獸用生物制品檢驗中級工職業技能鑒定中革蘭氏染色問題分析及建議

張媛彭小兵徐磊王忠田王甲郭曄

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

獸用生物制品檢驗中級工職業技能鑒定中革蘭氏染色問題分析及建議

張媛，彭小兵，徐磊，王忠田，王甲，郭曄?

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

通過對參加獸用生物制品檢驗中級工職業技能鑒定的63名考生細菌革蘭氏染色結果進行分析，了解我國獸用生物制品生產企業細菌革蘭氏染色及顯微鏡操作能力的整體水平。63名考生對隨機選取大腸桿菌或金黃色葡萄球菌進行革蘭氏染色顯微鏡檢查，要求考生在規定時間內完成細菌革蘭氏染色并提交顯微鏡觀察結果。92%考生檢驗結果滿意（58/63）；8%檢驗結果不滿意（5/63）；最高分50分（滿分），最低分14分。體現出我國獸用生物制品生產企業檢驗人員的細菌染色顯微鏡觀察水平參差不齊，盡管大部分檢驗人員掌握了細菌革蘭氏染色及普通光學顯微鏡操作技能，但仍有小部分檢驗人員細菌染色及操作顯微鏡能力有待進一步提高。

革蘭氏染色；職業技能鑒定；獸用生物制品檢驗

2016年11月10日，獸用生物制品檢驗員職業技能鑒定（中級工）在中國獸醫藥品監察所舉辦。參考人員均為全國各獸用生物制品生產企業的檢驗人員，實際操作考核項目之一為細菌革蘭氏染色，擬通過此項目了解各企業對細菌革蘭氏染色及顯微鏡使用的操作能力。

革蘭氏染色法是細菌學上最經典的染色方法，1884年由丹麥細菌學家漢斯·克里斯蒂安·約阿希姆·革蘭創立。此染色方法可將細菌分為兩大類，即革蘭氏陽性（G＋）細菌和革蘭氏陰性（G－）細菌。革蘭氏染色結果是鑒別細菌的關鍵步驟之一，但是革蘭氏染色的結果可受許多因素的影響，有時錯誤的染色反應可導致錯誤的鑒定。在實驗過程中如果控制不好細菌涂片的取菌量、碘液媒染時間和乙醇脫色時間等因素，常常會出現假陽性或假陰性的實驗結果［1］。

1 材料與方法

1.1 考試樣品 大腸桿菌CVCC203株和金黃色葡萄球菌CVCC1882株，均為中國獸醫微生物菌種保藏管理中心保藏。革蘭氏染色液，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 考核內容與評分標準

1.2.1 基本素養（3分） 要求考生進實驗室要穿鞋套、工作服，戴手套、口罩、帽子；實驗結束后將廢棄物置于廢物袋中，廢物袋封口放于臺面上；將臺面上物品擺放整齊；洗手后離開實驗室。

1.2.2 制片（10分） 取潔凈載玻片一張，加1小滴無菌水，用接種環從培養基上挑取少量大腸桿菌或金黃色葡萄球菌培養物與水滴混勻后，從中央逐步向外圍涂開，涂成直徑為10～15 mm稀薄而均勻的圓形菌膜［2］。

1.2.3 火焰固定（10分） 待菌膜自然風干后，將玻片正面向上在酒精燈火焰上通過2～3次，使細菌固定于玻片上。

1.2.4 染色（15分） 在細菌涂片上滴加草酸銨結晶紫染色液，初染60 s，水洗。在細菌涂片上滴加碘液，媒染60 s，水洗。在細菌涂片上滴加乙醇，脫色30～45 s，水洗。在細菌涂片上滴加番紅染色液，復染60 s，水洗。

1.2.5 顯微鏡檢查（7分） 涂片干后，用油鏡作檢查，限時5 min內觀察到細菌。染成紫色為革蘭氏陽性菌，染成淺紅色為革蘭氏陰性菌。

1.2.6 檢驗記錄（5分） 考生需寫明試驗材料、操作步驟、正確描述細菌的顏色及形態，并判斷出是革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。

