新型二硫雜環戊烯硫酮化合物的合成及其對谷氨酸誘導損傷HT22細胞的保護作用

李玉姚, 孫銀星, 程 堅, 敖桂珍*

(1. 蘇州大學 a. 藥學院; b. 神經科學研究所，江蘇 蘇州 215123)

新型二硫雜環戊烯硫酮化合物的合成及其對谷氨酸誘導損傷HT22細胞的保護作用

李玉姚1a, 孫銀星1a, 程 堅1b, 敖桂珍1a*

(1. 蘇州大學 a. 藥學院; b. 神經科學研究所，江蘇 蘇州 215123)

在保留ADT- OH的3H- 1,2- 二硫雜環戊烯- 3- 硫酮結構的基礎上，用芳乙烯基替換4- 羥基苯環，設計并合成了6個二硫雜環戊烯硫酮化合物(L1～L6,其中L2, L3, L5和L6為新化合物)，其結構經1H NMR,13C NMR和HR- MS(ESI)表征。采用MTT法研究了L1～L6對谷氨酸誘導損傷的海馬神經元HT22細胞的影響。藥理初篩結果表明:給藥濃度為10～100 μmol·L-1時，L1, L2, L4和L6均能提高受損HT22細胞的存活率(P<0.01)；給藥濃度為1 μmol·L-1時，L3和L5均可提高損傷HT22細胞的存活率(P<0.01)。

5- 對羥基苯基- 3H- 1,2- 二硫雜環戊烯- 3- 硫酮; H2S供體; 二硫雜環戊烯硫酮化合物; 合成; 神經保護作用

1996年，Kimmura發現內源性H2S在大腦中扮演了神經調質的角色[1]。此后，諸多研究結果表明H2S對神經調節具有多方面的生物效應，如血管松弛[2]、心肌缺血損傷保護[3-4]及氧化應激細胞保護等[5]。新型H2S供體的研究已成為化學與神經學交叉學科的熱點之一[6]。H2S供體釋放H2S的機制多樣，其對神經系統的影響也不同。選擇合適的H2S供體對準確開展藥理機制的研究具有重要意義。

Scheme 1

5- 對羥基苯基- 3H- 1,2- 二硫雜環戊烯- 3- 硫酮(ADT- OH)為一種重要的硫化氫緩釋供體。本課題組前期研究發現，ADT- OH能夠保護谷氨酸損傷的HT22海馬神經元細胞[7]；抑制脂多糖誘導的BV2小膠質細胞的炎癥應答[8]；ADT- OH衍生物ADT在小鼠腦中動脈堵塞模型上能減少腦梗死體積，保護血腦屏障[9]。在此基礎上，本文在保留ADT- OH的3H- 1,2- 二硫雜環戊烯- 3- 硫酮結構的基礎上，用芳乙烯基替換ADT- OH的4- 羥基苯環，設計并合成了6個二硫雜環戊烯硫酮化合物(L1～L6, Scheme 1)，其中L2, L3, L5和L6為新化合物，其結構經1H NMR,13C NMR和HR- MS(ESI)表征。采用MTT法研究了L1～L6對谷氨酸誘導損傷的海馬神經元HT22細胞的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XT- 5型顯微熔點儀(溫度未校正)；ABI Varian UNTIY INOVA 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內標)；ALT Micromass TOF- MS型質譜儀；Bio- Tek型酶標儀。

5- 硫代- 5H- 1,2- 二硫雜環戊二烯- 3- 甲醛(5)按文獻[10]方法合成；RPMI- 1640培養基，MTT，Sigma公司；胰蛋白酶，吉諾生物醫藥技術有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 三苯基膦鹽(7)的合成

將6 4 mmol和三苯基膦1.049 g(4 mmol)加至乙腈(50 mL)中，回流反應24～48 h。旋干得白色或淡黃色粉末狀固體7。

(2) L1～L6的合成(以L1為例)

將7 325 mg(0.75 mmol)和氫化鈉17 mg(0.7 mmol)加至無水THF(15 mL)中，氮氣保護，攪拌下于0 ℃反應1 h。加入5 80 mg(0.5 mmol)的無水THF(15 mL)溶液，反應2 h。加水15 mL，用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，有機相減壓蒸干，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得5- (2- 苯乙烯基)- 3H- 1,2- 二硫雜環戊二烯- 3- 硫酮(L1)。

