磷酸肌酸鈉對阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護作用及其機制研究

薛梅苓，杜小波

(1.兵器工業五二一醫院藥劑科，陜西西安710065；2.西安市華山中心醫院藥劑科，陜西西安710043)

磷酸肌酸鈉對阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護作用及其機制研究

薛梅苓1，杜小波2

(1.兵器工業五二一醫院藥劑科，陜西西安710065；2.西安市華山中心醫院藥劑科，陜西西安710043)

目的觀察磷酸肌酸鈉(SP)對阿霉素(ADM)所致大鼠心肌損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。方法應用隨機數字表法將30只雄性SD大鼠分為空白對照組(n=10)、阿霉素組(ADR組，n=10)和磷酸肌酸鈉組(SP組，n=10)。對照組腹腔注射生理鹽水每日一次，ADR組隔日一次腹腔注射阿霉素建立阿霉素心肌損傷模型，SP組隔日一次腹腔注射磷酸肌酸鈉(200 mg/kg)，30 min后注射阿霉素。實驗結束后應用羥胺法測定各組大鼠超氧化物歧化酶(SOD)，應用硫代巴比妥法測定各組大鼠丙二醛(MDA)，應用ELISA法測定各組心肌酶譜[乳酸脫氫酶(LDH)、心肌天冬氨酸轉氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)]水平。結果ADR組和SP組大鼠血清SOD水平分別為(47.11±9.64)μg/L、(80.9±17.98)μg/L，顯著低于空白對照組的(89.12±18.23)μg/L，而MDA水平分別為(7.12±1.46)μg/L、(2.3±0.47)μg/L，顯著高于空白對照組的(1.66±0.34)μg/L。SP組大鼠血清SOD水平高于ADR組，MDA水平低于ADR組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。ADR組和SP組大鼠血清心肌酶譜(LDH、AST、CK、CK-MB)水平分別為(1 307.79±267.50)U/L、(476.19±97.40)U/L、(961.29±196.63)U/L、(1 353.33±276.82)U/L和(713.79±146.02)U/L、(164.32±33.61)U/L、(387.09±79.18)U/L、(565.29±115.63)U/L，均明顯高于空白對照組的(691.02±141.35)U/L、(130.68±26.73)U/L、(327.69±67.03)U/L、(487.08±99.63)U/L，而SP組大鼠的上述血清心肌酶譜水平均高于ADR組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論磷酸肌酸鈉干預可以減輕大鼠阿霉素心肌損傷，其保護作用的實現，可能是由于清除了氧自由基，增強了SOD的活性，減輕脂質過氧化反應，并修復了心肌細胞損傷。

SD大鼠；磷酸肌酸鈉；阿霉素；心肌損傷；氧自由基

阿霉素(adriamycin，ADM)是一種高效、廣譜的抗腫瘤的蒽環類抗癌藥物之一，對多種實體腫瘤及血液系統惡性腫瘤均有良好的臨床效果，但是阿霉素具有明顯的劑量依賴性，對心臟易產生毒副作用，容易對心臟產生急性、慢性及遲發性毒性，從而限制了阿霉素的臨床使用[1]。常規藥物治療阿霉素心臟毒性效果不理想，預后很差。目前有關阿霉素心臟毒性的發生機制還不清楚，但有研究報道指出，阿霉素所致的心肌損傷與其半醌自由基介導的氧自由基損傷有一定關系[2]。磷酸肌酸鈉(sodium phosphocreatine，SP)是心肌的化學儲備能量，目前，在臨床上已作為一項重要的心肌保護措施廣泛得以應用。本實驗通過建立大鼠ADM心肌病模型，并給予磷酸肌酸鈉干預治療，研究磷酸肌酸鈉對阿霉素心肌損傷的保護作用，并對其可能的保護機制進行深入探討，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物選取與分組選取成年健康雄性SD大鼠30只，體質量240～280 g，SPF級(由陜西省動物實驗中心提供)，按清潔級大鼠的要求標準飼養，每天保持12 h照明，自由進食、飲水。動物適應性飼養5 d后稱重，應用隨機數字表法將其分為空白對照組、阿霉素組(ADR組)和磷酸肌酸鈉組(SP組)，每組各10只。

1.2 大鼠ADM心肌病模型的建立空白對照組(對照組)：每3 d腹腔注射生理鹽水(NS)10 mL/kg，共10次；阿霉素組(ADR組)和磷酸肌酸鈉組(SP組)：ADR組每3 d腹腔注射同容量的ADR 2 mg/kg，共10次，累積劑量為20 mg/kg，SP組在第6次腹腔注射阿霉素時，同時開始注射磷酸肌酸鈉200 mg·kg-1·d-1，共12 d[3-4]。