2 結果

2.1 考試結果 此次職業技能鑒定實際操作考核中關于細菌革蘭氏染色部分占50分，63名考生中最高滿分50分，最低僅得14分，扣分主要集中在制作涂片和記錄部分（表1）。

表1 63名考生細菌革蘭氏染色扣分情況

2.2 總體水平 63名考生中，細菌革蘭氏染色部分考核合格（不低于30分）58人，占全體考生的92%（58/63）；考核不合格5人，占全體考生的8%（5/63）。參考人員多為我國獸用生物制品企業在職檢驗員，結果顯示部分企業檢驗人員細菌染色及操作顯微鏡能力還有待進一步提高。

2.3 出現的主要問題分析及建議

2.3.1 基本素養部分 防護用具佩戴不齊全；操作完畢后沒有進行手部清洗就離開了考場。建議檢驗人員在進入實驗室后必須要佩戴防護用具，既是對操作人員的保護，也是防止人為污染檢驗樣品的有力措施。個人防護一般包括身體防護、呼吸防護、頭部防護、手部防護、足部防護幾方面，如果操作烈性病原微生物還要做好眼部防護。另外，人員在實驗結束后，要使用中性的清潔劑反復清洗雙手，使用過的防護用具要進行無害化處理，不能與其他垃圾混放。

2.3.2 制作涂片部分 沒有用玻璃筆在玻片上標記，而是用記號筆；玻片使用前沒有擦拭干凈，導致鏡下見到少許雜質；點燃酒精燈前沒有排氣；試管開啟前沒有用火焰對試管口進行灼燒；沒有在玻片上滴加無菌水而直接挑菌；制作的涂片太厚，細菌沒有分散均勻，而是聚集成團，造成染色不均勻，例如大腸桿菌，應是革蘭氏陰性桿菌，當涂片太厚時，菌體重疊堆積，鏡下觀察分辨不清是桿菌還是球菌，又因密集不易被脫色或脫色不完全而呈陽性反應；涂片太薄，菌體太稀少，觀察時不易找到細菌。建議在制作涂片前用玻璃筆在玻片上劃一圓圈或方框用于標記涂片區域，有利于對目標區域進行染色，更有利于在顯微鏡觀察時方便查找。涂片時挑菌應該適量，并不是越多越好，否則很容易造成涂片過厚，染色不均勻，也不利于觀察細菌形態及排列方式。

2.3.3 火焰固定部分 沒有待涂片自然干燥后再固定；忘記固定；固定時間太長造成細菌變形；固定溫度太低，固定不夠，菌體附著于玻片上不夠牢固，水洗時被水沖掉。固定的目的是為了殺死細菌，使涂抹于玻片上的菌體很好地附著于玻片上，防止被水沖掉，死的蛋白質比活的蛋白質著色力更強［3］。建議火焰固定時避免火焰直接烘烤破壞細菌形態，而是將玻片快速、多次通過火焰，一邊固定一邊用手背感受玻片溫度，玻片微燙即可。

