)特應(yīng)性皮炎(AD)小鼠的治療作用及對(duì)Th1型免疫反應(yīng)的影響。方法 30只BLAB/c雌性小鼠隨機(jī)分為正常組8只，模型組10只，黑骨藤皂苷組12只。除正常組外，其余兩組均需造模。將小鼠腹部體毛剃去，用1.5% 2，4-二硝基氯苯(DNCB)(丙酮∶橄欖油=4∶1)溶液100 μL涂在腹部剃毛處初次致敏，2周后在小鼠耳廓內(nèi)外兩側(cè)相同位置涂1% DNCB溶液20 μL，1周重復(fù)刺激3次，連續(xù)2周，共造模30 d。從初次致敏起，黑骨藤皂苷組給予黑骨藤皂苷(0.002 g/d)灌胃，正常組和模型組分別給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)灌藥30 d。從再次致敏當(dāng)天(造模第14天)用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只小鼠兩耳中部厚度，以后每次DNCB刺激前測(cè)量1次并記錄，觀察小鼠兩耳外觀腫脹情況。在末次耳部DNCB刺激12 h后取材，采用臨床癥狀評(píng)分評(píng)價(jià)小鼠耳朵大體外觀；切取耳部皮膚做病理切片，HE染色觀察小鼠耳朵組織表皮厚度，甲苯胺藍(lán)染色觀察肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況；采用免疫組化法檢測(cè)耳組織CD68蛋白的表達(dá)；采用ELISA法測(cè)定血清IgE、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，不同時(shí)間正常組與黑骨藤皂苷組左耳厚度均降低(P<0.05或<0.01)。正常組、模型組、黑骨藤皂苷組臨床癥狀評(píng)分組間兩兩比較，P均<0.01。正常組、模型組、黑骨藤皂苷組耳部組織表皮厚度組間兩兩比較，P均<0.01；真皮層肥大細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目組間兩兩比較，P均<0.01。與正常組比較，模型組組織CD68及血清TNF-α、IgE、MCP-1水平均升高；與模型組比較，黑骨藤皂苷組組織CD68蛋白及血清TNF-α、IgE、MCP-1水平均降低(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 黑骨藤皂苷對(duì)AD小鼠有治療作用，可抑制Th1型免疫反應(yīng)。

特應(yīng)性皮炎；黑骨藤皂苷；Th1型免疫反應(yīng)；CD68；IgE；腫瘤壞死因子；小鼠

特應(yīng)性皮炎(AD)是一種慢性反復(fù)發(fā)作伴瘙癢的炎癥性皮膚病，全球有10%～20%兒童和1%～3%成人受其影響[1]，病因與發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，可能與環(huán)境、免疫及基因等因素有關(guān)[2]。AD慢性期Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)[ 3]，在慢性期，Th1細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，并產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-α)，以介導(dǎo)細(xì)胞免疫為主，肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞也可分泌TNF-α。臨床上治療AD主要集中在組胺受體拮抗劑和糖皮質(zhì)激素的使用，但由于存在明顯不良作用，使其臨床應(yīng)用受到限制。黑骨藤是貴州常用苗家草藥，具舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、止痛的功效，主治風(fēng)濕麻木疼痛、跌打損傷、骨折及骨痛等[4]。黑骨藤中主要含有強(qiáng)心苷類、C21甾類、黃酮類和三萜皂苷類等成分，其中三萜皂苷類具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗病毒以及降低膽固醇、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等[5]。2016年6～7月，本試驗(yàn)用2，4-二硝基氯苯(DNCB)誘發(fā)小鼠特應(yīng)性皮炎(AD)模型，探討黑骨藤皂苷對(duì)特應(yīng)性皮炎(AD)小鼠的治療作用及對(duì)Th1型免疫反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：SPF級(jí)6～8周齡BLAB/c雌性小鼠30只，體質(zhì)量約20 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度65%。試劑：黑骨藤購(gòu)于廣西玉林；DNCB、CD68購(gòu)自abcam公司；鼠IgE ELISA Ready-SET-Go、鼠TNF-α ELISA Ready-SET-Go、鼠單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1) ELISA Ready-SET-Go均購(gòu)自eBioscience公司。

