煙霧病患者外周血來源內皮祖細胞體外培養的能力探討

張文高 趙志煌 李亞斌 尹港峰

煙霧病患者外周血來源內皮祖細胞體外培養的能力探討

張文高 趙志煌 李亞斌 尹港峰

目的探討煙霧病患者外周血來源內皮祖細胞體外培養的能力。方法收集近幾年我院因腦缺血或腦出血入院的煙霧病患者，定義為實驗組，對照組為同期我院健康志愿者。結果（1）實驗組和對照組培養第9 d、12 d增殖速率差異存在統計學意義（P＜0．05），實驗組和對照組培養第3 d、6 d、12 d、15 d增殖速率差異無統計學意義（P＞0．05）。（2）實驗組和對照組EPCs遷移細胞數（26．67±2．333）、（29．30±2．679），差異無統計學意義（P＞0．05）。（3）實驗組和對照組EPCs遷移細胞數（23．12±2．36）、（23．61±2．14），差異無統計學意義（P＞0．05） 。結論本文推測煙霧病患者中，內皮祖細胞與正常血管存在類似形態與增值、粘附、遷移功能。

煙霧病；內皮祖細胞；體外培養

煙霧病是一類顱內血管病變，表現為頸內動脈主干或大分支外徑減小，管壁膜增厚，呈“洋蔥皮狀”，導致前循環流量減低。眾多研究指出[1]煙霧病與眾多腦血管病存在共性：血管損傷與修復的失衡或異常導致出現相應癥狀。1997年，國外學者體外分離出循環內皮祖細胞（EPCs），發現了新的血管內皮損傷再修復的細胞來源[1]。還有學者[2]提出EPCs減少可增加動脈粥樣硬化心血管事件發生。還有研究指出[2]煙霧狀腦缺血、腦出血患者增厚的血管內膜中發現EPCs的持續增高。本文擬收集近幾年我院煙霧病患者，分析內皮祖細胞在疾病中所扮演的角色，對揭示該疾病的發生過程提供思考。

1 資料與方法

1.1 資料

收集近幾年我院因腦缺血或腦出血入院的煙霧病患者14例，定義為實驗組。對照組為同期我院健康志愿者14例。實驗組平均年齡（53.4±15.4）歲，其中男8例，女6例；對照組平均年齡（52.1±16.2）歲，其中男9例，女5例，兩組性別、年齡等對比，P＞0.05，差異無統計學意義。

1.2 入選標準

（1）入院后行全腦DSA檢查，診斷為煙霧病。（2）性別不限。

1.3 排除標準

（1）中樞神經系統血管炎者。（2）自身免疫系統疾病者。（3）心腦血管疾病者。

1.4 主要試劑盒設備

（1）主要試劑：Ficoll淋巴細胞分離液、M199培養液、胎牛血清、VEGF、bFGF、D-Hank's平衡液、纖維連接蛋白、CCK-8試劑盒等。（2）主要設備：CO2培養箱、工作臺、低溫離心機、超純水裝置、顯微鏡、低溫冰箱等。

1.5 實驗方法與觀察指標

（1）循環內皮祖細胞的分離和培養：采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，單個核細胞初步培養和EPCs方向誘導分化。（2）細胞熒光鑒定。（3）細胞的活動性鑒定：細胞增殖能力、細胞遷移能力、細胞粘附能力測定。

1.6 觀察指標

對比不同培養時間內兩組EPCs吸光度，以及兩組細胞遷移能力及粘附能力。

2 結果

2.1 不同培養時間內兩組EPCs吸光度

實驗組和對照組培養第9 d、12 d增殖速率對比，差異存在統計學意義（P＜0.05），實驗組和對照組培養第3 d、6 d、12 d、15 d增殖速率對比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 兩組細胞遷移能力對比

實驗組和對照組EPCs遷移細胞數（26.670±2.333）、（29.300± 2.679），兩者遷移能力相似（P＞0.05）。

2.3 兩組細胞粘附能力對比

實驗組和對照組EPCs遷移細胞數（23.12±2.36）、（23.61± 2.14），差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

煙霧病為醫囑顱內血管病變，血管狹窄或閉塞，致前循環血量減低，可有腦缺血、腦出血等癥狀[3]。國外學者在1969年首次提出“煙霧狀血管”的命名，其發生機制受到廣泛的研究[4]。

