Twist在低氧微環境中宮頸癌上皮間質轉化中的作用

王妍妍，張素仙，廉陽秧，徐 勤，寇 蓬，魏 潔，楊麗華

(昆明醫科大學第二附屬醫院婦科，云南 昆明 650101)

Twist在低氧微環境中宮頸癌上皮間質轉化中的作用

王妍妍，張素仙，廉陽秧，徐 勤，寇 蓬，魏 潔，楊麗華

(昆明醫科大學第二附屬醫院婦科，云南 昆明 650101)

目的 研究Twist在低氧微環境中宮頸癌上皮間質轉化(EMT)中的作用。方法 以二氯化鈷處理Hela細胞模擬低氧微環境，細胞的形態變化、遷移能力分別應用倒置顯微鏡及劃痕實驗進行評價。Twist、Vimentin和低氧誘導因子-1α(HIF-1α)在Hela細胞中的表達應用細胞免疫熒光法進行檢測。結果 低氧處理后Hela細胞獲得了間質細胞的形態特征；Hela細胞低氧組遷移率為(20.4±5.9)%，常氧組為(5.2±1.7)%(P<0.05)；低氧組Hela細胞HIF-1α、Twist、Vimentin表達均較常氧組顯著增高(P均<0.05)；低氧組Hela細胞中HIF-1α、Twist、Vimentin的表達兩兩均呈正相關(P<0.05)。結論 低氧條件下Hela細胞中Twist高表達，這可能與宮頸癌EMT發生有關。

宮頸腫瘤；上皮間質轉化；Twist；低氧誘導因子-1α； Vimentin；低氧

上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞轉化為間質細胞的一個過程，其與細胞遷徙、侵襲能力增強及腫瘤的浸潤、轉移和耐藥的發生有關[1]。Twist是調控EMT的關鍵因素，在腫瘤發生、侵襲、轉移、耐藥等過程中發揮重要作用[2]。Twist與缺氧微環境中多種腫瘤的EMT發生相關，但其在宮頸癌EMT發生中的作用尚不清楚，本文通過探討低氧微環境中宮頸癌Hela細胞增殖、遷移能力的變化以及低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、Twist和Vimentin表達的相關性，以探討Twist在低氧微環境中宮頸癌EMT發生中發揮的作用，從而為宮頸癌的靶向治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 試劑和細胞株 人宮頸癌Hela細胞由昆明醫科大學云南省藥理重點實驗室周軼平老師饋贈。二氯化鈷購自廣州金華大化學試劑有限公司；二甲基亞砜、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚、PVP封片液購自碧云天生物技術研究所；兔抗人HIF-1α抗體、小鼠抗人Vimentin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗人Twist抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，山羊抗兔-TRITC抗體、山羊抗小鼠-FITC抗體以及濃縮型封閉用山羊正常血清購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 實驗分組 采用Hela細胞進行實驗，細胞在體積分數5% CO2、37 ℃恒溫培養箱內培養，按照培養方法換液傳代，實驗細胞均為對數生長期的細胞。細胞分為常氧組、低氧組，低氧組應用二氯化鈷處理，二氯化鈷的終濃度為150 μmol·L-1，常氧組應用一般培養基。

1.3 低氧對Hela細胞形態學的影響 低氧組和常氧組細胞分別培養6 h后在倒置相差顯微鏡下觀察2組細胞的形態，然后照相。

1.4 劃痕實驗研究Hela細胞遷移能力 在培養皿培養Hela細胞，分為低氧組、常氧組，細胞生長至80%后，應用刮片刮去部分細胞形成劃痕，用培養基洗去刮下細胞，照相，然后放置于體積分數5% CO2、37 ℃恒溫培養箱內培養，48 h后照相。

1.5 2組細胞HIF-1α、Twist和Vimentin表達及相互之間的關系 取對數生長期低氧組、常氧組細胞，消化后把細胞懸液置于玻片，制備細胞爬表面，甲醛固定細胞、應用山羊血清封閉抗原、玻片分別滴加HIF-1α、Twist、Vimentin、Twist與Vimentin、HIF-1α與Vimentin混合一抗，然后4 ℃過夜，隨后滴加熒光標記的相應二抗，在室溫孵育，注意避光，最后加用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚液、應用PVP封片劑封片，觀察染色情況，照相。

