肉桂酸衍生物抗PRV及其作用機制研究

姚苗苗郭楊麗孫耀貴孫娜喬美娟雷海民王鵬龍李宏全?

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.北京中醫藥大學中藥學院，北京100029）

肉桂酸衍生物抗PRV及其作用機制研究

姚苗苗1，郭楊麗1，孫耀貴1，孫娜1，喬美娟1，雷海民2，王鵬龍2，李宏全1?

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.北京中醫藥大學中藥學院，北京100029）

以豬偽狂犬病病毒（PRV）感染PK－15細胞，對27種天然化合物的抗PRV作用進行篩查，并探討抗PRV活性物質的作用機制。分別將27種天然化合物以不同方式作用于感染細胞，采用細胞病變法（CPE）和噻唑藍比色法（MTT）測定其細胞毒性及對病毒吸附、復制和直接殺滅的作用。在藥物與PRV共同作用于PK－15細胞24、48、72 h后，RT－PCR檢測PRV的代表基因IE180、UL30和UL22在胞內的表達量。結果顯示，肉桂酸衍生物（cinnamic acid derivative，CAD）具有抗PRV的活性，其EC50為（8.443±0.216）μg/mL，SI為6.6，最高抑制率為76%。3個時間點胞內IE180、UL30和UL22基因的拷貝數顯著降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性。結果表明，CAD對PRV有直接滅活作用，其作用機制是阻斷PRV在細胞內的生物合成過程，但CAD對PRV的吸附過程沒有阻斷作用。CAD可作為抗PRV的候選藥物。

肉桂酸衍生物；豬偽狂犬病病毒；抗病毒；天然化合物

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動物以發熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性傳染病。偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒家族中的α－皰疹病毒亞科，該病毒引起的仔豬疾病又稱為Aujeszky’s病［1］。豬是偽狂犬病病毒的自然宿主。除此之外，PRV還能夠感染大多數哺乳動物和一些鳥類動物，高級靈長類包括人在內對該病毒不易感［2］。PRV在世界范圍內的大多數國家對豬養殖業造成了嚴重威脅。偽狂犬病在全世界范圍內所造成的經濟損失每年高達幾十億美元［3］，僅次于口蹄疫和豬瘟。據報道PRV已在我國20多個省爆發并且造成了巨大的經濟損失［4］。目前，接種疫苗作為有效控制PRV病流行的唯一手段存在著諸多缺陷，尤其是病毒變異株的出現。阿昔洛韋（Aciclovir，ACV）于20世紀80年代上市，以其高效低毒被譽為抗皰疹病毒藥物發展史上的里程碑［5］。然而ACV耐藥株的出現早在20世紀80年代就有報道［6］。并且農業部已將其列入禁用獸藥名單。近年來，人們對天然產物的選擇性治療和自然療法越來越重視，尤其是植物提取物［7］。Gravina等研究槲皮素、桑色素以及反式肉桂酸體外抗馬Ⅰ－型皰疹病毒的活性時，發現槲皮素具有直接殺滅病毒、抑制病毒在細胞上吸附和穿入的作用；桑色素在直接殺滅病毒的同時抑制其吸附過程；反式肉桂酸通過抑制病毒在細胞上吸附過程發揮抗病毒作用［8］。從植物提取物中尋找具有抗病毒作用的天然化合物已成為研發抗病毒藥物的趨勢。

1 材 料

1.1 試劑 DMEM高糖培養基（Sigma產品）、胎牛血清（HyClone產品）、四甲基偶氮唑藍（MTT）（Amresco產品）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma產品）、DNA凝膠回收試劑盒（Omega產品）、小劑量快速質粒DNA提取試劑盒（Omega產品）、DNA Marker（DL1000、2000）、SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒（大連TakaRa公司）。T載體（含感受態DH5α細胞）購自北京全式金公司。