1.3 血清指標檢測實驗結束后，經心臟抽血迅速處死動物，取3 mL血液標本量注入離心管，靜置30 min后，經低溫3 000 r/min離心15 min分取血清，并置于-20℃冰箱保存備用。采用羥胺法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用硫代巴比妥法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。采用全自動生化分析儀測定心肌酶譜，包括心肌天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酸激酶同功酶(creatine kinase isozyme，CK-MB)、磷酸肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，所有操作均參照試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法應用SPSS18.0軟件包進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠血清SOD、MDA水平比較ADR組和SP組大鼠血清SOD水平明顯低于空白對照組，而MDA水平明顯高于空白對照組，SP組大鼠血清SOD水平高于ADR組，MDA水平低于ADR組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠血清SOD及MDA水平比較()

表1 三組大鼠血清SOD及MDA水平比較()

空白對照組ADR組SP組F值P值10 10 10 89.12±18.23 47.11±9.64a80.9±17.98ab22.912 0.000 1.66±0.34 7.12±1.46a2.3±0.47ab108.29 0.000

2.2 三組大鼠血清心肌酶譜水平比較ADR組和SP組大鼠血清心肌酶譜水平均明顯高于空白對照組，而SP組大鼠血清心肌酶譜水平均高于ADR組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與ADR組比較，bP＜0.05。

3 討論

目前有關阿霉素引起心肌損傷的機制尚不清楚，有研究認為，阿霉素引起心肌損害可能與氧化應激、細胞凋亡、鈣超載、膜分子的抑制、腎上腺功能異常、線粒體損傷、阿霉素繼發性代謝物等有關[5]。對阿霉素引起心肌損傷的機制目前較為公認的是自由基學說。該學說指出，阿霉素與心肌組織的親和性明顯高于其他組織，容易進入心肌細胞，并被還原為半醌，經過氧化反應后生成很多自由基，自由基對抗腫瘤作用并不明顯，但卻能夠攻擊心肌細胞線粒體，損害其形態結構、損傷原發性細胞[6]。有研究表明，阿霉素的化學結構容易產生大量的自由基和引起與細胞損傷有關的氧化反應，從而推測可以導致心肌結構的各種改變，最終發生阿霉素心臟毒性[7]。因此，研究阿霉素心肌損傷的相關機制，尋求減輕阿霉素心臟毒性的藥物有著重要的現實意義。

磷酸肌酸是維持心臟細胞功能的重要能源物質，在能量代謝過程中有著儲存和轉運ATP的雙重作用。磷酸肌酸鈉是一種為機體提供能量的供給劑，在心外手術心臟停搏液被廣泛應用，能夠保護心肌缺血狀態下的心肌代謝異常等。其成分主要為磷酸肌酸二鈉鹽四水合物，再進入機體后能夠迅速分解，為機體提供能量，可以快速補充阿霉素引起的心肌損傷組織能量合成急劇下降，對心肌毒性物質的大量產生進行有效的抑制，能夠防止細胞內酶活性的改變，并維持跨膜離子梯度的能量平衡，同時其對保持細胞內環境穩定和減輕細胞凋零具有重要意義[8-9]。

超氧化物歧化酶是生物機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，SOD活力的高低能夠間接反映動物機體清除自由基的能力；丙二醛作為細胞膜脂質過氧化的最終分解產物，MDA含量的多少能夠反映機體細胞受自由基攻擊損傷程度[10]。相關報道提示，大鼠阿霉素心肌病能夠使氧化應激發生損傷，導致SOD活性降低及脂質過氧化物MDA增高[6]。本文研究結果表明，ADR組大鼠血清SOD水平顯著低于空白對照組，MDA水平顯著高于空白對照組。這說明阿霉素能夠引起心肌組織SOD活性降低，并引起心肌細胞清除氧自由基的能力得以下降，最終導致膜脂質過氧化代謝產物MDA增高，與該文獻報道的結果一致。而經SP干預后，SP組大鼠血清SOD水平顯著上升，MDA水平顯著降低。提示對阿霉素心肌損傷給予SP干預治療，SP通過一些酶系抑制脂質過氧化作用的啟動和終止脂質過氧化的發展，來減輕氧自由基對生物膜的氧化性損害，到達降低心肌組織脂質過氧化水平的目的。