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0進行數據分析，計量資料比較用t檢驗；Spearman線性相關分析各指標的相關性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Hela細胞形態學改變 二氯化鈷作用于細胞后，Hela細胞發生了明顯的形態變化，細胞間的空隙增加，突起變長變細，細胞外形不規則、彎曲。見圖1。

圖1 2組Hela細胞形態比較(×100)

2.2 Hela細胞的遷移能力變化 低氧組應用含150 μmol·L-1的二氯化鈷處理，常氧組應用普通培養基培養，48 h后觀察結果，低氧組遷移率為(20.4±5.9)%，常氧組為(5.2±1.7)%，低氧組細胞遷移率明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 Hela細胞中HIF-1α、Twist和 Vimentin蛋白表達的變化及各因子間的關系 免疫熒光染色后應用熒光顯微鏡觀察各因子表達，HIF-1α染色呈紅色，陽性染色以細胞核為主。Twist染色也為紅色，陽性染色以細胞核為主。Vimentin染色呈綠色，主要在細胞質。低氧組Hela細胞中HIF-1α、Twist、Vimentin表達均顯著高于常氧組，差異均有統計學意義(P均<0.05)。為研究3個指標在低氧狀態下的相關性，我們應用雙重熒光法檢測Hela細胞中HIF-1α、Twist與Vimentin表達的關系，發現三者均呈正相關。見圖2、3，表1、2。

圖2 Hela細胞中HIF-1α、Twist及Vimentin蛋白表達的變化 (×200)

圖3 2組Hela細胞中HIF-1α、Twist與Vimentin蛋白表達的關系(×200)

表1 2組Hela細胞中HIF-1α、Twist、Vimentin的表達

表2 低氧組Hela細胞中HIF-1α、Twist、Vimentin相互之間表達的相關性

3 討論

惡性腫瘤有侵襲和轉移的特征，惡性腫瘤細胞在侵襲和轉移過程都有EMT現象存在，腫瘤細胞發生EMT后極性喪失，細胞表型發生改變，上皮表型逐漸喪失，間質表型表達增加，這可能是啟動惡性腫瘤侵襲轉移的關鍵所在，Tanaka等[3]曾報道子宮內膜癌存在EMT狀態，該狀態與子宮內膜癌轉移及預后密切相關。

許多原因均可導致EMT發生，其中的一個重要始動因素是低氧[4]，快速生長的腫瘤細胞導致其顯著的低氧微環境[5]，而HIF-1α是在低氧微環境中發揮作用的重要因子[6]。Twist是EMT的關鍵調節分子，有研究報道Twist為HIF-1α的下游作用分子，在多種疾病的EMT發生中發揮重要作用，Du等[7]在研究腎臟纖維化中發現HIF-1α通過調控PI3K/Akt/Snail信號激活HIF-1α/Twist-Bmi1通路促進EMT發生，從而導致腎臟纖維化。Tsai等[8]報道HIF-1α通過Twist保持腫瘤細胞間質表型。賈有娟等[9]也報道宮頸癌組織中Twist及HIF-1α表達呈正相關，因此提示Twist在低氧微環境中宮頸癌EMT發生中發揮重要作用，但未見類似報道。

本實驗中Hela細胞被二氯化鈷處理導致腫瘤細胞的低氧，然后觀察二氯化鈷處理后Hela細胞遷移能力、細胞外形的變化。另外，我們還檢測了細胞HIF-1α、Twist、Vimentin蛋白表達的變化，以探討Twist在低氧微環境中宮頸癌細胞EMT發生中的作用。二氯化鈷處理Hela細胞6 h后，我們觀察到Hela細胞突起變得更長更細，細胞間間隙增寬，呈現間質細胞的形態學特點。同時發現應用二氯化鈷處理后的細胞獲得更強的遷移能力及高Vimentin表達率。Vimentin被認為是腫瘤細胞發生EMT的標志物，其表達的增高代表腫瘤細胞獲得了較強的侵襲、轉移能力。該結果說明低氧條件下宮頸癌Hela細胞發生了EMT且其轉移能力增強了。本研究用免疫熒光方法發現二氯化鈷處理后的Hela細胞HIF-1α、Twist、Vimentin表達增強，三者間表達呈正相關，提示低氧是宮頸癌細胞發生EMT的誘因之一，低氧微環境中HIF-1α表達增多，HIF-1α上調Twist蛋白可能是其主要機制。