1.2 儀器 倒置熒光顯微鏡（IX81－F72FL/PH；日本OLYMPUS）、CO2培養箱（香港Heal force公司）、凝膠成像系統（江蘇捷達）、PCR儀（美國Biorad公司）、瓊脂糖水平電泳槽（DYCP－31E型，北京六一儀器廠）、實時熒光定量PCR儀MyiQTM2（美國Bio－rad公司）。

1.3 藥物 本試驗中所用到的藥物是由北京中醫藥大學雷海民教授提供，所有藥物具有明確的化學結構，均采用1%的DMSO進行溶解。母核結構式如圖1所示。

1.4 細胞和病毒 PK－15細胞（豬腎上皮細胞），購自中國獸醫藥品監察所。豬偽狂犬病病毒（PRV）購自中國獸醫藥品監察所，Bartha株，CVCC：AV249。

2 方 法

2.1 藥物細胞毒性測定 將藥物溶解后用細胞維持液連續2倍稀釋8個梯度，接種到PK－15細胞長至單層的96孔培養板里，同時設有細胞對照組，每個濃度梯度設4個重復，置50 mL/L CO2培養箱37℃培養。每天觀察并記錄細胞病變情況，72 h后采用MTT法測定各試驗組OD值。計算藥物毒性導致細胞病變的病變率（Cytopatic ratio，CR），并通過GraphPad PrismTM軟件計算出半數安全濃度（50%cytotoxic concentration，CC50）和最大安全濃度（maximum no－cytotoxic concentration，MNTC）。病變率在10%以下對應的藥物濃度即為藥物的MNTC［9］。

圖1 試驗所用27種藥物的結構式

2.2 病毒毒力的測定 將PK－15細胞接種到96孔細胞培養板，密度為1.5×105個/mL，每孔100μL，待細胞長至單層，將病毒按照10－1～10－9連續10倍倍比稀釋，接種細胞，100μL/孔，每個稀釋度6個重復，放置37℃、50mL/L CO2培養箱里培養，每日觀察細胞病變效應（Cytopathic effect，CPE），72 h后記錄每孔細胞病變情況，病毒的毒力采用病毒的半數感染量（Tissue culture infective dose，TCID50）表示，按照Reed－Muench公式計算［10］。

釋數對數之間的差＋＞50%病變率的稀釋度的倍數

2.3 藥物對PRV感染細胞的抑制作用 首先將初濃度為2倍MNTC的藥液連續2倍倍比稀釋，然后與濃度為200 TCID50病毒液等體積混合（混合后藥物最大濃度為MNTC，依次縮小2倍，病毒液的終濃度均為100 TCID50），加到長至單層PK－15細胞的96孔培養板上，藥物共設有8個梯度，每個梯度4個重復，同時設有細胞對照組、病毒對照組和陽性藥物對照組（ACV），置50 mL/L CO2培養箱37℃培養，每24 h顯微鏡下觀察并記錄CPE，待病毒對照組CPE達到80%～90%時，記錄各孔病變情況，采用MTT法測定各試驗組OD值，計算藥物對病毒的抑制率（In?hibition ratio，IR）［11］。并通過GraphPad PrismTM軟件計算半數有效濃度（50%effective concentration，EC50）。計算選擇指數（selection index，SI），SI＝CC50/EC50。篩選出最大抑制率（maximum inhibition ratio，MIR）高于50%且SI＞3的藥物做后續抗病毒機制試驗研究［12－13］。

為了進一步研究藥物抗PRV的作用機制，確定藥物在病毒生物合成過程中的作用靶點，通過以下試驗初步判斷藥物抗PRV的機制。

2.4 藥物對PRV的直接滅活作用 將藥物與病毒液等體積混合（混合后藥物終濃度為MNTC，病毒終濃度為100 TCID50），置于37℃，50mL/L CO2培養箱里分別孵育30、60、90、120、150、180、210 min，加到長至單層的PK－15細胞上，每個時間點設4個重復，同時設細胞對照組和病毒對照組，繼續培養，待病毒對照組病變達到80%～90%時，觀察并記錄各孔細胞病變情況，采用MTT法測各試驗組OD值，計算藥物對病毒的抑制率。

