水稻OsDHHC13基因參與氧化脅迫響應的初步研究

劉選明?k王文文?k楊遠柱?k夏妙林?k李夏?k左棟梁?k林建中

摘 要：DHHC型鋅指蛋白參與細胞內蛋白質的棕櫚酰化修飾，對細胞和個體的生長發育起著重要的調控作用.OsDHHC13是典型的DHHC型鋅指蛋白基因.生物信息學分析發現，OsDHHC13的啟動子區域含有脅迫及光響應元件，而且其編碼蛋白是具有4個跨膜結構域的典型膜蛋白.對OsDHHC13過表達株系進行H2O2的氧化脅迫處理發現，過表達株系幼苗的根顯著長于野生型，說明OsDHHC13能解除H2O2對根生長的抑制，提高了抗氧化脅迫的能力.隨后H2O2含量測定發現，OsDHHC13過表達株系幼苗根部的H2O2含量顯著低于野生型.進一步的qRTPCR分析發現，與清除H2O2相關的酶基因的轉錄水平在過表達株系中顯著升高，說明OsDHHC13能促進清除H2O2的相關酶基因的表達，調節內源性H2O2的動態平衡.總之，本研究結果初步證明鋅指蛋白基因OsDHHC13正調控水稻的抗氧化脅迫能力.

關鍵詞： OsDHHC13基因；H2O2含量；根長；鋅指蛋白

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A

Abstract：DHHCtype zinc finger proteins are involved in the palmitoylated modification of intracellular proteins and play important roles in the growth and development of cells and individuals. OsDHHC13 is a typical DHHCtype zinc finger gene. Bioinformatics analysis showed that the OsDHHC13 promoter region contains some stress and light response elements， and its encoded protein is a typical membrane protein with four transmembrane domains. When the OsDHHC13 overexpressing lines were suffered from oxidative stress with H2O2， the roots of overexpressing seedlings were significantly longer than those of wildtype， indicating that OsDHHC13 can remove the inhibition of root growth by H2O2 and improve the ability of resistance to oxidative stress. Subsequently， analysis of H2O2 contents found that the H2O2 contents in the roots of overexpressing seedlings were markedly lower than that in wild type. qRTPCR analysis further revealed that the transcriptional levels of enzyme genes related to H2O2 elimination increased significantly， suggesting that OsDHHC13 can promote the expression of enzyme genes related to H2O2 elimination and regulate the homeostasis of endogenous H2O2 in plants. In a whole， present study preliminarily proved that the zinc finger protein gene OsDHHC13 positively regulates the ability of resistance to oxidative stress.

Key words：OsDHHC13 gene；H2O2 content；root length；zinc finger protein

DHHC型鋅指蛋白是一類富含DHHC （AspHisHisCys） 型鋅指結構域的蛋白質.DHHC型鋅指結構域是一種富含半胱氨酸高度保守的鋅指結構域，是一種常見的DNA結合結構單元.DHHC型鋅指蛋白一般具有的通用結構，至少存在4段跨膜結構域、DHHCCRD結構域以及DPG功能元件[1].DHHC型鋅指蛋白的主要功能是棕櫚酰化其下游蛋白，從而影響其下游蛋白的定位、轉運，最終影響其生理功能[2].DHHC型鋅指蛋白的棕櫚酰化是生物體一種常見的修飾方式，它包括3種方式[3-4]，最主要是PAT介導的硫酰基轉移，其次是硫酰基輔酶A介導的轉移和以硫酰基輔酶A為輔酶的蛋白質介導轉移.

以往對DHHC型鋅指蛋白的研究主要集中在動物和酵母的研究.Pedram等[5]發現動物體內DHHC7與DHHC21蛋白能夠作為新靶點選擇性地抑制膜性類固醇受體定位并影響其功能.Fukata等[6]在人和鼠基因庫篩選時，篩選出23個能夠編碼不同DHHC型蛋白的DHHC基因.在植物中DHHC基因的功能研究相對甚少，目前只有OsDHHC1，AtTIP1（TIP GROWTH DEFECTIVE1）和At5g04270這3個基因的功能是研究的比較清楚的.研究發現OsDHHC1基因主要與水稻株型構建及產量相關[7]，AtTIP1主要影響擬南芥的根毛的生長[2].