2.3.4 染色部分 染液或脫色液添加不均勻，有的涂片邊緣部位未予以充分覆蓋，用上述在涂片區域用圓圈或方框予以標記的方法可以有效解決此問題。沒有充分倒盡上一步沖洗所用的水，致使下一步所加染液或脫色液濃度略有稀釋且均勻性差。脫色時間不正確，造成脫色過度或脫色不充分，脫色時間過度，造成革蘭氏陽性菌亦被脫色而被誤認為陰性菌，脫色時間不足，則革蘭氏陰性菌也因脫色時間不夠而誤認為是陽性菌；復染時間過長，遮蓋了初染的顏色；在水洗過程中，沒有將水沖到廢液缸中而是直接沖到了洗手池中；不是用水將染料沖掉，而是先倒掉染料再沖水；直接沖淋菌膜導致部分菌膜脫落；染色過程中污染手指。建議染色時間要適宜，媒染時間小于60 s時，不利于結晶紫、碘－碘化鉀復合物與細胞的結合，因而造成金黃色葡萄球菌呈假陰性染色結果，但對大腸桿菌染色結果無影響。反之，媒染時間超過60 s時，結晶紫、碘－碘化鉀復合物與細胞的結合過分牢固，容易使大腸桿菌呈假陽性染色結果，但對金黃色葡萄球菌染色結果無影響［4］。這是因為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞壁組成和結構不同。金黃色葡萄球菌脂類少，沒有外膜，所以，當用乙醇脫色時，由于乙醇既能抽提草酸銨結晶紫、碘－碘化鉀復合物，同時也能脫水，又因為沒有脂類外膜對水的屏蔽，水很容易被脫出，造成肽聚糖網眼縮小，染色劑不容易滲出，仍留在肽聚糖分子上，使脫色不明顯，仍顯紫色，故很難在復染時被番紅染成紅色。而大腸桿菌細胞壁脂類物質含量高，而且有脂類外膜，一方面阻止乙醇脫水時水外滲，從而保持原肽聚糖網眼大小；另一方面由于細胞壁中的脂類被乙醇溶解，而增加細胞壁通透性，乙醇很容易進入細胞內，將染色復合物提取出來，使菌體呈現無色，從而容易被番紅染成紅色［5］。

2.3.5 鏡檢部分 不會使用油鏡，加油過多或過少；不會調試顯微鏡，觀察不到細菌；鏡下視野效果不好，菌體不清晰、顏色不正，細菌過于密集或疏散、分布不均勻；超時。值得注意的是，在職業技能鑒定考核中，竟有1/4的學員在5min規定時間內無法使用顯微鏡觀察到細菌，隨后經考評員調節顯微鏡后均能觀察到，考生心理緊張是原因之一，但這也體現出企業加強顯微鏡使用等基本操作的培訓尤為必要。在使用顯微鏡觀察時，建議香柏油的用量以1～2滴、能淹到油鏡頭的中間部分為宜，用量太多則浸染鏡頭，太少則視野變暗不便觀察。當油鏡頭與標本片幾乎接觸時，不可再用粗調螺旋向上移動載物臺或下降油鏡頭，以免損壞玻片甚至壓碎鏡頭。

2.3.6 記錄部分 實驗材料記錄不全或錯誤；實驗步驟記錄不全、錯誤或過于簡單；菌體顏色描述不正確；菌體形態描述不正確（如球菌有的考生描述為圓圈，桿菌有的考生描述為圓狀體等）；革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌判斷不正確；記錄的內容和觀察到的不一致；未觀察到細菌卻寫出了細菌的顏色及形態。建議檢驗記錄要注重真實性、規范性及可追溯性。記錄內容一定要和實際操作的內容及觀察結果相一致，即記你所做；而且要盡可能的全面，既要包括材料信息，又要包括實驗細節；修改要規范，要保證記錄的原始性。

3 討論

盡管細菌的自動化鑒定彌補了傳統方法的局限性，但是形態學檢查對細菌鑒定仍有很重要的作用，也在一定程度上保證了儀器鑒定的準確性［6］。革蘭氏染色法是動物細菌性疾病診斷的一個傳統方法［7－9］。此外，革蘭氏染色法也是菌株篩選鑒定的經典方法［10－12］，獸用生物制品生產企業在研制新的細菌類疫苗，篩選生產用菌種過程中必須要通過革蘭氏染色對細菌進行形態學檢定，這是要求疫苗生產企業檢驗人員、研發人員必須掌握的一項技能。將革蘭氏染色作為獸用生物制品檢驗員職業技能鑒定的一個考核項目可以促使在培人員及從業人員重視、學習并熟練掌握此項細菌染色技術。