2.5 藥物對PRV復制的影響 先將PRV病毒液（濃度為100 TCID50）作用于長至單層的PK－15細胞上，置37℃、50 mL/L CO2培養箱分別吸附1、2、4、6、8、10、12、14 h，棄病毒液，PBS沖洗兩遍［14］，加入最大安全濃度的藥物，每個時間點設4個重復，同時設細胞對照組和病毒對照組，繼續培養，待病毒對照組細胞病變達到80%～90%時，觀察并記錄各孔細胞病變情況，采用MTT法測定OD值，計算藥物對PRV復制作用的抑制率。

2.6 藥物對PRV吸附的影響 先將最大安全濃度的藥物加到長至單層的PK－15細胞上，置37℃、50mL/L CO2培養箱里分別培養15min、30min、1 h、2 h、4 h、6 h，每個時間點4個重復，再置4℃預冷1 h，棄上清，PBS洗兩遍，加入100 TCID50病毒液，4℃繼續培養2.5 h，轉至37℃、50mL/LCO2培養箱內培養。同時設細胞對照組和病毒對照組。待病毒對照組細胞病變達到80%～90%時，觀察并記錄各孔細胞病變情況，采用MTT法測定各試驗組OD值，計算藥物對PRV吸附作用的抑制率。

2.7 RT－PCR檢測藥物對PRV IE180、UL30、UL22基因拷貝數的影響

2.7.1 重組質粒的制備 長至單層的PK－15細胞接種PRV病毒液，置37℃、50mL/LCO2培養箱內培養60 h，收集細胞樣品。提取細胞培養物總RNA。參照反轉錄試劑盒說明書將其反轉錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴增PRV IE180、UL30以及UL22基因。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將目的條帶割膠回收，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書回收PRV IE180、UL30、UL22基因DNA片段。將回收純化的目的基因與T載體進行連接，轉入DH5α感受態細胞中，200μL的轉化菌液涂布于不同的LB/Amp/X－Gal/IPTG平板培養基上，置于37℃培養箱培養12～16 h至形成單菌落，挑白色菌落在LB液體培養基繼續培養12～16 h，以擴增質粒。按照質粒抽提試劑盒說明書提取重組質粒。重組質粒在上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定，這3個基因的特異性引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7.2 標準曲線的制作 按照參考文獻［15］，分別以10倍倍比稀釋的重組質粒為定量檢測模板，使用相應基因的特異性引物，進行SYBR Green RT－PCR擴增，獲取擴增曲線和標準曲線，標準曲線橫坐標代表起始拷貝數，縱坐標代表CT值，只需獲得未知樣品的CT值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

2.7.3 實時熒光定量檢測藥物對病毒基因拷貝數的影響 PK－15細胞接種到6孔細胞培養板，密度為1.5×105個/mL，長至單層后將培養基棄掉，每孔接種1 mL病毒液和1 mL藥液，病毒液終濃度為100 TCID50，藥液終濃度為最大安全濃度和二分之一最大安全濃度，同時設有細胞對照組，病毒對照組和ACV對照組，每組3孔重復。培養箱內分別培養24、48、72 h后收集細胞，每孔細胞加入1 mL TRIzol試劑提取總RNA并反轉錄為cDNA。進行SYBR Green RT－PCR擴增，檢測不同時間點藥物對PRV IE180、UL30、UL22基因拷貝數的影響。

反應體系：10μL的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（2×），上下游引物各0.8μL，cDNA模板1.0μL，dH2O補足到20μL。

反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，UL22基因、UL30基因、IE180基因的退火溫度分別為59℃、59℃、61℃，進行30 s，共40個循環，95℃10 s，熔解曲線起始溫度為65℃，終點溫度為95℃，每升高0.5℃持續5 s。

3 結果與分析

3.1 藥物對細胞的毒性試驗 通過MTT法以及顯微鏡下所觀察記錄的細胞病變情況綜合測定待測藥物對正常細胞的毒性，確定供試藥物和ACV的最大安全濃度（MNTC）和50%毒性濃度（CC50）（表2）。

