抗瘤丸的質量標準研究

馮英楠 陳菲 張鵬 莊偉 林曉蘭

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·論著·

抗瘤丸的質量標準研究

馮英楠 陳菲 張鵬 莊偉 林曉蘭

目的 建立抗瘤丸系統的質量標準，以提高其質量。 方法 分別采用薄層色譜法對院內制劑抗瘤丸中三七、土茯苓、沉香、制何首烏及顯微鑒別法對炒山楂進行定性鑒別；并用高效液相色譜法對制劑中的三七、土茯苓進行含量測定。 結果 薄層色譜斑點清晰，陰性對照無干擾；三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、落新婦苷分別在0.3331～5.3302 μg(r=0.9999)、0.7857～12.5709 μg(r=0.9999)、0.1478～2.3654 μg(r=1.0000)范圍內呈良好的線性關系，平均回收率分別為98.70%、99.08%、98.76%。 結論 該法靈敏、簡便、準確和重復性好，可作為抗瘤丸的質量控制標準。

抗瘤丸； 質量標準； 高效液相色譜法； 薄層色譜法

膠質瘤是中樞神經系統最常見的一類腫瘤，呈迅速的浸潤性生長，治療困難，且生存期短，死亡率高，對人類健康威脅極大。外科手術是目前治療腦膠質瘤的主要手段，但是由于腦膠質瘤浸潤性生長的特性以及多累及腦重要功能區域或其附近，手術難以將腫瘤全部切除。放、化療雖可殺滅腫瘤細胞，但也將損傷正常腦組織，并導致全身不良反應的發生。

抗瘤丸是由白花蛇舌草、半枝蓮、白英等18味中藥組成的醫院制劑，主要功效為利濕解毒、扶正培本、活血化瘀。用于膠質瘤之濕熱藴毒證，臨床以頭痛、眩暈、視物不清，或兼嘔吐，舌紫黯或有瘀斑，脈沉或沉細等為特征，適用于腦膠質瘤、腦垂體瘤等見上述表現者的輔助治療。自1980年應用于臨床，至今已有30年的歷史，深受廣大患者的好評。于1986年獲北京科技進步一等獎，其有效率高達64.7%[1]；回顧性研究表明，院內制劑中藥抗瘤丸可以延長惡性神經膠質瘤患者的生存時間，具有肯定療效[2]。筆者對抗瘤丸進行系統的質量標準研究，可有效地控制抗瘤丸質量。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

三七皂苷R1(批號：110745-201318)；人參皂苷Rb1(批號：110704-201424)；人參皂苷Rg1(批號：110703-201128)；落新婦苷對照品(批號：111798-201303)；三七(批號：120941-201409)；制何首烏(批號：121454-201405)；沉香(批號：121222-201203)；均由中國食品藥品檢定研究院提供。抗瘤丸：160201批， 160202批， 160203批；均由首都醫科大學宣武醫院提供。

1.2 儀器

SHIMADZU LC-2010Aht高效液相色譜儀；WFH-203S三用紫外分析儀(上海精科實業有限公司)；SHIMADZU UV-2450紫外可見分光光度計；LD5-2A低速離心機(北京醫用離心機廠)；CPA225D精密電子天平(十萬分之一，Sartorius)；WT1003H電子分析天平(千分之一，常州市萬泰天平儀器有限公司)；澳浦UB203i顯微鏡(重慶重光實業有限公司)；硅膠G薄層板(煙臺市化學工業研究所，批號：120712)；硅膠G(薄層層析用，青島海洋化工有限公司，批號：0101116)。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 三七鑒別 取本品適量，研細，取約3 g，加甲醇30 mL，加熱回流30分鐘，蒸干濾過液，殘渣加入水10 mL，攪拌至溶解，轉移到分液漏斗，放冷后，20 mL乙醚振搖提取2次，棄去乙醚液，水飽和的正丁醇提取水液2次，每次15 mL，合并正丁醇液，用15 mL水洗滌，蒸干正丁醇液，加甲醇1 mL溶解殘渣，作供試品溶液。另取三七對照藥材0.5 g，加甲醇30 mL，同法制得對照藥材溶液。再取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、及三七皂苷R1對照品，加甲醇，制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。取缺三七的陰性樣品3 g，按供試品溶液的方法制備成陰性對照溶液。吸取供試品、對照藥材溶液各1 μL、對照品溶液4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇∶乙酸乙酯∶水(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴灑10% 硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖1。