1.2 黑骨藤皂苷提取物制備 120 g黑骨藤粉末用75%乙醇回流提2次，回收乙醇得浸膏，浸膏用適量乙醇溶解后依次用石油醚、正丁醇萃取，得到黑骨藤皂苷提取物6.7 g。

1.3 動(dòng)物分組及AD模型的建立 30只BLAB/c雌性小鼠隨機(jī)分為正常組8只、模型組10只、黑骨藤皂苷組12只，除正常組外，其余兩組均需造模。參照文獻(xiàn)[6]建立小鼠AD模型。將小鼠腹部體毛剃去，面積約2.5 cm×2.5 cm，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日用1.5% DNCB(丙酮∶橄欖油=4∶1)溶液100 μL涂在腹部剃毛處初次致敏，2周后再次致敏，在小鼠耳廓內(nèi)外兩側(cè)相同位置涂1% DNCB溶液20 μL，1周重復(fù)刺激3次，連續(xù)2周，共造模30 d。成功造模小鼠可見(jiàn)耳部出現(xiàn)紅斑、腫脹、滲出和結(jié)痂。從初次致敏起，給黑骨藤皂苷組小鼠灌中藥黑骨藤皂苷(0.002 g/d)，正常組和模型組小鼠分別給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)灌藥30 d。在末次DNCB刺激12 h后，3組小鼠均眼球取血，并切取耳部皮膚做病理切片。

1.4 觀察指標(biāo)及其檢測(cè)方法 ①小鼠耳朵腫脹程度：從再次致敏當(dāng)天(干預(yù)第14天)用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只小鼠兩耳中部厚度，以后每次DNCB刺激前(即造模第14、17、20、23、26、29、30天)測(cè)量1次并記錄，觀察小鼠兩耳外觀腫脹情況。②小鼠耳朵大體外觀：采用臨床癥狀評(píng)分評(píng)價(jià)。末次DNCB刺激12 h后取材，麻醉后對(duì)小鼠耳朵部位進(jìn)行拍照。肉眼觀察小鼠耳朵大體外觀，分別將皮損紅斑、水腫、抓痕、干燥程度分為正常(0分)、輕度(1分)、中度(2分)、重度(3分)[7]。依次為每只小鼠打分，將分?jǐn)?shù)相加算其總和并計(jì)算每組平均值。③小鼠耳朵組織表皮厚度及肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況：末次DNCB刺激12 h后取小鼠左耳朵組織約1 cm×1 cm，于10%甲醛固定20 h，15%的EDTA脫鈣2 d，石蠟包埋和病理切片(4 μm)。HE染色，每組任選10個(gè)高倍視野(×400)觀察小鼠耳朵組織表皮厚度，通過(guò)Image J軟件測(cè)量分析各組小鼠表皮厚度，算出平均值；甲苯胺藍(lán)染色觀察肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況，單盲法分別計(jì)算每組10個(gè)高倍視野(×400)真皮肥大細(xì)胞數(shù)，取其平均值。④小鼠耳組織CD68的表達(dá)：采用免疫組化法檢測(cè)。石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加5%血清封閉，依次滴加一抗、抗鼠二抗，然后滴加DBA顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片觀察。通過(guò)Ipwin32軟件分析各組小鼠棕黃色或棕褐色陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(A值)，并算出每組平均值。⑤血清IgE、TNF-α及MCP-1水平：取小鼠眼球血1 mL，EDTA抗凝后3 000 r/min離心15 min。采用ELISA法測(cè)定血清中IgE、TNF-α、MCP-1的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)具體步驟均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 3組不同時(shí)間左耳厚度比較 見(jiàn)表1。