表2 所有藥物的細胞毒性試驗和抗病毒試驗結果

3.2 病毒毒力的測定結果 PRV作用于PK－15細胞，72 h后根據每孔細胞病變情況，最終計算得出PRV在PK－15細胞上的TCID50＝10－5.6，其意義是指將0.1 mL病毒濃度為10－5.6的PRV病毒液接種PK－15細胞上后，最終可使50%細胞感染PRV。

3.3 藥物的抗病毒試驗結果 通過研究27種供試藥物對PRV的抑制作用，表明只有CAD在PK－15細胞上具有有效抗PRV的作用，明顯阻斷了由PRV導致的細胞病變，選擇指數SI為6.6，其抑制率為76%，高于陽性藥物ACV的抑制率（68%），最大安全濃度為15.625μg/mL，遠遠小于ACV（500μg/mL）。顯微鏡下觀察，病毒感染48 h和72 h后，與病毒對照組相比，藥物處理組的細胞病變程度都明顯減輕，而且隨著藥物濃度的降低，細胞病變程度逐漸接近于病毒對照組。同時從藥物的量效曲線可以看出，藥物抗PRV的作用呈現劑量依賴關系，隨著藥物濃度的降低，抗病毒效果也相應減弱（圖2），與眼觀結果一致。

圖2 CAD 48 h和72 h抗PRV感染PK－15細胞的作用

3.4 藥物對PRV直接殺滅作用的結果 將藥物與病毒液混合后放置37℃、50 mL/L CO2培養箱分別孵育30、60、90、120、150、180、210 min后作用于PK－15細胞，測定其抗病毒作用。用MTT法確定藥物的抑制率，數據由3次獨立重復試驗所得，表示為mean±SD。藥物在所測試的7個不同時間點內抑制率差異不顯著，P＞0.05。結果表明，CAD能夠直接殺滅PRV，由表3得出各不同孵育時間點之間差異不顯著（P＞0.05），說明藥物對PRV的直接殺滅作用不呈現時間依賴性。

表3 CAD對PRV直接滅活作用結果

3.5 藥物對病毒復制阻斷作用的結果 在PRV感染PK－15細胞后不同時間點添加藥物，對PRV的增殖均無抑制作用。這一結果表明CAD對PRV整個復制過程沒有阻斷作用。數據見表4。

3.6 藥物對病毒吸附阻斷作用的結果 先將藥物與細胞在37℃、50 mL/L CO2培養箱共培養不同時間點，再感染PRV，檢測CAD能否與細胞表面上的受體互作，從而阻斷PRV吸附到PK－15細胞上最終發揮抗PRV作用。結果表明，無論藥物與細胞作用多長時間，藥物都不能阻斷PRV吸附到PK－15細胞上最終引起細胞病變。數據見表5。

圖3 CAD分別在不同時間點對PRV的直接滅活作用

表4 CAD對PRV復制阻斷作用結果

表5 CAD對PRV吸附阻斷作用結果

3.7 熒光定量PCR檢測藥物對IE180、UL30、UL22基因拷貝數影響結果

3.7.1 藥物對PRV IE180基因拷貝數的影響 在24 h和48 h，CAD和ACV均能有效下調IE180基因的表達量，各試驗組IE180基因拷貝數與病毒對照組比較差異顯著（P＜0.001或P＜0.01），而且CAD對IE180基因的下調作用強于陽性藥物，同時CAD對基因表達量的影響呈現劑量依賴性。72 h時，各試驗組IE180基因拷貝數與病毒對照比較，CAD在15.625μg/mL時可顯著降低IE180基因表達量（P＜0.01），CAD在7.8125μg/mL和ACV處理組對IE180基因的表達量沒有顯著影響（P＞0.05）。