2.1.2 何首烏鑒別 取本品適量，研細，取約10 g，加甲醇30 mL，超聲30分鐘，蒸干濾過液，加5%氫氧化鈉溶液8 mL溶解殘渣，過濾，加HCl調節pH值為2，用30 mL乙酸乙酯振搖提取，蒸干乙酸乙酯液，加乙酸乙酯1 mL溶解殘渣，離心，取上清作為供試品溶液。取制何首烏對照藥材0.5 g，同法制得對照藥材溶液。取缺何首烏的陰性樣品10 g，按供試品溶液的方法制備成陰性對照溶液。吸取供試品溶液5 μL、對照藥材溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸 (15∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，置氨熏后，斑點變為紅色。見圖2。

2.1.3 土茯苓鑒別 取本品適量，研細，取約0.5 g，置三角瓶中，加甲醇20 mL，超聲30分鐘，蒸干濾過液，加水5 mL溶解殘渣，通過大孔吸附樹脂柱，用水60 mL洗脫，棄去洗脫液，再用25%乙醇60 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用50%乙醇60 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，加甲醇2 mL溶解殘渣，作為供試品溶液。另取落新婦苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。取缺土茯苓的陰性樣品0.5 g，按供試品的方法制備成陰性對照溶液。吸取供試品3 μL、對照品2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(13∶32∶9)為展開劑，展開，取出，晾干，噴5% 三氯化鋁乙醇溶液，放置5分鐘，紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖3。

2.1.4 沉香鑒別 取本品適量，研細，取約2 g，加石油醚(30～60℃)30 mL，超聲30分鐘，蒸干濾過液，加丙酮2 mL溶解殘渣，作供試品溶液。另取對照藥材粉末0.2 g，同法制得對照藥材溶液。取缺沉香的陰性樣品2 g，按供試品的方法制備成陰性對照溶液。吸取供試品、對照藥材溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶乙醚(10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴10% 硫酸乙醇溶液，晾干，紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖4。

2.2 山楂顯微鑒別

取本品，研細，置顯微鏡下觀察：果皮石細胞淡紫紅色或黃棕色，類圓形，直徑約至120 μm。見圖5。

注：a．人參皂苷Rb1、Rg1與三七皂苷R1；b．抗瘤丸(批號160201)；c．抗瘤丸(批號160202)；d．抗瘤丸(批號160203)；e．三七陰性樣品注：a．何首烏陰樣品性；b．抗瘤丸(批號160201)；c．抗瘤丸(批號160202)；d．抗瘤丸(批號160203)；e．何首烏對照藥材注：a．土茯苓陰性樣品；b．土茯苓對照藥材；c．抗瘤丸(批號160201)；d．落新婦苷；e．抗瘤丸(批號160202)；f．抗瘤丸(批號160203)注：a．沉香對照藥材；b．抗瘤丸(批號160201)；c．抗瘤丸(批號160202)；d．抗瘤丸(批號160203)；e沉香陰性樣品圖1 三七薄層色譜鑒別圖2 何首烏薄層色譜鑒別圖3 土茯苓薄層色譜鑒別圖4 沉香薄層色譜鑒別

圖5 山楂顯微鑒別

2.3 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil C18(6×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液；檢測波長為203 nm，流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

2.3.2 對照品溶液的制備 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含三七皂苷R10.1 mg、人參皂苷Rg10.5 mg的混合溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，水浴回流2小時，放冷，再稱定重量，補足減重，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，先用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，棄去乙醚液，再用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次30 mL，取正丁醇液揮干，殘渣加甲醇使溶解并轉移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 處方中除去三七，按比例稱取其他藥材及輔料同法制成陰性對照溶液。

2.3.5 線性關系考察 三七皂苷R1：精密量取上述對照品溶液0.5、1.0 、2.0 、4.0 、8.0 mL分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成33.31、66.63、133.20、266.51、533.02 μg/mL的對照品溶液，搖勻，分別精密量取10 μL，注入色譜儀，測得峰面積，以對照品進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程：Y=300837.5833X-2769.7782。三七皂苷R1在0.3331 μg～5.3302 μg范圍內呈良好的線性關系。