用類似的方法合成L2～L6。

L1: 黃色固體，收率45%, m.p.117～120 ℃;1H NMRδ: 7.54(d,J=6.5 Hz, 2H, ArH), 7.45～7.40(m, 3H, ArH), 7.32(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 7.16(s, 1H, C=CH), 7.13(d,J=16.2 Hz, 1H, C=CH);13C NMRδ: 215.02, 169.78, 138.31, 137.61, 134.54, 130.45, 129.14, 127.76, 120.06; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C11H8S3{[M+H]+}236.986 6, found 236.986 9。

L2: 黃褐色固體，收率47%， m.p.207～210 ℃;1H NMRδ: 8.28(d,J=8.7 Hz, 2H, ArH), 7.70(d,J=8.8 Hz, 2H, ArH), 7.34(d,J=16.2 Hz, 1H, C=CH), 7.28(s, 1H, C=CH), 7.20(s, 1H, C=CH);13C NMRδ: 215.12, 167.58, 148.32, 140.59, 138.88, 134.92, 128.24, 124.42, 124.16; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C11H7NO2S3{[M+H]+}281.971 7, found 281.971 4。

L3: 黃色固體，收率51%， m.p.150～153 ℃;1H NMRδ: 7.48(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 7.43(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 7.30(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 7.15(s, 1H, C=CH), 7.10(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 1.34(s, 9H, CH3);13C NMRδ: 214.85, 170.22, 154.21, 138.29, 137.30, 131.80, 127.64, 126.12, 119.21, 34.96, 31.08; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C15H16S3{[M+H]+}293.049 2, found 293.048 6。

表1 L1～L6對谷氨酸誘導損傷的小鼠海馬神經元HT22細胞的保護作用

*10 mmol·L-1;**P<0.01vsglutamate group。

L4: 黃褐色固體，收率46%， m.p.126～128 ℃;1H NMRδ: 7.44(d,J=8.1 Hz, 2H, ArH), 7.29(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 7.22(d,J=8.0 Hz, 2H, ArH), 7.15(s, 1H, C=CH), 7.09(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 2.39(s, 3H, CH3);13C NMRδ: 214.91, 170.20, 141.08, 138.43, 137.29, 131.85, 129.89, 127.78, 119.06, 29.69; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C12H10S3{[M+H]+}250.978 8, found 250.978 5。

L5: 黃色固體，收率42%， m.p.195～198 ℃;1H NMRδ: 8.10(d,J=8.2 Hz, 1H, ArH), 7.87(d,J=16.0 Hz, 1H, C=CH), 7.73～7.68(m, 2H, ArH), 7.61～7.56(m, 1H, ArH), 7.19(s, 1H, C=CH), 7.07(d,J=16.0 Hz, 1H, C=CH);13C NMRδ: 215.26, 168.02, 138.76, 133.78, 133.19, 130.69, 130.36, 128.84, 125.32, 124.65; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C11H7NO2S3{[M+H]+}281.971 7, found 281.972 1。

L6: 黃色固體，收率55%， m.p.178～181 ℃;1H NMRδ: 7.80(d,J=15.4 Hz, 1H, C=CH), 7.45(d,J=15.4 Hz, 1H, C=CH), 7.24(s, 1H, C=CH), 2.62(s, 3H, CH3), 2.55(s, 3H, CH3), 2.54(s, 3H, CH3);13C NMRδ: 215.17, 169.09, 152.65, 150.16, 148.65, 142.47, 138.44, 131.86, 124.61, 22.07, 21.74, 20.70; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C12H12N2S3{[M+H]+}281.024 1, found 281.024 2。

1.3 化合物對谷氨酸誘導的HT22細胞損傷的保護作用測定[7]

空白組只加培養基。谷氨酸組HT22細胞用10 mmol·L-1谷氨酸處理；樣品測試組用10 mmol·L-1谷氨酸和終濃度分別為1, 10, 50和100 μmol·L-1的受試化合物處理。用酶聯測試儀測定波長570 nm處每孔的吸收度(OD值)，計算細胞存活率α(α=實驗組平均OD值/空白組OD值×100%)。實驗重復3次，采用SPSS進行統計。