顯微鏡檢查不僅對制片、染色有嚴格的質量控制，而且對人員的素質要求較高。通過此次職業技能鑒定也暴露出來多數企業檢驗人員在實驗室工作基本素養方面或多或少地都存在一些問題，而且，近半數參考人員的檢驗記錄都不完善。獸用生物制品生產企業應不斷地加強對在崗位檢驗人員培訓，注重顯微鏡檢查等基本功訓練，提高細菌形態學的識別能力，規范檢驗記錄書寫，同時還要強化職業素質教育，強調實驗室工作的細節，杜絕生物安全隱患。

［1］沈杰.大腸菌群革蘭氏染色技術的實驗研究［J］.干旱環境監測，2008，22（1）：62－64.

［2］中國獸醫藥品監察所.獸用生物制品檢驗員［M］.北京：中國農業出版社，2013：116－122.

［3］周曼.影響革蘭氏染色結果的因素及原因分析［J］.標準計量與質量，2003，12：20－21.

［4］劉芬，趙韶星.革蘭氏染色三步法［J］.山西職業醫學院學報，2002，2（1）：54－56.

［5］李彥華.革蘭氏染色原理［J］.遼寧工程技術大學學報，2006，25：335－336.

［6］婁榮玲.形態學檢查法在臨床細菌鑒定中的應用［J］.檢驗醫學與臨床，2009，6（5）：381.

［7］卓瑪.犢牛副傷寒的診斷與治療［J］.中國畜牧獸醫文摘，2016，32（8）：171.

［8］胡唐雁，李志強.豬丹毒的診斷與治療［J］.中國畜牧獸醫文摘，2016，32（8）：186.

［9］吳義云.豬傳染性胸膜肺炎的診斷與治療［J］.中國畜牧獸醫文摘，2016，32（8）：192－193.

［10］徐旺燁，樊琛，喬薪瑗，等.34株雞大腸桿菌的分離鑒定及致病力分析［J］.中國動物傳染病學報，2016，24（4）：41－47.

［11］杜海燕，韓俊偉，李磊，等.某規模奶牛場隱形乳房炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗［J］.當代畜禽養殖業，2016，（9）：6.

［12］陳甫，趙暉，別連鈺，等.犬腸道乳酸有益菌的分離鑒定及生物學特性研究［J］.黑龍江畜牧獸醫，2016，（8上）：150－153.

（編輯：李文平）

Analysis of Problem s and Suggestion in Gram Staining among Occupation Skill Testing of Intermediate ClassW orker of Veterinary Biological Products Inspecting

ZHANG Yuan，PENG Xiao－bing，XU Lei，WANG Zhong－tian，WANG Jia，GUO Ye?
（China Institute ofVeterinary Drug Control，Beijing100081，China）

Results of Gram staining of bacteria from 63 inspectors who participated in occupation skill testing of intermediate classworker of veterinary biological products inspecting were analyzed，to understand the overall level of inspectors of veterinary biological products manufacturing enterprise on Gram staining and use of microscope.Each participant given a tube of E.coli or S.aureus solid culture had to accomplish Gram staining of bacteria and observe in amicroscopewithin a specified time（60minutes）.Fifty eight resultswere satisfied from total sixty three inspectors（92%）while five unsatisified（8%），and the highest scorewas50（fullmark）while the lowestgave 14，indicating that abiliies of inspectors of veterinary biological productsmanufacturing enterprise on Gram staining and use ofmicroscopeweremixed，mostof inspectorsmastered those skills and a small number of inspectors still needed to improve them.

Gram staining；occupation skill testing；veterinary biological products inspecting

2016－11－14

A

1002－1280（2017）04－0016－04

S852.61

張媛，副研究員，從事需氧菌類生物制品的檢測工作。

郭曄。E－mail：guoye＠ivdc.org.cn