布魯氏菌病弱毒活疫苗經不同黏膜途徑免疫奶牛的排菌程度及免疫反應

王苗苗徐磊王楠張賀張金亞曹如周郭志剛楊宏軍毛開榮?

（1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2.北京農學院，北京102206；3.現代牧業，安徽馬鞍山243111；4.山東農業科學院奶牛中心，濟南250183）

布魯氏菌病弱毒活疫苗經不同黏膜途徑免疫奶牛的排菌程度及免疫反應

王苗苗1，徐磊1，王楠1，張賀1，2，張金亞1，曹如周3，郭志剛3，楊宏軍4，毛開榮1?

（1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2.北京農學院，北京102206；3.現代牧業，安徽馬鞍山243111；4.山東農業科學院奶牛中心，濟南250183）

為探究布魯氏菌病疫苗經不同黏膜途徑免疫奶牛后對體液免疫與細胞免疫水平及疫苗體外排菌方面的影響，將80頭10～12月齡的奶牛平均分為四組，通過眼部滴注（A組）、口腔噴注（B組）、陰道灌注（C組）三種黏膜免疫途徑對奶牛接種布魯氏菌病弱毒活疫苗（A19株），并與皮下注射免疫組（D組）進行比較，測定了免疫后7 d內黏膜免疫組的排菌情況，180 d內四組免疫奶牛的抗體效價和60 d內四組免疫奶牛的外周血淋巴細胞細胞因子分泌（IFN－γ、IL－2和IL－4）水平。結果顯示：黏膜免疫組在免疫后5 d內均有不同程度的排菌，以免疫后1 d內排菌量為最高，并且在黏膜免疫組中陰道灌注組排菌量最低；各組奶牛在免疫后20 d時MSAT測定抗體效價平均值均上升至最高，之后持續下降，黏膜免疫組的抗體水平顯著低于注射免疫組，且在黏膜免疫組中陰道灌注組的抗體水平最高；A組和B組奶牛在免疫后120 d RBT檢測無陽性，C組在免疫后150 d RBT檢測無陽性，D組在免疫后180 d RBT檢測陽性率35%；B組、C組在免疫后7 d，A組、D組在免疫后20 d IFN－γ分泌量達到最高值，各組IL－2和IL－4分泌量未見明顯變化，黏膜免疫組中陰道免疫組的IFN－γ分泌量為最高，僅次于注射免疫。結果表明，陰道灌注是一種較優的奶牛布魯氏菌病黏膜免疫方式。

布魯氏菌病疫苗；黏膜免疫；排菌；抗體；細胞因子

布魯氏菌病（布病）是由布魯氏菌寄生在哺乳動物體內所引起的一種嚴重的人畜共患病，現今，根據寄生宿主不同和不同致病性，布魯氏菌可分為八個陸地型和兩個海洋型［1］。其中牛布病在世界各地廣為分布，可導致牛的繁殖障礙，造成嚴重的經濟損失。病原還可通過未經消毒的牛奶、奶制品、內臟及淋巴組織等感染人類，導致嚴重的社會公共衛生問題。因此，奶牛場布病的防控顯得十分重要［2］。疫苗免疫是預防和控制布病的重要措施之一，選擇適當的布病疫苗免疫途徑關系到布病防控的效果。傳統奶牛布病免疫以注射免疫為主，但是注射免疫對懷孕牲畜不安全，且抗體在體內存在的時間較長，影響對布病的監測和診斷［3］。黏膜免疫是近年國際上研究布病免疫的一個焦點，因其一方面可以改善疫苗對動物的安全性，另一方面能夠有效模擬布魯氏菌入侵機體的方式，被認為更有針對性。布病常用的黏膜免疫方式為點眼和口服，其優點是免疫抗體持續時間短，對監測等防控措施的影響小，并且對懷孕動物的安全性也更高；但其存在免疫后疫苗活菌易于排向體外，可能污染周邊環境、感染操作人員和有效成分流失的問題［4］。