表1 3組不同時(shí)間左耳厚度比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 3組左耳皮膚大體外觀比較 成功建立小鼠AD模型及干預(yù)結(jié)束后，正常組小鼠耳部皮膚變化不明顯，其他兩組出現(xiàn)不同程度的紅斑、水腫、抓痕、干燥等癥狀。用DNCB刺激小鼠耳朵造模第14天，模型組出現(xiàn)明顯的紅疹、水腫、抓痕及干燥癥狀，而黑骨藤皂苷組小鼠耳朵皮損較模型組有所減輕。正常組、模型組、黑骨藤皂苷組臨床癥狀評(píng)分分別為(0.18±0.06)、(5.90±1.17)、(3.43±0.85)分。3組之間兩兩比較，P均<0.01。

2.3 3組耳部組織表皮厚度及真皮層肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況比較 正常組、模型組、黑骨藤皂苷組耳部組織表皮厚度分別為(1.09±0.18)、(7.94±3.05)、(3.32±0.80)mm，組間兩兩比較，P均<0.01；真皮層肥大細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目分別為(7.40±1.65)、(29.20±4.02)、(13.00±1.94)個(gè)/400倍視野，組間兩兩比較，P均<0.01。

2.4 3組耳皮膚組織CD68蛋白及血清中IgE、TNF-α、MCP-1水平比較 CD68蛋白主要表達(dá)在胞質(zhì)及部分胞核中，胞膜無(wú)特異性表達(dá)。各指標(biāo)比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3組耳皮膚組織CD68蛋白及血清中IgE、TNF-α、MCP-1水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

目前關(guān)于AD動(dòng)物模型的制備多采用小分子抗原反復(fù)刺激皮膚，其導(dǎo)致的慢性過(guò)敏性炎癥反應(yīng)類似人的AD[8]。DNCB作為一種常用的小分子抗原，其誘導(dǎo)的AD模型重復(fù)性較好。Choi等[6]應(yīng)用1% DNCB和10 mg/mL DFE反復(fù)涂擦BLAB/c雌性小鼠耳部皮膚，成功建立了小鼠AD模型。本試驗(yàn)應(yīng)用1% DNCB反復(fù)刺激BLAB/c雌性小鼠雙耳內(nèi)外兩側(cè)，小鼠耳部出現(xiàn)明顯皮損樣癥狀，組織病理濕疹樣改變，皮損處組織CD68高表達(dá)，血清IgE、TNF-α、MCP-1水平升高，表明Th1優(yōu)勢(shì)型BLAB/c小鼠AD模型建立成功。

本研究結(jié)果顯示,黑骨藤皂苷不僅減輕AD模型小鼠耳部腫脹程度及臨床炎癥癥狀，而且還抑制耳組織肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)及表皮厚度的增加。人體皮膚組織中的肥大細(xì)胞在AD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。在固有免疫和適應(yīng)性免疫的炎性介質(zhì)中，肥大細(xì)胞是惟一事先合成TNF-α的炎性細(xì)胞，當(dāng)抗原刺激時(shí)可迅速分泌TNF-α，其數(shù)量與AD皮損程度呈正相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)黑骨藤皂苷可抑制AD模型小鼠病理組織中肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)。

巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子和趨化因子可促進(jìn)血管增生、膠原合成以及纖維化[10]。在AD模型中，巨噬細(xì)胞在急性期與慢性期炎癥皮膚中都高表達(dá)，CD68是巨噬細(xì)胞典型的表面標(biāo)記物[11]，巨噬細(xì)胞被激活后可產(chǎn)生TNF-α，參與Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的Th1型免疫反應(yīng)。該試驗(yàn)中模型組耳皮損組織CD68蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常組，黑骨藤皂苷組耳皮損組織CD68蛋白水平較模型組下降，提示黑骨藤皂苷可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD68的表達(dá)，達(dá)到抗炎治療作用。

