基于SRAP標記的湘產百合核心種質庫構建

童巧珍+高昱+劉平安+蔡嘉洛+張亞利+樊悅+易剛強

摘要：利用相關序列擴增多態性（sRAP）標記技術，以45份初級種質代表的87份湘產百合種質為材料，通過Pop-Gene32、NTSYS-Pc（Version 2.1）等軟件篩選湘產百合核心種質。結果表明：共獲得多態位點218個，物種水平上多態性比例78.42%；通過對SRAP信息進行遺傳多樣性分析，使用逐步聚類取樣法和分層抽樣法篩選出15份核心種質，占收集資源總數的17.2%；t檢驗表明，核心種質的有效等位基因數、Neis遺傳多樣性指數、Shannons信息指數在0.05水平上與初始種質差異不顯著，說明核心種質能很好地代替初始種質。

關鍵詞：湖南省；百合；核心種質；遺傳多樣性；SRAP；種質資源

中圖分類號：S682.2⁺90.24 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—056—04

湖南省為我國百合主要產區之一，百合在湖南省各地均有分布，以湘西自治州龍山縣的龍山百合、邵陽市隆回縣的龍牙百合種植區域最廣。百合集藥用、食用、觀賞用途為一體，具有很高的經濟價值。面對日益增長的百合需求，保護和利用百合種質資源極為重要。近年來，種質資源研究在國內外興起，核心種質作為種質資源群體研究和利用的切入點，開展相關研究可以避免遺傳上的重復，從而保存豐富的遺傳變異，是提高種質資源利用率的有效途徑，但是核心種質研究大多集中在牡丹、煙草、水稻等作物上，湘產百合核心種質研究尚未見報道。依靠基因型信息處理獲得的核心種質，主要通過簡單重復序列（SSR）、隨機擴增多態性DNA（RAPD）、ISSR、擴增片段長度多態性（AFLP）等分子標記方法來實現，這些方法具有準確、高效、不受外界環境以及基因間互作影響等特點，能被很好地用來構建核心種質。相關序列擴增多態性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）是在RAPD基礎上的升級，引物高度通用，比AFLP更能反映形態學變異和進化歷史，同時該技術還被認為是在分子標記輔助育種中最可能被大規模應用的一種技術。本研究利用SRAP標記技術篩選湘產百合核心種質，以期為有效利用其優秀基因提供依據。

1材料與方法

1.1材料

87份百合種質采自湖南省各地區，根據地方品種來源進行分組，按約50%的總體取樣比例抽取45份樣本建立初級核心種質（primary core collection），采用SRAP分子標記信息數據。45份初級種質來源及分組信息見表1。

1.2方法

1.2.1分子標記方法 根據改良CTAB法提取湘產百合種質DNA，參照Ⅱ等的原則，并作適當改進獲得反應體系。SRAP-PCR擴增反應體系為20μL，其中Mg²⁺濃度2.5 mmol/L，dNTPs濃度0.2μmol/L，引物濃度0.2μmol/L，Taq酶1U，模板DNA 50 ng。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，37℃復性1 min，72℃延伸2 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸2 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存；擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離（0.5×TBE，80 V，100 min），凝膠成像系統觀察、照相。

1.2.2核心種質構建方法

1.2.2.1逐步聚類取樣法 采用逐步聚類隨機取樣法，根據45份樣本建立的初級核心種質SRAP信息的不加權類平均法（UPGMA）聚類結果，刪除遺傳相似系數最大的2份種質中的1份（如組內只有1份遺傳材料，則選取該遺傳材料），將剩余種質再聚類；再從遺傳相似系數最大的成對種質中刪除1份。以此類推，直到代表性或核心種質數量達到要求。利用上述方法分別設定50%、35%、20%的取樣比例，分別獲得樣本群P₁、P₂、P₃。樣本群P₁（23個樣本）編號：1、4、5、6、8、11、14、15、16、20、27、31、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45；樣本群P₂（15個樣本）編號：1、4、8、11、20、27、34、36、37、39、40、41、42、43、45；樣本群P₃（9個樣本）編號：1、4、11、20、27、34、37、40、43。

1.2.2.2分層抽樣法 采用分組取樣策略，參考黎毛毛等的方法并適當改進，組內及亞組內取樣方法采用聚類、隨機方法相結合。根據主產區域將45份樣本建立的初級核心種質分為湘北、湘西北、湘西南、湘中南等4個區域組。

抽樣方法1：按50%比例在各區域組抽取一定數量的種質構成取樣組；在取樣組內對SRAP信息進行遺傳多樣性和聚類分析，依據遺傳相似性閾值劃分為不同的亞組，在各亞組內隨機抽取一定數量的種質構成樣本群P₄。

抽樣方法2：根據各區域組的種質規模，抽取一定數額的種質構成取樣組（對百合種質數量多的，抽取比例可適當小一些；對百合種質數量少的，抽取比例可相對大一些）；在取樣組內對SRAP信息進行遺傳多樣性和聚類分析，依據遺傳相似性閾值劃分為不同的亞組，在各亞組內按50%比例隨機抽取一定數量的種質構成樣本群P₅。

