PFTK1在食管鱗癌組織中的表達(dá)及意義

史瓊瓊，陳奎生

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

PFTK1在食管鱗癌組織中的表達(dá)及意義

史瓊瓊，陳奎生

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

目的 探討PFTK1在食管鱗癌組織中的表達(dá)及意義。方法 采用免疫組化S-P法檢測(cè)53例食管鱗癌組織、21例癌旁不典型增生組織和25例正常食管黏膜組織中PFTK1蛋白的表達(dá)；應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)53例食管鱗癌組織、21例癌旁不典型增生組織和25例正常食管黏膜組織中PFTK1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 食管鱗癌組織中PFTK1蛋白、mRNA表達(dá)明顯高于癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。食管鱗癌組織中PFTK1蛋白、mRNA的陽性表達(dá)率與食管鱗癌分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與性別、年齡無關(guān)(P均>0.5)。結(jié)論 PFTK1的表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其表達(dá)的升高可能促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。

食管鱗癌；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶；免疫組化；原位雜交

PFTK1是一種重要細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)[1]。隨著對(duì)PFTK1的深入研究，有證據(jù)表明PFTK1基因是一個(gè)十分有潛力的腫瘤相關(guān)基因。因此，進(jìn)一步研究PFTK1的機(jī)制和功能將對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供新的認(rèn)識(shí)，有為腫瘤治療提供新靶點(diǎn)的可能。本研究采用免疫組化S-P法檢測(cè)53例食管鱗癌組織、21例癌旁不典型增生組織和25例正常食管黏膜組織中PFTK1蛋白的表達(dá)；應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)53例食管鱗癌組織、21例癌旁不典型增生組織和25例正常食管黏膜組織中PFTK1 mRNA的表達(dá)，探討PFTK1表達(dá)與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本選自河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院2012年5月至2015年5月手術(shù)切除并明確診斷為食管鱗癌的新鮮標(biāo)本，共53例，所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療及其他相關(guān)治療，并經(jīng)常規(guī)切片證實(shí)為食管鱗癌。每例標(biāo)本分別取食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織(距癌灶邊緣4 cm組織)。所取標(biāo)本均用40 g·L-1甲醛固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。53例食管鱗癌患者中，男35例，女28例；年齡37～75歲，中位年齡55歲；病理類型：髓質(zhì)型17例，潰瘍型29例，傘型3例，縮窄型4例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)17例，Ⅱ級(jí)24例，Ⅲ級(jí)12例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期45例；浸潤(rùn)黏膜下層或淺肌層6例，浸潤(rùn)深肌層或外膜層47例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。

1.2 主要試劑 兔抗人CDK14單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；原位雜交5’端生物素標(biāo)記PFTK1全硫代修飾探針(5’-GTGGGGAGTAGGTTGCATCT-3’)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。S-P免疫組化試劑盒、SA-AP顯色試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化步驟 染色步驟按照免疫組化S-P法試劑盒說明進(jìn)行，高壓抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。采用已知陽性表達(dá)的組織切片為陽性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果判斷 PFTK1陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性染色為黃色或棕黃色。PFTK1陽性表達(dá)根據(jù)陽性細(xì)胞的百分率判定，陽性細(xì)胞百分率計(jì)算：每張切片在400倍鏡下分別取10個(gè)視野，分別計(jì)算陽性細(xì)胞的百分率，取其平均值，≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分別計(jì)為0、1、2、3、4分。陽性細(xì)胞染色程度評(píng)分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。然后根據(jù)2項(xiàng)評(píng)分之和判斷結(jié)果：0分為陰性，<3分為弱陽性(+)，3～6分為中度陽性(++)，>6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.5 原位雜交步驟 組織經(jīng)新鮮配制二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶；質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%檸檬酸新鮮配制蛋白酶消化標(biāo)本DNA結(jié)合蛋白；滴加不含探針的預(yù)雜交液(42 ℃)，預(yù)雜交4 h；滴加含探針的雜交液，42 ℃濕盒內(nèi)雜交12 h；滴加SA-AP，37 ℃，30 min，BCIP/NBT避光顯色2～4 h。用已知PFTK1 mRNA陽性表達(dá)的組織切片為陽性對(duì)照，用不含探針的預(yù)雜交液孵育標(biāo)本為陰性對(duì)照。

1.6 原位雜交結(jié)果判讀 PFTK1 mRNA陽性表達(dá)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，陽性染色呈紫藍(lán)色顆粒。PFTK1陽性表達(dá)根據(jù)陽性細(xì)胞的百分率判定，陽性細(xì)胞百分率計(jì)算：每張切片在400倍鏡下分別取10個(gè)視野，分別計(jì)算陽性細(xì)胞的百分率，取其平均值，≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分別計(jì)為0、1、2、3、4分。陽性細(xì)胞染色深度評(píng)分：無色為0分，淡紫藍(lán)色為1分，紫藍(lán)色為2分，深紫藍(lán)色為3分。然后根據(jù)2項(xiàng)評(píng)分之和判斷結(jié)果：0分為陰性(-)，<3分為弱陽性(+)，3～6分為中度陽性(++)，>6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，百分率比較采用校正χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PFTK1蛋白在不同食管組織中的表達(dá) PFTK1蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為71.7%(38/53)，顯著高于癌旁不典型增生組織的38.1%(8/21)和正常食管黏膜組織的8.0%(2/25)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1、圖1。