3.7.2 藥物對PRV UL30基因拷貝數的影響 在24 h，48 h和72 h，CAD和ACV均使UL30基因表達量下調，不同處理組UL30基因拷貝數與病毒對照組比較差異顯著（P＜0.001）。24 h時，CAD對UL30基因表達量的下調作用比ACV強，隨著時間的增加，48 h和72 h時，ACV對UL30基因表達量的抑制作用要強于CAD。

3.7.3 藥物對PRV UL22基因拷貝數的影響 在24 h，48 h和72 h，CAD和ACV均使UL22基因拷貝數下調，而且CAD對基因的下調呈現劑量依賴性。在病毒感染的3個時間點，與病毒對照組相比，陽性對照組和CAD（15.625μg/mL）均能極顯著降低UL22基因的表達量（P＜0.001）。當CAD的使用濃度在7.8125μg/mL時，能夠顯著降低UL22基因在24 h（P＜0.05）和48 h（P＜0.001）的表達量。

4 討論與小結

許多天然化合物之所以被視為抗病毒制劑，是因為它干擾了病毒生物合成的一個或者多個環節，或者將細胞外的病毒粒子直接殺滅，最終，這些化合物將成為臨床用藥的候選藥物［16］。本試驗通過藥物不同的作用方式，分析藥物對病毒復制、吸附以及直接殺滅三方面的影響，初步確定藥物抗病毒機制。

進行體外抗病毒藥物篩選，藥物對病毒抑制率大于50%而且SI大于3時，將其視為有效藥物。CAD在PK－15細胞上的最大安全濃度為15.625μg/mL，遠遠小于阿昔洛韋（500μg/mL），半數毒性濃度（CC50）為55.4μg/mL。通過藥物抗病毒試驗得到，CAD的半數抑制濃度（EC50）和最大抑制率分別為8.443μg/mL、76%，SI為6.6。該藥物抗病毒的作用與藥物濃度具有線性關系，即藥物需在一定的濃度區間才能發揮藥效，過高濃度的藥物會對細胞造成損傷，過低濃度的藥物將失去抗病毒能力，藥物抗病毒作用呈劑量依賴性。

圖4 不同時間點CAD對IE180基因拷貝數的影響（???表示P＜0.001，??表示P＜0.01）

圖5 不同時間點CAD對UL30基因拷貝數的影響（???表示P＜0.001）

圖6 不同時間點CAD對UL22基因表達水平的影響（???表示P＜0.001，?表示P＜0.05）

Carvalho等研究黃酮類以及酚酸類化合物體外抗犬瘟熱病毒（CDV）作用時，通過不同時間點藥物添加試驗發現，肉桂酸在0 h（肉桂酸與CDV病毒同時作用于細胞）以及2 h（CDV感染細胞2 h后再添加肉桂酸）發揮抗CDV的作用。然而反式肉桂酸在－1 h（肉桂酸與細胞作用1 h后再感染CDV）和0 h（肉桂酸與CDV病毒同時作用于細胞）具有抗CDV的作用［17］。本試驗中先將CAD與病毒在37℃分別孵育不同的時間，然后共同作用于PK－15細胞，試驗結果表明，CAD在30 min內就可將PRV滅活。

在檢測CAD對PRV胞內復制過程的影響時，分別在病毒感染PK－15細胞不同時間段（2～14 h）后，加入CAD，用MTT法檢測其對PRV的抑制率。結果發現，無論是在病毒感染后1 h或者14 h后添加藥物，均沒有抑制PRV在PK－15細胞上的增殖，因此CAD不影響胞內病毒的復制過程。

文獻報道，PRV病毒粒子首先由囊膜糖蛋白gC與細胞膜基質層上硫酸乙酰肝素受體互作，然后由囊膜糖蛋白gD特異性的與細胞上受體進一步結合，加強病毒與細胞之間的作用［18］。為了檢測CAD能否干擾PK－15細胞上與PRV結合的受體，最終抑制病毒的吸附過程發揮抗病毒作用，先將藥物與細胞分別在37℃共孵育不同的時間（15 min～6 h）后，再感染PRV，放置4℃進行吸附。因為4℃條件下，病毒可以完成對宿主細胞的吸附過程，卻不能穿入細胞內［19］。結果表明，CAD抗PRV的作用不是通過影響宿主細胞膜特性阻斷病毒的吸附來實現的，推測藥物沒有與細胞表面糖蛋白gC、gD互作來影響病毒的吸附過程。