IgE是AD的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)，作為肥大細(xì)胞的主要催化劑，可刺激肥大細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、趨化因子及組胺等生物活性物質(zhì)[12]。 因此可以通過(guò)作用于IgE靶點(diǎn)來(lái)影響AD的結(jié)局。本研究結(jié)果顯示，模型組血清IgE水平表達(dá)升高，黑骨藤皂苷組血清IgE水平下降，提示黑骨藤皂苷可以降低AD模型大鼠血清IgE水平。Ⅰ型細(xì)胞因子TNF-α作為一種重要的炎癥前介質(zhì)，可以誘導(dǎo)AD患者炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生[13]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過(guò)作用于IKK2介導(dǎo)炎癥通路來(lái)加重AD模型炎癥癥狀[14]。黑骨藤皂苷可能通過(guò)降低血清TNF-α水平，來(lái)減輕皮膚炎癥因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚病角質(zhì)細(xì)胞中可檢測(cè)到MCP-1的高表達(dá)。MCP-1在單核細(xì)胞遷移到炎癥部位中起重要作用，通過(guò)肥大細(xì)胞脫顆粒作用來(lái)調(diào)節(jié)Th1型免疫反應(yīng)[15]。血清 MCP-1的水平與AD本身的病程變化和發(fā)展有關(guān)，可以輔助判斷AD的病情嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，模型組血清MCP-1水平較正常組升高，黑骨藤皂苷組血清MCP-1水平比模型組降低，說(shuō)明黑骨藤皂苷可以抑制AD模型大鼠血清MCP-1水平的表達(dá)。

總之，本研究結(jié)果表明黑骨藤皂苷對(duì)AD小鼠有較強(qiáng)的治療作用，它的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理目前尚不清楚，所以本試驗(yàn)嘗試去鑒定黑骨藤皂苷與T淋巴細(xì)胞之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，其可能是通過(guò)抑制Th1型免疫作用來(lái)治療AD，黑骨藤皂苷為臨床AD的進(jìn)一步治療研究提供了新的理念。

[1] Leung DY, Boguniewicz M, Howell MD, et al. New insights into atopic dermatitis[J]. Clin Invest, 2004,113(5):651-657.

[2] Ricci G, Patriz IA, Bald IE, et al. Long-term follow-up of atopic dermatitis: retrospective analysis of related risk factors and association with concomitant allergic diseases[J]. J Am Acadermatol, 2006,55(5):765-771.

[3] Girolomoni G, Sebastani S, Albanesi C, et al. T-cell subpopulations in the development of atopic and contact allergy[J]. Curr Opin Immunol, 2001,13(6):733-737.

[4] 貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材,民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M].貴陽(yáng):貴州科技出版社,2003:381.

[5] 申海艷,龔小見(jiàn),李文敏,等.苗藥黑骨藤中總皂苷含量的測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(11):94-97.

[6] Choi EJ, Lee SH, wang JS, et al. DA-9601 suppresses 2, 4-dinitrochlorobenzene and dust mite extract-induced atopic dermatitis-like skin lesions[J]. Int Immunopharmacol, 2011,11(9):1260-1264.

[7] Matsuoka H, Maki N, Yoshida S, et al. A mouse model of the atopic eczema/dermatitis syndrome by repeated application of a crude extract of house-dust mite Dermatophagoides farinae[J]. Allergy, 2003,58(2):139-145.

[8] Matsumoto K, Mizukoshi K, Oyobikawa M, et al. Establishment of an atopic dermatitis-like skin model in a hairless mouse by repeated elicitation of contact hypersensitivity that enables to conduct functional analyses of the stratum corneum with various non-invasive biophysical instruments[J]. Skin Res Technol, 2004,10(2):122-129.

[9] Ohmori K, Minamide K, Goto S, et al. Time-of-day-dependent variations of scratching behavior and transepidermal water loss in mice that developed atopic dermatitis[J]. J Vet Med Sci, 2014,76(11):1501-1504.

