液質聯用測定烏雞中氟喹諾酮的方法對比

徐少華，閆清華，劉國華，羅燕，譚磊

（深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東深圳 518005）

液質聯用測定烏雞中氟喹諾酮的方法對比

徐少華，閆清華，劉國華，羅燕，譚磊

（深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東深圳 518005）

以液相色譜-質譜/質譜法為基礎，在試驗前處理方面進行了優化，通過添加回收試驗和陽性樣品檢測，對比液相色譜-質譜/質譜法和優化后的前處理兩種方式試驗的結果。優化的前處理過程：稱取試樣3.0 g，加入提取液10 mL，經球磨機研磨，超聲波輔助提取，冷凍離心。移取上清液過固相萃取柱，移取凈化液3.00 mL氮吹至0.5 mL，加入流動相定容，過0.22μm膜上機。10、50、100、200、800、5000μg·kg-16個濃度建立標準曲線，相關系數R均> 0.998?；厥章试囼?0、50、200 μg·kg-13個濃度對比，回收率范圍為85.6%～102.2%，RSD≤3.92%。20份不同濃度陽性樣品，兩種方法檢測值的相對標準偏差為0.67%～19.6%。優化后的前處理方法不但操作簡單，省時省力，大幅降低檢測成本，而且測定值穩定可靠，可提高大批量雞肉中氟喹諾酮類藥物的陽性篩選效率。

液相質譜；氟喹諾酮；前處理；陽性樣品；烏雞

氟喹諾酮類（FQNS）藥物是一類人工合成的廣譜抗菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、體內分布廣泛、組織藥物濃度高、蛋白結合率低、使用方便、不良反應小及價格低廉等特點[1]。廣泛用于動物和人類的各種感染性疾病的治療。隨著在養殖中的廣泛應用，僅20多年，耐藥率已經達60%～70%[2]。FQNS類藥物殘留不但對人體有直接的危害，更為嚴重的是致病菌對其耐藥性正逐漸增強，且已發現某些FQNS具有潛在致癌性，其殘留問題已引起廣泛的關注，各種殘留檢測方法也應運而生[3]。

目前我國對FQNS的檢測已經常態化，各級監管單位都已將該類藥物監控作為例行任務。氟喹諾酮類藥物在烏雞中的檢出率比較高。獸藥殘留的檢測主要分兩個部分，即樣品前處理和儀器檢測，傳統的前處理方法費時費力，工作量占整個檢測過程的70%，分為提取、凈化、濃縮、復溶4部分。本試驗是將液相色譜-質譜/質譜法的前處理方法優化之后，在保證檢測結果的準確性的前提下，可以將工作量和檢測成本大大降低。

1 試驗材料

1.1 設備與儀器

設備與儀器包括球磨機、AB SECIX4500 LCMS、高速冷凍離心機、固相萃取柱裝置、氮吹儀、超聲波清洗器、默克超純水器。

1.2 試劑與材料

標準品：恩諾沙星（ENR）、環丙沙星（CIP）、達氟沙星（DAN）和沙拉沙星（SAR）均產自德國Dr. Ehrenslorfer公司，純度均≥99.6%，甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純。

提取液：80乙腈+20水+0.2甲酸；

流動相：10甲醇+90水+0.2甲酸；

Waters Oasis?HLB 6cc（200 mg）Extraction Car?tridges固相萃取儀小柱；

Waters Oasis?PRiME HLB 6cc（200 mg）Extrac?tion Cartridges固相萃取小柱。

樣品：烏雞肉均為市售經初步測定后選擇的陽性樣品。

2 試驗方法

2.1 儀器條件

流動相梯度條件見表1，質譜條件見表2。

色譜柱：Waters Acqdity ΜPLC@BEH C18 1.7 μm 3.0×100 mm；柱溫：40℃；進樣量：5.00 μL；離子化模式：ESI+；質譜掃描方式：MRM；離子源:電噴霧正離子源；電噴霧電壓：5 495 V；輔助氣溫度：500℃。

表1 流動相梯度條件

表2 質譜條件

流動相條件：流速為0.3 mL·min-1。

2.2 工作曲線

取FQNS標準儲備液（用甲醇溶解），用流動相稀釋定容，配置成工作液，濃度分別為10、50、100、200、800、5 000 μg·kg-1。

2.3 前處理步驟

2.3.1 方法一

按照國標前處理方法，參考液相色譜-質譜/質譜法。

2.3.2 方法二

準確稱取已切碎的試樣3.0 g，置于已裝好陶瓷珠的離心管中，加入提取液10 mL，經過球磨機充分研磨，放于超聲波清洗器中超聲5 min，置于冷凍離心機8 000 r·min-1，4℃條件下離心5 min。移取上清液5.0 mL于Waters Oasis?PRiME HLB 6cc（200 mg）Extraction Cartridges固相萃取小柱凈化，用玻璃試管接住過柱液，待提取液全部自然流出，無需擠干，將凈化液移取3.0 mL至帶刻度的5 mL試管中，氮吹至0.5 mL，加入流動相定容至1.0 mL，渦旋混勻0.5 min，過0.22 μm水相膜，待上儀器測定。