活性氧ROS（Reactive oxygen species）是植物體內普遍存在的一種代謝產物，主要包括超氧根離子、過氧化氫和羥自由基等[8-10].在正常情況下細胞內ROS的產生與清除處于動態平衡中，ROS濃度相對比較低.但是當植物受到非生物脅迫時，植物體內這種動態平衡就會受到破壞，導致細胞內積累過多的ROS[11-12]，從而影響植物的各種生理功能.其中H2O2是研究最多的ROS，研究發現過量的H2O2會對植物造成損傷，而適量的H2O2可作為細胞內一種信號分子，參與并調控植物的生長發育和對各種生物和非生物刺激的應答反應[13].近年的研究揭示， H2O2通過在信號傳導途徑的上游抑制或激活相關激酶的活性來啟動或增強信號的作用從而影響植物的氧化脅迫反應、細胞凋亡、氣孔的關閉、發育以及組織的形態建成[10，14-16].Ivanchenko等[17]發現H2O2能夠影響西紅柿根的發育，在IAA或H2O2處理下會導致dgt11突變體根部內源性H2O2增加，從而抑制西紅柿根的發育.Zhang等[18]發現H2O2可作為信號分子介導OsRACK1基因調控水稻種子的萌發.

在本研究中，我們克隆了OsDHHC13基因，構建了該基因過表達的轉基因株系，并對OsDHHC13過表達株系的H2O2脅迫響應進行了初步研究，發現鋅指蛋白OsDHHC13正調控水稻的抗氧化脅迫響應.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

粳稻品種日本晴用于OsDHHC13基因的克隆和組織特異性表達分析.粳稻品種Kitaake用于作為轉化受體，其轉基因植株用于后續的分子及表型分析.

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析

OsDHHC13基因全長CDS序列與氨基酸序列通過TIGR（http：//tigrblast.tigr.org/tgi， RiceGenome Annotation Project）和NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov， National Center for Biotechnology information）數據庫獲得.利用植物啟動子順式作用元件分析網站plantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/ plantcare/html/） 對OsDHHC13基因啟動子進行分析.采用丹麥科技大學生物序列分析中心（CBS）的蛋白跨膜結構域預測程序TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 進行跨膜結構域預測.

1.2.2 載體構建與水稻轉化

利用Premier 5.0軟件設計克隆正向引物5CCCAAGCTTATGCTCTTCGTCATATGTGG TG3（下劃線為HindⅢ酶切位點） 和反向引物5CGGGATCCAAGAAGTTTTGAAC TCGAAT TGTC3 （下劃線為BamHⅠ酶切位點），然后以日本晴的cDNA為模板，用prime STAR 高保真酶（TaKaRa），通過PCR反應獲得目的片段.PCR反應條件為：98 ℃，5 min；98℃，10 s；56 ℃，15 s；72 ℃，1 min ；共35個循環.然后將PCR產物連接至pGEMT Easy Vector （Promega），送至鉑尚生物技術公司測序.最后將測序正確的OsDHHC13的CDS片段通過酶切連接到pHB載體[19].在pHBOsDHHC13載體中，目標基因OsDHHC13由2×35S啟動子驅動表達，植物中的篩選標記基因為潮霉素抗性基因Hpt （主要用于轉化過程的抗性愈傷組織篩選）和除草劑Basta抗性基因bar （主要用于苗期篩選）.

根據林建中等[20-21]的水稻轉化方法，將重組的質粒pHBOsDHHC13經電擊法轉入農桿菌，通過農桿菌侵染水稻粳稻品種Kitaake的愈傷組織以獲取過表達轉基因株系.