表1 PFTK1蛋白在不同食管組織中的表達(dá)

2.2 PFTK1蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 PFTK1蛋白的陽性表達(dá)率與食管鱗癌分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，而與患者的年齡、性別均無關(guān)(P均>0.05)。見表2。

2.3 PFTK1 mRNA在不同食管組織中的表達(dá) 食管鱗癌組織中PFTK1 mRNA的陽性表達(dá)率為83.0%(44/53)，顯著高于癌旁不典型增生組織的38.1%(8/21)和正常食管黏膜組織的4.0%(1/25)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3、圖2。

2.4 PFTK1 mRNA的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 PFTK1 mRNA陽性表達(dá)率與食管鱗癌分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，而與患者的年齡、性別均無關(guān)(P均>0.05)。見表4。

圖1 正常食管黏膜組織(A)、癌旁不典型增生組織(B)和食管鱗癌組織(C)中PFTK1蛋白表達(dá)(S-P,×200)

表2 PFTK1蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 PFTK1 mRNA在不同食管組織中的表達(dá)

3 討論

PFTK1基因編碼469個(gè)氨基酸，轉(zhuǎn)錄本約6 000 bp,位于人類的1號(hào)染色體的7q21.13,其催化結(jié)構(gòu)域與Cdc2相關(guān)蛋白序列有高度的同源性，能調(diào)控細(xì)胞G1期向S期、G2期向M期轉(zhuǎn)化。Cdc2相關(guān)蛋白是細(xì)胞周期進(jìn)程的重要調(diào)節(jié)因子[2]。PFTK1在16種組織細(xì)胞中均檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄本，尤其是在腦、胰腺、腎臟、心臟、睪丸和卵巢組織中表達(dá)顯著。

圖2 正常食管黏膜組織(A)、癌旁不典型增生組織(B)和食管鱗癌組織(C)中PFTK1 mRNA表達(dá)(ISH,×200)

表4 PFTK1 mRNA的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Sy等[3]利用比較基因組雜交技術(shù)分析100例肝癌組織，發(fā)現(xiàn)染色體的7q21-q22在肝癌的晚期過表達(dá)。Pang等[4]采用高分辨率基因作圖分析了5例肝癌組織染色體的7q21-q22，發(fā)現(xiàn)在這一區(qū)域PFTKl基因的拷貝數(shù)明顯增加。進(jìn)一步用RT-PCR檢測(cè)了40例早期肝癌和48例晚期肝癌組織中PFTK1 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFTK1 mRNA顯著上調(diào)(P<0.032)，并且臨床分期越晚，其肝癌組織的PFTK1 mRNA的表達(dá)水平越高，與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。

PFTK1能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，在乳腺癌組織中也發(fā)現(xiàn)PERK1的表達(dá)增加與其侵襲能力密切相關(guān)。一直認(rèn)為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白不影響細(xì)胞的遷移，但最近的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)的Cdc2可以磷酸化鈣調(diào)蛋白，后者被磷酸化后結(jié)合微絲能力增強(qiáng)，可以促進(jìn)微絲有序聚合，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力[5-6]。最近Miyagaki等[7]檢測(cè)了PFTK1在77例食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PFTK1的表達(dá)是正常表皮細(xì)胞的2.61倍(P<0.001)。但有關(guān)PFTK1表達(dá)與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，PFTK1蛋白、mRNA在食管鱗癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于癌旁不典型增生組織、正常食管黏膜組織(P均<0.05)，PFTK1蛋白、mRNA的陽性表達(dá)率與腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05),而與患者的性別、年齡均無關(guān)(P均>0.05)?？傊琍FTK1高表達(dá)可能與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，該研究結(jié)果為進(jìn)一步探討食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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Expression and Significance of PFTK1 in the Esophageal Squamous Carcinoma Tissues

SHI Qiongqiong，CHEN Kuisheng

(DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,450052,China)

Objective To investigate the expressions and clinical significances of PFTK1 in the esophageal squamous carcinoma tissues.Methods The expressions of PFTK1 protein and mRNA in the 53 cases of esophageal squamous carcinoma tissues,21 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 25 cases of esophageal mucosa tissues were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization.Results The expressions of PFTK1 protein and mRNA in the esophageal squamous carcinoma tissues were significantly higher than those in the adjacent atypical hyperplasia tissues and the normal esophageal mucosa tissues(P<0.05).The PFTK1 protein and mRNA positive expression rates were associated with tumor differentiation,tumor infiltration depth and lymph node metastasis(P<0.05),and had nothing to do with the age and gender(P>0.05).Conclusion PFTK1 higher expression may be related to the occurrence and development of esophageal squamous carcinoma.

esophageal squamous carcinoma; cyclin dependent kinase; immunohistochemistry; in situ hybridization

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：142300410076)

史瓊瓊(1981-)，女，碩士在讀，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤病理研究。E-mail:13295987955@163.com

陳奎生(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理研究。E-mail:chenks2002@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.02.002

R735.1；R730.23

A

1673-5412(2017)02-0097-04

2016-08-12)