綜上所述，宮頸癌在發生發展過程中，隨著腫瘤組織增大，腫塊內部出現低氧環境，為適應這種改變，HIF-1α作為細胞低氧保護元件被激活，HIF-1α通過上調Twist促進Vimentin表達導致宮頸癌EMT發生，從而使宮頸癌細胞獲得侵襲、轉移潛能。

[1] 呂文姣,周京旭.上皮-間質轉化與腫瘤侵襲轉移關系的研究進展[J]. 腫瘤學雜志,2014,20(6):508-511.

[2] TANIA M,KHAN MA,FU J. Epithelial to mesenchymal transition inducing transcription factors and metastatic cancer[J].Tumour Biol,2014,35(8):7335-7342.

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[5] 關濤,田曉予,喬文艷.缺氧誘導因子-1α與婦科腫瘤[J].中國現代藥物應用,2014,7(14):244.

[6] ARJUMAND W,SULTANA S. Role of VHL gene mutation in human renal cell carcinoma[J].Tumour Biol,2012,33(1):9-16.

[7] DU R,XIA L,NING X,et al. Hypoxia-induced Bmi1 promotes renal tubular epithelial cell-mesenchymal transition and renal fibrosis via PI3K/Akt signal[J].Mol Biol Cell,2014,25(17):2650-2659.

[8] TSAI CC,CHEN YJ,YEW TL,et al. Hypoxia inhibits senescence and maintains mesenchymal stem cell properties through down-regulation of E2A-p21 by HIF-TWIST[J].Blood,2011,117(2):459-469.

[9] 賈有娟.Twist和HIF-1α在宮頸癌中的表達及意義[D].青島:青島大學,2011.

Role of Twist on the Cervical Cancer Epithelial Mesenchymal Transition in Hypoxic Microenvironment

WANG Yanyan,ZHANG Suxian,LIAN Yangyang,XU Qin,KOU Peng,WEI Jie,YANG Lihua

(DepartmentofGynaecology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101,China)

Objective To investigate the role of twist on cervical cancer epithelial mesenchymal transition (EMT) in hypoxia microenvironment.Methods Hypoxia microenvironment was mimicked by using cobalt chloride. The morphologies and the migration ability of Hela cells in hypoxia microenvironment were observed by invert microscopy and scratch test. The expressions of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α),Twist and Vimentin proteins in Hela cells were determined by immunofluorescence.Results The mesenchymal morphological characteristics of Hela cells showed in hypoxia microenvironment. The migration percentage in the hypoxia group was (20.4±5.9)%,and was (5.2±1.7)% in the normoxia group (P<0.05). The expressions of HIF-lα,Twist and Vimentin of Hela cells in the hypoxia group significantly higher than those in the normoxia group (P<0.05). There were significantly positive correlations among them in the hypoxia group (P<0.05).Conclusion The expression of Twist increased in hypoxia microenvironment,and is highly correlation with EMT,Twist may induce EMT of cervical cancer through Twist pathway.

cervical cancer; epithelial-mesenchymal transition; Twist; hypoxia inducible factor-1α; Vimentin; hypoxia

云南省教育廳科學研究基金重點項目(編號：2015Z074)

王妍妍(1989-)，女，碩士，主要從事婦科腫瘤的臨床研究。E-mail：942622967@qq.com

楊麗華(1972-)，女，教授，主要從事婦科腫瘤的臨床研究。E-mail：yanglihua0628@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.02.001

R737.33;R730.23

A

1673-5412(2017)02-0093-04

2016-06-21)