2.3核心種質的評價

將初級核心種質余下的30份樣品作為保留種質，通過對比核心種質與保留種質，核心種質保留87份百合樣品中的15份樣品（17.2%），很好地保留了多態位點，各項指標明顯優于保留種質（表4）。表明由初級種質中抽取的15份核心種質很好地保留了初級種質的遺傳多樣性，保留種質中因減少了遺傳距離較大的種質，導致各指標明顯降低。

利用SPSS 17.0軟件對有效等位基因數、Neis基因多樣性指數、Shannons信息指數進行t檢驗。由表5可見，核心種質與初始種質的有效等位基因數、Neis基因多樣性指數、Shannon's信息指數在0.05水平上差異不顯著，核心種質能很好地代替初始種質。

3結論與討論

3.1核心種質的代表性、異質性、多樣性

構建湘產百合核心種質要滿足代表性、異質性、多樣性的需求，盡可能地對各地區廣泛取樣，使其具有較好的代表性、多樣性；但是對主要產區取樣須考慮相互引種、種內基因交流、遺傳變異及優良品種推廣等因素；為獲得更多的多態位點，應適當擴大主要產區的取樣，篩除相似種質，優選多樣性種質。本研究表明，來自龍山縣洗洛鄉編號為27、34的樣本問遺傳距離為0.503 7，SRAP分子數據顯示為較大的遺傳差異，說明擴大主要產區內取樣的必要性，以避免漏選；最終確定核心種質時，不能忽略各地區百合種質因雜交和基因變異對多樣性的影響，須確定1個相對固定的遺傳相似性閾值，對最終核心種質各地區種質所占份額進行調整，以保證湘產百合的代表性和異質性。SRAP擴增獲得278個位點，其中218個具有多態性，滿足了核心種質遺傳多樣性需求。

3.2核心種質取樣方法

核心種質含15份樣品，其中3份種質來自湘東北地區，占湘東北地區種質數量的42.9%，占核心種質數量的20%；5份種質來自湘中南地區，占湘中南地區種質數量的62.5%，占核心種質數量的33.3%；3份種質來自湘西南地區，占湘西南地區種質數量的33.3%，占核心種質數量的20%；4份種植來自湘西北地區，占湘西北地區種質數量的19.0%，占核心種質數量的26.7%。該來源分布符合核心種質代表各區域遺傳分布的基本需求。湘西北地區的龍山縣、湘西南地區的隆回縣為湖南省百合主要產區，本研究在上述2個地區采樣較多，在龍山縣采樣31份，采樣量占湘西北地區采樣量的72.6%，根據50%的取樣原則，其中16份人選初級種質；在隆回縣采樣10份，采樣量占湘西南地區采樣量的55.6%，其中5份人選初級種質。因此，區域組內部分種質問會具有很高的遺傳相似性，且相似種質數量較多，但根據76.37%的遺傳變異存在于地域內的分析結果，又表明區域組內具有較大的遺傳差異，少部分種質對區域組內的遺傳多樣性有很大影響。因此，有必要依據遺傳相似性閾值將其劃分為不同的亞組，以說明地域內的遺傳分化及各樣本對區域組遺傳多樣性的影響，再利用50%比例在各亞組內隨機抽取一定數量的種質構成樣本群。通過該方法篩選，減少了樣本數量對篩選結果的影響，以50%比例亞組抽取比例，又進一步確定了核心種質的規模，使各區域組間所選取的樣本遺傳相似性較大的種質人選數量減少，所取得的群體更具有代表性，也結合百合種質相互引種和優良品種推廣種植而導致各區域組內存在較大的遺傳變異的結論，避免相似種質入選概率。

3.3核心種質的取樣比例

在確定核心種質所含樣本總量時，須結合所收集樣本的總體數量選擇恰當的抽樣比。我國有悠久的百合使用歷史，人工選擇對物種進化有很大影響，核心種質構建的抽樣過程中，須更多地平衡推廣品種與野生自然品種、區域特有品種的抽樣比例；對多態性好的群組，在抽取比例選取時可擴大其在核心種質中的比例。多數植物核心種質的抽樣比例為全部收集種質的5%～30%，一般為10%左右，但較小種質資源群體保存的遺傳變異和結構對抽樣比更為敏感。湘產百合核心種質選用逐步聚類取樣法和分層抽樣法選取多個抽樣比50%、35%、20%，最終優選出15個樣本構成核心種質，占收集百合種質總量的17.2%，符合構建核心種質的要求。

3.4結論

通過分層抽樣法使用SRAP分子標記信息，優選出的核心種質保存218個多態位點中的218個，保留率100%，多態性比例78.42%，觀測等位基因數1.784 2個，有效等位基因數1.531 0個，Neis基因多樣性指數0.305 5，Shannons信息指數0.448 8。通過遺傳多樣性分析和t檢驗，認為所建立的湘產百合核心種質很好地代表了初級核心種質，又很好地代表了湖南省各地區的百合遺傳變異，核心種質群體的差異性和多樣性很高，具有很大的保存意義。