為初步探究奶牛布病的最佳免疫方式，本試驗觀察了三種不同的黏膜途徑（眼部滴注、口腔噴注、陰道灌注）和皮下注射途徑免疫奶牛后，對奶牛體液免疫和細胞免疫反應的影響，并通過分析黏膜免疫后不同時間免疫部位的排菌量，比較不同黏膜免疫途徑排菌量的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用動物 布病陰性群的10～12月齡的奶牛80頭。

1.1.2 試驗用試劑 布魯氏菌病活疫苗A19購自中牧股份有限公司（1602001批）；虎紅平板凝集試驗抗原（201601批）；試管凝集試驗抗原（201601批）；布魯氏菌病陽性血清（201601批）；布魯氏菌病陰性血清（201601批）均由中國獸醫藥品監察所制備；布魯氏菌選擇性培養基，購于青島海博生物，貨號HB7027；淋巴細胞分離液購于Stemcell公司，貨號為07801；IFN－γ、IL－2、IL－4細胞因子檢測試劑盒均購于Mabtech公司，貨號分別為3119－1H－6、3111－1H－6、3118－1H－6。

1.2 試驗方法 將試驗牛分為眼部滴注（A組）、口腔噴注（B組）、陰道灌注（C組）、皮下注射（D組）四組，每組20頭，用布魯氏菌活疫苗A19對各組動物按各自途徑進行免疫。

1.2.1 免疫部位排菌量檢測 A、B、C三組在免疫后10min，30min、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，用一次性無菌拭子對奶牛免疫部位進行擦拭，接種布魯氏菌選擇性培養基，37℃培養3～5 d，對長出的菌落進行計數，統計分析。

1.2.2 抗體效價的測定 分別采集和分離四組試驗牛免疫前和免疫后7 d、20 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d的血清，參照國家標準GBT/18646－2002［5］進行虎紅平板凝集試驗（RBT）檢測抗體陽性率，微量試管凝集試驗（MSAT）測定抗體效價，并對檢測結果進行統計分析。

1.2.3 外周血淋巴細胞的細胞因子水平測定 分別采集四組試驗牛免疫前和免疫后7 d、20 d、30 d、60 d的抗凝血，用淋巴細胞分離液分離奶牛的外周血淋巴細胞，計數后，以1.0×106/mL的濃度平鋪在24孔細胞培養板板內，每孔1 mL。待細胞貼壁后，每孔加入100μL 1.0×109/mL的滅活布魯氏菌A19，37℃5%CO2恒溫培養箱刺激48～72 h，收集細胞上清［6］，按Mabtech檢測試劑盒使用說明書檢測IFN－γ、IL－2、IL－4水平。

2 結果

2.1 不同時間各組免疫部位排菌率和排菌量比較A、B、C三組黏膜免疫奶牛的排菌持續至免疫后第五天，從免后10 min到免后5 d，排菌率持續下降，免疫后1 d內為排菌高峰期，免疫5 d后未檢測到排菌情況；以排菌率來看，由高到低依次為A＞B＞C，各組排菌率（排菌奶牛頭數/奶牛總頭數×100%）見圖1；從免疫后10 min到免后5 d，排菌量持續下降，免疫后1 d內為排菌量最高時期，之后排菌量急劇下降，各組排菌量由高到低依次為A＞B＞C，見圖2；將排菌率和排菌量綜合分析來看，眼部滴注（A組）排菌最強、口腔噴注（B組）次之、陰道灌注（C組）排菌最弱。

圖1 免疫后不同時間奶牛免疫部位的排菌率分析

圖2 免疫后不同時間奶牛免疫部位的排菌量分析

2.2 不同時間抗體效價水平和抗體陽性率比較各組試驗牛在免疫后20 d抗體效價平均值升至最高（A組：1∶8；B組：1∶38；C組：1∶141；D組：1∶336），之后，除D組一直持續高效價到180 d才略有下降外，黏膜免疫組均在免后90 d抗體水平下降至1∶20以下，其中黏膜免疫的抗體水平均低于注射免疫，而陰道灌注免疫組的抗體水平高于其它黏膜免疫組，差異顯著。三組黏膜免疫牛的抗體水平從高到低依次為陰道灌注（C）、口服噴注（B）、眼部滴注（A），各組抗體水平見圖3。