人參皂苷Rg1：方法同“三七皂苷R1線性關系考察”，配制成78.57、157.14、314.27、628.54、1257.09 μg/mL的對照品溶液，搖勻，分別精密量取10.00 μL，注入色譜儀，測得峰面積，繪制標準曲線。回歸方程：Y=245606.5070X+22209.2712，人參皂苷Rg1在0.7857 μg～12.5709 μg范圍內呈良好的線性關系。2.3.6 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液10 μL，重復進樣6次，按前文“色譜條件”項下的色譜柱條件測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為1.60%、1.47%，表明樣品中間精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 取同一批樣品(20160201)1份，按前文“供試品溶液的制備”項下制備和測定法操作，分別在制備后0、2、4、8、12、24小時進樣。在24小時內測得三七皂苷R1平均峰面積為267778.8，RSD=0.68%；人參皂苷Rg1平均峰面積為1487077.8，RSD=0.58%。表明樣品在24小時內穩定性良好。

2.3.8 重復性試驗 取同一批樣品(20160201)連續進樣6次，按“供試品溶液的制備”項下方法制備樣品溶液，測定峰面積并計算含量。結果顯示：三七皂苷R1平均含量為0.887 mg/g， RSD=1.34%； 人參皂苷Rg1平均含量為5.961 mg/g，RSD=1.99%，表明該方法重復性良好。2.3.9 回收率試驗 取已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量的三七皂苷R1人參皂苷Rg1，按前文“供試品溶液的制備”項下方法制備樣品溶液，在前文色譜條件測定計算回收率。結果見表1、表2。2.3.10 樣品含量測定 根據上述確定的三七含量測定方法，進行了抗瘤丸成品含量測定，按照“2.1.1”項下方法配制供試品溶液，測定三七皂苷R1和人參皂苷Rg1含量。結果見表3。

表3 三批樣品三七皂苷R1和人參皂苷Rg1含量測定

2.4 落新婦苷的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil C18；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸溶液(39∶61)；檢測波長為291 nm，流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

2.4.2 對照品溶液的制備 落新婦苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL含落新婦苷40 μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲30分鐘，放冷，再稱定重量，補足減重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。2.4.4 陰性對照溶液的制備 處方中除去土茯苓，按比例稱取其它藥材及輔料同法制成陰性對照溶液。

2.4.5 線性關系考察 精密吸取上述對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL分別置10 mL量瓶中，分別用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成14.78、29.57、59.14、118.27、236.54 μg/mL的對照品溶液，搖勻，分別精密量取10 μL，注入色譜儀，測得峰面積，以對照品進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程：Y=2278593.7544X-3132.1353。落新婦苷在0.1478 μg～2.3654 μg范圍內呈良好的線性關系。

表1 三七皂苷R1加樣回收率試驗結果

表2 人參皂苷Rg1加樣回收率試驗結果

表4 落新婦苷加樣回收率試驗結果

2.4.6 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液10 μL，重復進樣6次，按前文“供試品溶液的制備”項下供試品溶液的制備和測定法操作，測定落新婦苷的RSD=0.58%。表明樣品重復性良好。

2.4.7 穩定性試驗 取同一批樣品(20160201)連續進樣6次，按前文“供試品溶液的制備”項下制備和測定法操作，分別在制備后0、2、4、8、12、24小時進樣。在24小時內測得落新婦苷平均峰面積為933753.5，RSD=0.14%，表明樣品在24小時內穩定性良好。

2.4.8 重復性試驗 取同一批樣品(20160201)連續進樣6次，按前文方法制備樣品溶液和測定法項下操作，測定落新婦苷的平均含量為1.324 mg/g，RSD=0.69%，表明樣品重復性良好。

2.4.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取落新婦苷對照品11.30mg，按前文方法制備樣品溶液，在前文色譜條件測定計算回收率。結果見表4。