3.1 血管內皮細胞生物學行為

以往觀念認為血管內皮細胞是不穩定細胞，參與血管內皮損傷后得修復。1997年國外學者通過磁珠標記技術發現表達CD133亞型循環內皮祖細胞，骨髓動員后分化成為血管內皮細胞[5]。

煙霧病與動脈粥樣硬化、先天性顱內血管改變 、動脈瘤破裂、免疫介導炎性改變有眾多相同點。有學者[6]對1名73歲煙霧 血管患者Willis環狹窄處大動脈進行病理解剖，管壁內膜增厚約為正常血管2～3倍，彈力層結構斷裂，內膜增厚呈洋蔥狀，狹窄動脈增厚的內膜可見原位于中膜的合體平滑肌細胞向內膜遷移增生，未見炎癥細胞、鈣化。內皮細胞參與血管生成、組織灌注、免疫、凝血等功能[6-7]。

3.2 成人煙霧病患者培養出與健康人相近功能的內皮祖細胞

研究指出，煙霧病存在血管閉塞、腦組織缺血等現象，同時內皮祖細胞存在升高，并誘導新生血管生成有關。有學者通過病理解剖，發現VEGFR-2陽性細胞在閉塞動脈處聚集。還有研究指出腦梗塞與腦出血的風險與內皮祖細胞增高存在正相關。本次研究結果發現實驗組和對照組培養第3 d、6 d、12 d、15 d增殖速率對比，差異無統計學意義（P＞0.05），同時兩組細胞遷移能力、粘附能力基本類似。我們推測煙霧病患者中，內皮祖細胞與正常血管存在類似形態與增殖、粘附、遷移功能。

[1] 馮雨，陳勁草，于加省，等． 手術治療降低煙霧病腦出血發生率的研究[D]． 湖北：華中科技大學，2010：58-59．

[2] 陳勁草，劉斌，李正偉，等． CT灌注成像對煙霧病行腦血管重建術的療效評價[J]． 中華神經外科雜志，2009，25（6）：537-540．

[3] 李正偉，陳勁草，于加省，等． 煙霧病行STA-MCA分流術前后腦血流的TCD檢測[J]． 中國臨床神經外科雜志，2009，14（7）：397-400．

[4] 李柏，王忠誠，孫異臨，等． Moyamoya病腦血管的超微形態學研究[J]． 中華神經外科雜志，1987，3（2）： 14．

[5] 陳勁草，周平，歐一博，等． 聯合血管重建術治療煙霧病療效分析[J]． 中國臨床神經外科雜志，2011，16（10）： 581-583．

[6] 耿萬杰, 李正俠． 單側煙霧病臨床特點的分析[J]． 臨床薈萃, 2012, 27（1）：520-522

[7] 李德生, 咸鵬, 楊偉中, 等． 單側煙霧病的臨床特征[J]．中國卒中雜志, 2013, 8（5）：511-516

Study the Ability of Endothelial Progenitor Cells From Peripheral Blood in Patients With Smoke Disease

ZHANG Wengao ZHAO Zhihuang LI Yabin YIN Gangfeng The Third Department of Neurosurgery , Cangzhou Central Hospital, Cangzhou Hebei 161001, China

ObjectiveTo investigate the ability of peripheral blood derived endothelial progenitor cells from peripheral blood in patients with smoke disease.MethodsIn recent years, patients with cerebral ischemia or cerebral hemorrhage admitted to hospital were defined as experimental group. Control group for the same period in our hospital healthy volunteers.Results(1) experimental group and control group were cultured for ninth days and 12 days. The proliferation rate was different (P＜0.05). The proliferation rate of the experimental group and the control group was 3 days, 6 days, 12 days and 15 days. (2)there was no differernt in the number of migrating cells in the experimental group and the control group was (26.67 ±2.333), (29.30 ± 2.679), and the migration ability was similar (P＞0.05). (3) there was no differernt in the number of migrating cells in the experimental group and the control group was (23.12 ± 2.36), (23.61 ± 2.14) (P＞0.05).ConclusionIn this paper, we hypothesized that endothelial progenitor cells and normal vascular endothelial progenitor cells have similar morphology and proliferation, adhesion and migration.

smoke disease;endothelial progenitor cells;vitro culture

表1 不同培養時間內兩組EPCs吸光度

R743

A

1674-9316（2017）01-0144-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．01．093

滄州市中心醫院神經外三科，河北 滄州 161001