各組抗體陽性率（抗體檢出奶牛頭數/奶牛總頭數×100%）參照RBT結果，在免疫后20 d和30 d達到最高值，除D組一直保持最高陽性率在60 d后略有下降，黏膜免疫組A組（最高抗體陽性率55%）、B組（40%）、C組（100%）均在30 d后下降，與D組差異顯著。免后120 d時A、B兩組抗體陽性率0%，C組10%，與D組55%差異顯著，C組在免后150 d抗體陽性率為0%，而D組在免后180 d時抗體陽性率仍為35%，從抗體陽性率的結果來看三組黏膜免疫組從高到低依次為C＞B＞A；在免疫后180 d內，抗體陽性率的變化趨勢如圖4。

圖3 免疫后不同時間各組奶牛的抗體效價變化

圖4 免疫后不同時間各組奶牛的布病虎紅平板凝集試驗抗體陽性率

綜合抗體陽性率和抗體效價，三種黏膜免疫方式中以陰道灌注的抗體反應最強，顯示其是最佳的激發抗體免疫反應的黏膜免疫途徑。

2.3 不同時間細胞因子水平的比較 四組試驗牛在試劑盒所能檢測到的范圍內IL－2、和IL－4的水平未發生變化，僅IFN－γ有顯著變化，由圖5可知，B組、C組在免疫后7 d，A組、D組在免疫后20 d IFN－γ分泌量達到最高值，之后持續下降，黏膜免疫組中陰道免疫組的IFN－γ分泌量為最高，僅次于注射免疫。從IFN－γ分泌量上來看，三組黏膜免疫牛由高到低依次為C＞B＞A。

圖5 免疫后不同時間各組奶牛外周血淋巴細胞IFN－γ分泌量的變化

3 討論

眼部滴注、口腔噴注、陰道灌注三種黏膜免疫方式皆存在不同程度的排菌情況。陰道灌注是3種黏膜免疫方式中排菌最少的，因此，陰道灌注可作為奶牛黏膜免疫的首選方式。若想進一步降低或消除黏膜免疫的排菌問題，可探索更加安全的布病疫苗如凝膠劑型等，液態疫苗接觸動物黏膜后相變為凝膠態，可能消除或降低疫苗經黏膜免疫后的排菌風險，進一步提高疫苗的利用率和免疫對從業人員的安全性。

從抗體陽性率和抗體效價變化曲線上看，注射免疫組抗體陽性率和抗體效價均最高，但由于抗體長期持續，最長可持續18個月［7］。因此選擇免疫抗體反應弱的黏膜免疫途徑就受到國內外研究者的普遍關注。從本研究結果分析，黏膜免疫與注射免疫相比，抗體陽性率存在顯著差異。陰道灌注的免疫抗體反應整齊，抗體效價較高，表明其體液免疫反應略強于其它的黏膜免疫途徑，而抗體持續時間卻無明顯延長，三種黏膜免疫抗體對臨床布病檢測的時間影響無明顯差異。據文獻報道，羊點眼免疫后180 d可作為免疫與感染鑒別診斷的一個分水嶺［8］，從本試驗結果來看，180 d黏膜免疫組RBT檢測的陽性率為0%，與報道一致。