1.2.3 轉基因水稻的鑒定及實時定量PCR（qRTPCR）分析

采用經典的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[ 20]從再生的轉基因水稻株系中提取DNA.然后以特異性引物（F： 5ATCTCGTGCTTTCAGCTTCG3； R： 5ACATCGCCTCGCTCCAGT3）進行PCR鑒定TDNA區域的潮霉素抗性基因Hpt.同時，采用Trizol試劑盒（Invitrogen）提取各轉基因株系葉片的總RNA，然后再利用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（TaKaRa）逆轉錄成cDNA， 并以此為模板進行qRTPCR鑒定OsDHHC13的轉錄水平.PCR反應程序為：95 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；45個循環.重復3次，以持家基因OsActin1為內參，然后使用Mx3000P軟件對相關基因的相對表達水平進行分析（qRTPCR引物見表1）.未轉化的Kitaake野生型（WT）作為對照.

為了檢測OsDHHC13的表達對H2O2的響應，將野生型Kitaake幼苗水培培養至三葉期，然后用5 mmol/L的H2O2分別處理幼苗1 h， 3 h， 6 h， 9 h， 12 h和24 h，選取水稻幼苗根部用于提取總RNA并逆轉錄為cDNA.采用qRTPCR鑒定OsDHHC13在H2O2處理的不同時間點的轉錄水平.另外，提取營養生長期（20 d的幼苗）和生殖生長期（抽穗期）野生型的各組織器官的總RNA并逆轉錄為cDNA， 然后采用qRTPCR分析OsDHHC13在水稻不同生長時期和不同組織器官中的轉錄水平.

為了檢測轉基因株系中與H2O2清除相關的基因OsCATb，OsSOD1，OsAPX1和OsAPX2的轉錄水平[14-17]，將轉基因株系和野生型幼苗水培培養至三葉期，然后用5 mmol/L的H2O2處理幼苗12 h，然后提取幼苗總RNA并逆轉錄為cDNA.采用qRTPCR鑒定4個基因的轉錄水平（qRTPCR引物見表1）.

1.2.4 水稻幼苗的處理及根長的測定

挑選OsDHHC13轉基因株系及野生型的飽滿種子，用10% NaClO消毒30 min，再用去離子水（ddH2O）漂洗4～5次，然后放置于室溫吸脹處理48 h，接著轉移至28 ℃恒溫培養箱催芽48 h.待種子露白后，再轉入添加和未添加H2O2（5 mmol/L）的1/2 MS培養液的試管里.種子用棉花作為支撐讓其位于試管上部，置于恒溫培養室（28 ℃，光照16 h/黑暗8 h）培養10 d.然后觀察幼苗表型，并測量和統計根長.

1.2.5 水稻根部H2O2含量的測定

將水培至三葉期的OsDHHC13轉基因株系及野生型幼苗用濃度為5 mmol /L H2O2處理5 d，然后用碧云天生物技術公司的H2O2檢測試劑盒提取并測定水稻根部H2O2含量.

2 結 果

2.1 OsDHHC13基因啟動子調控元件分析

通過相關網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的sequence viewer工具找到OsDHHC13基因起始密碼子上游1 500 bp的片段，然后把這段核苷酸序列輸入植物專用的啟動子分析網站在線分析工具中，對OsDHHC13基因上游啟動子進行預測分析（如圖1所示）.結果發現，OsDHHC13基因啟動子存在大量的AEbox，Box 4，Gbox和Ibox等光響應元件，同時也存在一些與激素相關的AuxRRcore和Pbox等元件.有趣的是，在啟動子區域還發現了TCrich repeats和 MBS等與抗旱以及脅迫響應密切相關的元件.該分析結果表明，OsDHHC13基因可能被光信號、激素以及其他非生物脅迫誘導表達，并且其編碼蛋白有可能參與植物的光信號轉導、激素轉導以及非生物脅迫響應.