心肌酶譜LDH、AST、CK、CK-MB是反應心肌細胞損傷較為敏感的指標。LDH作為糖酵解過程中的一種重要酶，在組織細胞損傷時，其活力會增加，顧其活力的變化能夠反映心肌損傷的程度[11]。CTnⅠ是心肌收縮的調節蛋白，它僅存于心房肌和心室肌中，使cTnI成為心肌特異性抗原和心肌損傷的特異性標志物[12]。在心肌細胞完整的情況下cTnI幾乎不能透過細胞膜進入血液循環系統。當心肌細胞因缺血或缺氧等因素發生變性、壞死時，cTnI會發生外漏，其可以通過受損的細胞膜彌散進入細胞間質，從而進入血管導致血清cTnI的升高。CK-MB均是一種細胞內酶，在心肌細胞內含量高。當機體處理正常狀態時，CK-MB大多存在細胞內，而血中的含量較低。但當心肌缺血或者再灌注損傷時，由于能量供給的障礙引起膜泵功能障礙，從而導致生物膜離子轉運障礙和膜通透性升高，此時大量的氧自由基產生，經脂質過氧化反應，加速了膜結構破壞和通透性升高。細胞膜通透性升高能夠引起細胞內的CK、CK-MB大量入血[13-14]。因此，CK和CK-MB能夠特異性地反映心肌細胞受損的程度，當血清中CK與CK-MB升高時，說明心肌受損嚴重。本研究結果顯示，ADR組大鼠血清LDH、AST、CK、CK-MB水平顯著高于空白對照組，說明阿霉素可以引起心肌細胞受損；經SP干預后，SP組大鼠血清心肌酶譜水平顯著降低，與ADR組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，表明SP對阿霉素引起心肌細胞損傷有修復和保護作用。

綜上所述，磷酸肌酸鈉干預可以減輕大鼠阿霉素心肌損傷，其主要機制可能是由于清除了氧自由基，增強了SOD的活性，減輕脂質過氧化反應，對心肌細胞損傷進行修復和保護，從而達到減輕大鼠阿霉素心肌損傷的目的。

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Experimental study of sodium phosphocreatine to protect against adriamycin-induced cardiotoxicity injury in rats and its mechanism.

XUE Mei-ling1,DU Xiao-bo2.1.Department of Pharmacy,the 521 Hospital of Weapon Industry,Xi'an 710065,Shaanxi,CHINA;2.Department of Pharmacy,Xi'an Huashan Central Hospital,Xi'an 710043,Shaanxi, CHINA

ObjectiveTo investigate the effect and possible mechanisms of sodium phosphocreatine(SP)to protect against adriamycin-induced cardiotoxicity injury in rats.MethodsThirty cases of male SD rats were randomly divided into blank control group(n=10,intraperitoneal injection of saline once a day),adriamycin group(n=10,intraperitoneal injection of doxorubicin every other day to establish adriamycin myocardial injury model)and SP group(n=10,intraperitoneal injection of SP every other day 200 mg/kg 30 min after the injection of doxorubicin).At the end of the experiment,the levels of superoxide dismutase(SOD)in each group were measured by hydroxylamine method.Malondialdehyde(MDA)was determined by thiobarbital method.The myocardial enzymes such as lactate dehydrogenase(LDH), asparate aminotransferase(AST),creatine kinase(CK),creatine kinase-MB isoenzyme(CK-MB)levels were measured. ResultsThe levels of serum SOD in ADR group and SP group were(47.11±9.64)μg/L,(80.9±17.98)μg/L,significantly lower than(89.12±18.23)μg/L in control group(P＜0.05).The levels of serum MDA in ADR group and SP group were (7.12±1.46)μg/L,(2.3±0.47)μg/L,significantly higher than(1.66±0.34)μg/L in control group(P＜0.05).The level of serum SOD in SP group was higher than that in ADR group,and the level of MDA in SP group was significantly lower than that in ADR group(P＜0.05).The levels of serum myocardial enzymes(LDH,AST,CK,CK-MB)were(1 307.79± 267.50),(476.19±97.40),(961.29±196.63)and(1 353.33±276.82)in ADR group and(713.79±146.02),(164.32±33.61), (387.09±79.18),(565.29±115.63)in SP group,which were significantly higher than(691.02±141.35),(130.68±26.73), (327.69±67.03),(487.08±99.63)in the control group(P＜0.05).The levels of serum myocardial enzymes(LDH,AST, CK,CK-MB)in SP group were significantly higher than those in ADR group(P＜0.05).ConclusionSP has protective effect on adriamycin-induced cardiotoxicity injury,maybe through scavenging oxygen free radicals,enhancing the SOD activity,reducing lipid peroxidation and repairing myocardial cell damage.

SD rats;Sodium phosphocreatine;Adriamycin;Myocardial injury;Oxygen free radicals

R-332

A

1003—6350（2017）07—1033—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.001

2016-10-26)

杜小波。E-mail：3128109520@qq.com