從細胞因子IL－2、IL－4、IFN－γ的分泌情況上分析，布氏菌疫苗免疫后細胞因子IL－2、IL－4無明顯變化，但IFN－γ的分泌量顯著提高，表明IFN－γ在抵抗布魯氏菌感染中可能發揮重要作用。三種黏膜免疫方式中以陰道灌注免疫激發的IFN－γ水平最高，預示其對細胞免疫的激發作用最強。據報道，布魯氏菌感染IFN－γ缺陷小鼠后，促使小鼠很快發生死亡，這證實了IFN－γ在機體抗布魯氏菌感染中的重要性［9］。布魯氏菌在侵入機體后首先在巨噬細胞內存活［10］，并激發機體先天性免疫系統反應［11］，但有研究表明，先天性免疫應答并不能有效抵抗布魯氏菌在體內的感染和復制［12］。獲得性細胞免疫應答主要是通過IL－12、TNF－α和IFN－γ等細胞因子通過增強M1巨噬細胞的殺菌和抗菌活性從而在抵抗布魯氏菌感染中起主要作用［13］。本試驗的細胞因子分泌水平主要監測至免疫后60 d，60 d時IFN－γ水平顯著下降后未進行后續追蹤，Elaine MSDorneles等［6］監測S19免疫小牛后0 d、28 d、210 d、365 d、393 d、575 d的IFN－γ水平，在28 d達到最高后降低，之后又在393 d有一次小升高，這充分揭示了細胞免疫應答在布魯氏菌感染中的重要作用，也為疫苗免疫后保護力持續存在提供了一個參考。

本試驗從免疫排菌、免疫激發抗體與幾種細胞因子水平三個方面來評價布魯氏菌疫苗3種黏膜免疫途徑的效果，結果表明，陰道灌注是奶牛布病黏膜免疫的較優方式。與注射免疫相比，陰道灌注后奶牛免疫抗體水平下降快，持續時間短，對檢測感染抗體的干擾時間短，有利于布病監測與診斷的開展。研究提示，有必要進一步開展布病疫苗陰道灌注保護力和安全性研究，以充分證實布病疫苗陰道灌注免疫的價值。

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（編輯：李文平）

Immune Effect and Bacterial Excretion of Dairy Cattle Vaccinated w ith Live Attenuated Brucellosis Vaccine via Different Mucosal Immunization Approaches

WANG Miao－miao1，XU Lei1，WANG Nan1，ZHANG He1，2，ZHANG Jin－ya1，CAO Ru－zhou3，GUO Zhi－gang3，YANG Hong－jun4，MAO Kai－rong1?
（1.China Institute ofVeterinary Drug Control，Beijing100081，China；2.Beijing University ofAgriculture，Beijing102206，China；3.Modern Farming，Maanshan，Anhui243111，China；4.Dairy Cattle Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan250131，China）

To investigate the effects of differentmucosal immunization approaches on humoral immunity response，cellular immunity response and brucella excretion situation of dairy cattle vaccinated with live brucellosis vaccine，80 cows（10～12 months old）were divided into four groups（20 for each group）.The cowswere inoculated with Brucella A19（B.abortus）by eye infusion（group A），oral injection（group B），vaginal perfusion（group C）and subcutaneous injection（group D）respectively with same full standard dose.The brucella excretion situation within 7 days after immunization for group A，B and C，the antibody changes within 180 days and cytokines secretion（IFN－γ，IL－2，IL－4）within 60 days for group A，B，C and D were checked.The results showed thatbrucella excretions of threemucosal immunization approaches were lasted for 5 days and reached highest within the first day；the brucella excretion of group C was the lowest compared to group A and B；the antibody titer and the duration of antibody positive rates of group A，B，C were significantly lower than group D，for all the cows the antibody titer reached the peak on 20 dpi，furthermore group C had the highest antibody level compared to other twomucosal immunization groups；the antibody positive rates of group A，B，Cwere all0%on 120 dpi，120 dpi，150 dpi respectively while the antibody positive rate of group D was 35%on 180 dpi；tested groups’IFN－γ excretions reached the peak on 7 dpi（group B and group C）or 20 dpi（group A and group D）while the IL－2 and IL－4 secretion had no significantly change，IFN－γexcretion of group C was themost among all themucosal immunization groups and a little lower than group D.Our results indicate that vaginal perfusion is amuch better approach for vaccination of dairy cattle with live attenuated brucellosis vaccine.

Brucellosis vaccine；mucosal immunization；brucella excretion；antibody titer；cytokines secreting

2017－02－24

A

1002－1280（2017）04－0001－05

S859.797

北京市科技計劃（Z161100000616009）；北京市科技新星計劃（Z141107001814013）

王苗苗，碩士研究生，從事布魯氏菌病疫苗研究。

毛開榮。E－mail：13621394758＠163.com