2 結果與討論

2.1 合成

合成L2時，最開始采用的是Knoevenagel縮合法，即2與對硝基苯甲醛在哌啶催化下，回流進行縮合反應。化合物經1H NMR鑒定為L2順反異構體的混合物，M(反式) ∶M(順式)=3 ∶1，反應產率也較低(<20%)。采用該方法合成其他目標化合物時，立體選擇性也較差。最后改用Wittig縮合法，5與7反應所得產物均為反式，立體選擇性較好。

2.2 化合物對谷氨酸誘導損傷的HT- 22細胞保護作用

表1為L1～L6對谷氨酸誘導損傷的小鼠海馬神經元HT22細胞的保護作用。由表1可見，空白對照組的細胞存活率為100%。 glutamate組的HT- 22細胞單獨經10 mmol·L-1谷氨酸處理后，存活率<25%，說明10 mmol·L-1谷氨酸已對HT- 22細胞造成了損傷。樣品組的HT- 22細胞經10 mmol·L-1谷氨酸和不同濃度的目標化合物處理后，細胞存活率均能夠明顯提高，說明L1～L6可以保護谷氨酸誘導損傷的HT- 22神經細胞。其中，L1, L2, L4和L6的給藥濃度為10～100 μmol·L-1時，均可提高受損HT22細胞的存活率(40.64%～79.57%)(P<0.01)，具有較好的神經保護作用，但低于ADT- OH。 L5只在低濃度(1 μmol·L-1)時才表現出神經保護作用，細胞存活率為35.38%(P<0.01)。 L3在用藥濃度為1 μmol·L-1時，HT22細胞存活率為56.57%，高于ADT- OH(33.42%),P<0.05，神經保護作用較強。

合成了6個二硫雜環戊烯硫酮化合物(L1～L6,其中L2, L3, L5和L6為新化合物)。采用MTT法研究了L1～L6對谷氨酸誘導損傷的海馬神經元HT22細胞的影響。藥理初篩結果表明:給藥濃度為10～100 μmol·L-1時，L1, L2, L4和L6均能提高受損HT22細胞的存活率(P<0.01)；給藥濃度為1 μmol·L-1時，L3和L5均可提高損傷HT22細胞的存活率(P<0.01)。 L1～L6具有較好的神經保護作用，對神經保護作用的研究具有一定意義。

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Synthesis of Novel 3H- 1,2- dithiole- 3- thione Compounds and Their Protective Effects on Glutamic Acid- induced Damage of HT22 Cells

LI Yu- yao1a, SUN Yin- xing1a, CHENG Jian1b, AO Gui- zhen1a*

(a. College of Pharmaceutical Science; b. Institute of Neuroscience, 1. Soochow University, Suzhou 215123, China)

The structure of ADT- OH was modified by replacing 4- OH phenyl with aryl vinyl, based on retaining its 3H- 1,2- dithiocyclopentene- 3- thione. Six 3H- 1,2- dithiole- 3- thione compounds(L1～L6) were designed and synthesized. Among them, L2, L3, L5and L6were novel compounds. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR- MS(ESI). Effects of L1～L6on glutamic acid- induced damage of HT22 cells were investigated by MTT method. The primary pharmacological results displayed that L1, L2, L4and L6significantly improved the survival rates of damaged HT22 cells at the concentration of 10～100 μmol·L-1(P<0.01), L3and L5increased the survival rates of damaged HT22 cells at the concentration of 1 μmol·L-1(P<0.01).

ADT- OH; hydrogen sulfide donor; 3H- 1,2- dithiole- 3- thione compound; synthesis; neuroprotection

2016- 11- 01；

2017- 01- 16

蘇州市科技計劃項目(N313202713)

李玉姚(1989-)，男，漢族，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事藥物合成的研究。 E- mail: 18896587664@163.com

敖桂珍，副教授, E- mail: aoguizhen2007@sohu.com

O626.2

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005- 1511.2017.05.16278