2.4.10 樣品含量測定 根據上述確定的土茯苓含量測定方法，進行了抗瘤丸成品含量測定，按照前文中的描述配制方法配制供試品溶液，測定落新婦苷含量。結果見表5。

表5 三批樣品落新婦苷含量測定

3 討論

本研究對抗瘤丸中的君藥進行定性、定量鑒別；對臣藥及貴重藥進行定性鑒別，完善了抗瘤丸質量控制標準。三七薄層色譜鑒別中，以《中華人民共和國藥典》2015版[3]的展開劑三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(15∶40∶22∶10)展開，發現斑點模糊，分離度不佳，故以正丁醇∶乙酸乙酯∶水(4∶1∶5)為上層溶液，斑點清晰，分離度好[4-5]。沉香薄層色譜鑒別中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。但供試品溶液比較黏稠，超過2 μL就很難點樣，且斑點不太圓整。經文獻檢索[6]，噴以10%硫酸乙醇溶液，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視，在Rf值0.5～0.7處有斑點顯色清晰，效果較直接檢視更好。人參皂苷Rb1總平均回收率僅為78.11%，且數據很難穩定。經文獻檢索[1]，人參皂苷Rb1在酸性和堿性條件下均不穩定，其水溶液在加熱下也不穩定。供試品在制備過程中，氨試液洗滌后，正丁醇液呈堿性，并加熱蒸干，可能會造成人參皂苷Rb1降解，但此為供試品制備必須步驟，無法略去， 故綜合考慮，放棄人參皂苷Rb1，僅將人參皂苷Rg1和三七皂苷R1列入正文。綜上所述，本文所建標準可用于抗瘤丸的質量控制。

[1] 於堃，宋玨嫻，劉倩，等.高利治療腦膠質瘤經驗[J]. 北京中醫藥，2008，27(10)：785-786.

[2] 莊偉，林曉蘭，姜德春，等.中藥KLW-1治療惡性神經膠質瘤的臨床研究[J].中國新藥雜志，2011，20(19):1894-1897.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2015:12.

[4] 岑艷華，蔡麗云，陳華．活血祛瘀片中三七、大黃的薄層色譜鑒別[J].臨床醫學工程，2011，18(6)：915-916．

[5] 李霄，萬丹丹，郭洛宏．薄層色譜對復方丹參片中三七皂苷R1和人參皂苷Re的鑒別[J]．中成藥，2009，31 (9)：1470-1472．

[6] 王曄，高沂.八味三香散質量標準中鑒別和含量測定方法的研究[J]．中國藥學雜志，2007，42(3)：232-233.

(本文編輯： 韓虹娟)

Quality standard forKangLiuWan

FENGYingnan,CHENFei,ZHANGPeng,etal.

DepartmentofPharmacyXuanwu，HospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China

LINXiaolan，E-mail：xllin83@163.com

Objective To establish the quality standards ofKangLiuWan(KLW), to improve its quality. Methods Thin layer chromatography(TLC) was used to qualitative identification of Notoginseng Radix et Rhizoma、Smilacis Glabrae Rhizoma、Aquilariae Lignum Resinatum、Polygoni Multiflori Radix Praeparata, and microscopic identification method was used to qualitative identification of Crataegi Fructus; HPLC was applied to quantitatively determining the contents of Notoginseng Radix et Rhizoma and Smilacis Glabrae Rhizoma.Results The TLC spots were clear and well-separated；Notoginsenoside R1, ginsenosides Rg1,and Chinese astilbin showed good relationships within the ranges of 0.3331～5.3302 μg (r=0.9999)、0.7857～12.5709 μg (r=0.9999)、0.1478～2.3654 μg (r=1.0000)，the average recovery were 98.70%、99.08%、98.76%，respectively.Conclusion The method is simple，sensitive, accurate and reproducible，and can be used as the quality control standard ofKLW.

KLW； Quality standards； HPLC； TLC

北京市科委“十病十藥”專項(Z141100002214016)

100053 北京，首都醫科大學宣武醫院藥劑科

馮英楠(1988- )，女，碩士，藥師。研究方向：中藥藥效與作用機制研究。E-mail：fengyingnan88@163.com

林曉蘭(1963- )，女，本科，主任藥師。研究方向：中藥制劑研發與醫院藥學管理。E-mail：xllin83@163.com

R286

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.05.004

2017-02-16)