[10] Mirza R, DiPietro LA, Koh TJ. Selective and specific macrophage ablation is detrimental to wound healing in mice[J]. Am J Pathol, 2009,175(6):2454-2462.

[11] Kiekens RC, Thepen T, Oosting AJ, et al. Heterogeneity within tissue-specific macrophage and dendritic cell populations during cutaneous inflammation in atopic dermatitis[J]. Br J Dermatol, 2001,145(6):957-965.

[12] Weston S, Halbert A, Richmond P, et al. Effects of probiotics on atopic dermatitis: a randomised controlled trial[J]. Arch Dis Child, 2005,90(9):892-897.

[13] Behniafard N, Gharagozlou M, Farhadi E, et al. TNF-alpha single nucleotide polymorphisms in atopic dermatitis[J]. Eur Cytokine Netw, 2012,23(4):163-165.

[14] Pasparakis M, Courtois G, Hafne M, et al. TNF-mediated inflammatory skin disease in mice with epidermis-specific deletion of IKK2[J]. Nature, 2002,417(6891):861-866.

[15] Matsukawa A, Lukacs NW, Standiford TJ, et al. Adenoviral-mediated overexpression ofmonocyte chemoattractant protein-1 differentially alters the development of Th1 and Th2 type responses in vivo[J]. J Immunol, 2000,164(4):1699-1704.

Therapeutic effect of Periploca forrestii saponin on atopic dermatitis in mice and its influence on Th1 type immune response

BAOChunmei1,SUNGuangchen

(1ClinicalCollegeofGuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China)

Objective To investigate the therapeutic effect of Periploca forrestii saponin (PFS) on atopic dermatitis (AD) in mice and its influence on Th1 type immune response. Methods Thirty female BLAB/c mice were randomly divided into the normal group (n=8), model group (n=10), and PFS group (n=12). In addition to the normal group, mice in the other two groups were modeled. The mouse abdomen body was shaved and coated with 1.5% 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) (acetone∶olive oil=4∶1) solution 100 μL for the initial sensitization at the abdominal shaving, after 2 weeks, 20 μL of 1% DNCB solution was applied at the same position on both sides of the mouse auricle, we repeated stimulation 3 times in 1 week, and for 2 weeks, a total of 30 d. From the the initial immunization, the PFS group was given PFS (0.002 g/d), and the normal group and the model group were given equal volume of normal saline for 30 days. The thickness of the middle ears of each mouse was measured with a vernier caliper on the day of re-sensitization (day 14), and the mice were observed and recorded every time before the DNCB was stimulated to observe the swelling of the ears of the mice. At 12 h after last ear DNCB stimulation, the appearance of mouse ears was evaluated by clinical symptom score. The epidermis thickness of the ear tissues was observed by HE staining, and the infiltration of mast cells was observed by toluidine blue staining. The expression of CD68 protein was detected by immunohistochemistry. The levels of IgE, TNF-α and MCP-1 in serum were measured by ELISA. Results Compared with the model group, the thickness of the left ear of the normal group and the PFS group decreased,P<0.05 orP<0.01. Significant differences were found in the clinical evaluations, ear skin tissue thickness and dermal layer mast cell infiltration number between the normal group, model group and PFS group, allP<0.01. Compared with the normal group, CD68 protein, serum TNF-α, IgE and MCP-1 increased in the model group. Compared with the model group, CD68 and serum TNF-α, IgE and MCP-1 decreased in the PFS group (P<0.05 orP<0.01). Conclusion PFS has a therapeutic effect on AD in mice, and it can inhibit the Th1 immune response.

atopic dermatitis; Periploca forrestii saponin (PFS); Th1-type immune response; CD68; IgE; tumor necrosis factor; mice

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460474;81260462)。

鮑春梅(1987-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槊庖咚幚怼-mail：1099548403@qq.com

孫廣臣(1967-)，男，博士，主要研究方向?yàn)槊庖咚幚怼-mail：sungc2004@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.009

R758.2

A

1002-266X(2017)13-0032-04

2016-12-14)