2.2 OsDHHC13蛋白的跨膜結構域預測

將OsDHHC13的氨基酸全長序列輸入跨膜結構域預測程序TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/），結果顯示OsDHHC13蛋白可能存在4個跨膜結構域（圖2）.在跨膜結構域的預測結果中，其跨膜分值越高，則表明該段序列跨膜的可能性越大.在OsDHHC13可能存在的4個跨膜結構域中，3個分值較高，而另1個分值則稍低，但是其分值仍大于0.8.因此，該結果表明，OsDHHC13可能是一個具有4個跨膜結構域的典型膜蛋白.（圖中斷裂雙線表示該段氨基酸序列處于質膜的胞外側；斷裂單線表示該段氨基酸序列處于質膜的胞質側； 連續線表示該段氨基酸序列為跨膜結構域）

2.3 OsDHHC13基因的克隆與轉基因植株的鑒定

通過NCBI以及TIGR等數據庫查找到OsDHHC13的基因組序列及其CDS序列，利用特異性的克隆引物，從水稻品種日本晴的cDNA中克隆了OsDHHC13的CDS序列（如圖3（a）所示）.通過酶切連接的方式將OsDHHC13連接至終載體pHB.最后轉入農桿菌浸染水稻愈傷組織，再經組織培養及田間栽培后，共收獲8個獨立的OsDHHC13過表達轉基因株系的種子.隨后，對T1代幼苗分別進行了DNA與RNA水平的鑒定（如圖3（b）（c）所示）.從圖3（b）可以看出，8個轉基因株系均能檢測到潮霉素抗性基因hpt，說明TDNA已經成功整合到轉基因株系的基因組中.OsDHHC13的轉錄水平檢測發現，5個株系中的轉錄水平顯著高于野生型（WT； 圖3（c）），說明OsDHHC13已成功過表達于轉基因株系.隨后我們選取了3個過表達株系：35S：：OsDHHC139，35S：：OsDHHC1312和35S：：OsDHHC1319的T2代純合子用于后續的表型鑒定.

2.4 OsDHHC13基因的時空表達分析

基因的時空表達模式可為預測和研究其生物學功能提供參考依據.于是，我們采用qRTPCR方法分析了營養生長期和生殖生長期OsDHHC13在水稻不同組織器官中的相對表達量（如圖4所示）.結果發現，在營養生長的苗期OsDHHC13在根、莖和葉中均有表達，尤其在葉片中的表達量相對較高，而根中的相對較低（如圖4（a）所示）.在生殖生長的抽穗期，OsDHHC13在各組織器官中均有表達，其中葉片中的表達量最高，根中的表達量僅次于葉片，而節間的表達量最低（如圖4（b）所示）.

2.5 OsDHHC13轉基因株系對H2O2的響應

啟動子分析發現，OsDHHC13基因的啟動子存在TCrich repeats和 MBS等與抗旱以及脅迫響應密切相關的元件（如圖1所示）， 說明該基因可能參與了非生物脅迫響應.為了驗證該假設，我們用5 mmol/L的H2O2處理剛發芽的OsDHHC13轉基因株系種子10 d，然后觀察表型并統計根長.結果發現，在正常水培條件（未含H2O2）下轉基因株系的根長與野生型沒有差別（如圖5（a）（c）所示），而在H2O2處理條件下轉基因株系的根顯著長于野生型（如圖5（b）（d）所示）.該結果說明，OsDHHC13轉基因植株提高了對H2O2脅迫的抗性，鋅指蛋白OsDHHC13可能正調控植物的抗氧化脅迫.隨后，我們檢測了H2O2對野生型幼苗根部OsDHHC13轉錄水平的影響，發現OsDHHC13的轉錄水平隨著H2O2處理時間的延長而升高，在12 h時達到最大值，隨后稍有下降（如圖5（e）所示）.該結果說明H2O2能夠誘導OsDHHC13基因的表達，意味著OsDHHC13基因可能參與脅迫條件下水稻根部生長和發育的調控.