為了進一步探索藥物在胞外直接殺滅PRV病毒粒子后對胞內PRV生物合成的影響，分別在PRV立早期基因（IE）、早期基因（E）和晚期基因（L）中選擇一種代表基因，采用熒光定量PCR進行檢測。體內研究表明，IE180通過激活以下PRV基因的啟動子進而激活基因的表達，比如，US4（gG）、UL12（AN）、UL22（gH）、UL23（thymidine kinase）和UL41［20－22］。UL30為E基因，其編碼產物為病毒DNA復制過程中所必需的DNA聚合酶。UL22為L基因，其編碼產物為PRV囊膜糖蛋白gH。gH為病毒復制所必需的結構蛋白，對于病毒侵入靶細胞或感染細胞與鄰近細胞的融合，以及在小鼠神經系統中的增殖均是必需的。本試驗分別在24 h、48 h和72 h檢測CAD對IE180、UL30和UL22三個基因拷貝數的影響，結果表明，與病毒對照組相比，CAD（15.625μg/mL）在三個時間點都顯著下調了UL30和UL22基因的表達量（P＜0.001），在24 h和48 h顯著下調了IE180基因的表達量（P＜0.001）。

綜上所述，CAD在最大安全濃度下具有抗PRV的活性，其可能的作用機制是直接滅活細胞外完整的病毒粒子，推測CAD直接滅活病毒的機制與病毒包膜的改變有關，但其與病毒包膜的接觸方式以及對包膜形態與功能的影響還有待于進一步的研究證實。

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（編輯：侯向輝）

Cinnam ic Acid Derivative against Pseudorabies Virus and Its Mechanism sin vitro

YAO Miao－miao1，GUO Yang－li1，SUN Yao－gui1，SUN Na1，QIAO Mei－juan1，LEIHai－min2，WANG Peng－long2，LIHong－quan1?
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi030801，China；2.Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing100029，China）

27 kinds of natural compoundswere tested for their antiviral activity against pseudorabies virus（PRV）in PRV infected PK－15 cells and determined their antiviralmechanisms.Visualization with the cytopathologic effect（CPE）assay and the 3－（4，5－dimethyithiazol－2－yl）－2，5－diphenyltetrazolium bromide test（MTT）were used to assess the cytotoxic concentrations of compounds and the antiviral effects on viral adsorption，replication and virucidal activity after each compound incubating infected cells in different ways.RT－PCR is adopted to detect the influence of compounds on RPV representative genes（IE180，UL30 and UL22）expression when the compound and PRV simultaneously acted on the cells in 24 h，48 h and 72 h.The results showed that cinnamic acid derivative（CAD）has anti－PRV activity，the EC50valuewas（8.443±0.216）μg/mL，the selectivity indexeswas 6.6 and themaximum inhibition ratiowas76%.The copy numbers of IE180，UL30 and UL22 in cytoplasm are decreased apparently（P＜0.01）in a dose－dependentmanner at three various time－points after CAD and PRV acting simultaneously on the cells.It indicated that CAD could directly inactivate PRV in vitro and themechanism is inhibiting biosynthesis of PRV in cells rather than inhibiting PRV adsorption.CAD could be developed as new anti－PRV drugs for clinical application.

cinnamic acid derivative；PRV；antiviral；natural compounds

2016－10－28

A

1002－1280（2017）04－0006－10

S853.74

農業科技成果轉化資金（2014GB2A3000）

姚苗苗，碩士研究生，從事中藥調節動物免疫功能及其分子機制研究；郭楊麗，與姚苗苗為共同第一作者。

李宏全。E－mail：livets＠163.com