2.6 根部內源性H2O2含量變化及相關基因測定

為了進一步探究在外源性H2O2處理下OsDHHC13基因如何影響水稻幼苗根部生長與發育，我們進一步對幼苗根部內源性H2O2含量進行了測定.如圖6（a）所示，當OsDHHC13轉基因株系幼苗經5 mmol /L H2O2處理5 d后，其水稻根部H2O2含量比野生型顯著降低，而在未經H2O2處理的幼苗根中轉基因株系與野生型間沒有明顯的差別.該結果說明，OsDHHC13可能正調控氧化脅迫條件下體內H2O2的降解，從而解除氧化脅迫對植株的傷害.

為了進一步驗證以上推測，我們檢測了5 mmol/L H2O2處理12 h的轉基因株系幼苗中與H2O2清除相關的酶基因OsCATB，OsSOD1，OsAPX1和OsAPX2等的轉錄水平（如圖6所示）.結果發現，在正常條件下OsCATB，OsSOD1，OsAPX1和OsAPX2等4個酶基因的轉錄水平在轉基因株系和野生型（WT）間沒有明顯差異，但是在H2O2處理條件下轉基因株系中4個酶基因的轉錄水平顯著高于野生型（如圖6（b）～（e）所示）.該結果表明，在氧化脅迫條件下OsDHHC13確實能促進清除H2O2的相關酶基因表達，從而調節內源性H2O2含量的動態平衡，最終解除H2O2對根的生長與發育的抑制.

3 討 論

DHHC蛋白是一類典型的膜蛋白，一般具有多段跨膜結構域，包含了DHHCCRD結構域.它的主要功能是棕櫚酰化其下游蛋白，從而影響其轉運與定位，最終調控植物的各種生理功能[2].通過生物信息學的預測發現，OsDHHC13蛋白具有4段跨膜結構域（如圖1所示），并且發現其啟動子含有多個與光調控、激素和脅迫響應相關的元件（如圖2所示），為研究該基因與激素、光調控相關功能提供了重要線索.

通過對基因在植物不同組織器官中的表達分析，可以對該基因的功能進行預測[22].我們對OsDHHC13在水稻不同時期和不同組織器官的表達特異性進行了分析，發現OsDHHC13主要在水稻葉片、根以及莖表達（如圖4所示），暗示該基因可能參與水稻根、莖和葉的生長與發育調控.隨后，通過H2O2處理發現轉基因株系的根要顯著長于野生型，相反正常條件下的根長則沒有明顯變化，說明該基因參與逆境下根的生長與發育調控.同時，我們發現轉基因株系與野生型間在葉片形態及株高等方面沒有明顯變化（結果未列出），因此OsDHHC13在葉和莖中的功能還有待進一步研究.

ROS的穩態在植物中發揮重要功能[13].H2O2是最主要的一種ROS，在植物中參與信號轉導、植物的生長發育以及非生物脅迫響應的作用[22-23].H2O2在植物抗病反應中的作用已經得到了廣泛的研究， 而在非生物脅迫條件下，同樣扮演了關鍵的調控作用， 參與多種生理生化過程， 包括光合作用、光呼吸、氣孔運動與細胞程序性死亡等.前人已有活性氧代謝以及H2O2信號轉導方面的綜述報道[24].Ivanchenko等[17]發現H2O2積累能夠抑制西紅柿根部的生長與發育，但具體機制尚不清楚.本研究通過H2O2處理野生型與轉基因幼苗，發現轉基因株系根顯著長于野生型（如圖5所示）.通過測定根部H2O2含量以及與H2O2清除相關的酶基因表達分析，過表達株系H2O2含量以及相關基因表達量顯著高于野生型（如圖6所示）.這些結果說明，在氧化脅迫等逆境下OsDHHC13確實能促進清除H2O2的相關酶基因表達，從而解除H2O2對根的生長與發育的抑制.至于作為鋅指蛋白的OsDHHC13如何棕櫚酰化其下游蛋白，最終如何調控水稻根部H2O2的動態平衡的分子機制尚且未知，還有待進一步研究.

綜上所述，本研究初步發現，水稻鋅指蛋白基因OsDHHC13能促進清除H2O2的相關酶基因表達，調節內源性H2O2的動態平衡，從而正調控水稻的抗氧化脅迫能力.

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