3 結果與討論

3.1 標準曲線及檢出限

氟喹諾酮類藥物保留時間、回歸方程、相關系數和檢出限見表3。由表3可知，以空白雞肉樣品為基質，添加濃度為20 μg·kg-1，按照上述方法二全過程進行預處理和測定，平行樣品n=7，根據各樣品檢測值，計算出平均值X（0.096 7 μg·L-1）及標準偏差Sb（0.003 91），當被分析物的回收率在70%～120%時，可計算檢出限如表3。

計算公式如下：檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X，其中k為置信因子，一般取3。Sb表示相對標準偏差。

3.2 回收率試驗對比

四種氟喹諾酮類藥物殘留加標回收率見表4。

表3 氟喹諾酮類藥物保留時間、回歸方程、相關系數和檢出限

表4 4種氟喹諾酮類藥物殘留加標回收率（n=2）

加標回收率試驗過程中，以兩種方法分別做單點定量，進行不同濃度梯度的回收率測定對比。通過空白基質樣品加標回收率試驗對比，加標水平在10、50、200 μg·kg-1時，通過方法一和方法二做雙平行回收率試驗，前處理優化后的方法回收率均穩定，數據準確可靠。與液相色譜-質譜/質譜法的試驗效果相近，表明該優化后的前處理方法比較穩定，可以用于大規模的檢測篩查，是較為理想的檢測方法。

3.3 陽性樣品實測結果對比

陽性樣品試驗結果以及相對標準偏差見表5。

由表5可知，選取20份不同濃度等級的烏雞肉陽性樣品通過方法一和方法二兩種前處理方法進行雙平行試驗測定，在烏雞肉陽性樣品檢測中，通過兩種不同前處理方法，試驗測定的結果存在一定偏差，測定出的恩諾沙星濃度范圍為2～5 100 μg·kg-1，環丙沙星測定濃度范圍為4～100 μg·kg-1，同一份樣品兩種方法檢測平均值的相對標準偏差范圍為0.67%～19.6%，82.6%的檢測結果通過方法一前處理的陽性樣品檢出值要稍高于方法二，但是提取效果接近?？赡苁且驗榉Z酮類藥物更容易從肌肉組織中提取出來，方法二中直接用乙腈水溶液作為提取劑的效果不如方法一的提取劑。但是由于雞肉中富含大量脂肪和蛋白質，在液相色譜-質譜/質譜法的前處理方法過程中，EDTA-Mcll?vaine緩沖液會攜帶大量蛋白質、脂肪、氨基酸等干擾物質，樣品組織提取液一般呈渾濁狀態，即使通過冷凍離心，仍然無法有效去除干擾物，提取液進入固相萃取柱后，凈化效果并不理想，而且會造成小柱的堵塞，前處理6個樣品的時間約為6 h，增大了殘留藥物檢測難度。通過改進后的方法二進行前處理，6個樣品的時間縮至約2 h，而且步驟簡單，回收率高，檢測結果穩定，在保證一定的測定準確度的前提下，可以大幅提高工作效率，并且節省耗材及人工成本。鑒于我國日益重視食品安全問題，政府加大對畜禽產品的檢測監督工作的背景下，可借鑒該改進后的前處理方法，在成本一定的情況下，相對于液相色譜-質譜/質譜法可以成倍增加檢測篩查批次，在食品安全監控方面起到更加高效的監測目的。

表5 陽性樣品實驗結果以及相對標準偏差

[1]張家禾,孟婷,周作紅,等.動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測方法的研究進展[J].中國畜牧獸醫,2014,41（5）:262-266.

[2]潘媛,牛華,程曉云,等.高效液相色譜法檢測六種氟喹諾酮類獸藥殘留前處理的優化[J].分析試驗室,2011,30（5）:69-72.

[3]邊永玲,李秀娟,郭建.氟喹諾酮類獸藥殘留檢測方法研究進展[J].中國農學通報,2008,24（6）:28-31.

LC-MS Method of Determination of Fluoroquinolone in Silkie

XU Shaohua,YAN Qinghua,LIU Guohua,LUO Yan,TAN Lei

（Shenzhen Agricultural Product Quality Safety Inspection Testing Center,Shenzhen 518005,Guangdong China）

Based on liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,the test pretreatment was opti?mized,by adding the recycling experiment and positive samples test,compared with liquid chromatography mass spec?trometry/mass spectrometry and the optimized pretreatment results.Optimization of pretreatment process:took sample 3.0 g adding extract 10 mL,grinding by ball mill,ultrasonic assisted extraction and refrigerated centrifuge.Moving the clear liquid to the solid phase extraction column,the purified liquid 3.00 mL nitrogen blowing to 0.5 mL,adding mo?bile phase capacitance over 0.22 um membrane computer.Test selected 10,50,100,200,800,5 000 u g·kg-1six lev?els to establish standard curve,correlation coefficient R was greater than 0.998.Recovery experiment was 10,50,200 ug·kg-1three concentrations of contrast,recovery range 85.6%～102.2%,RSD 3.92%or less.Twenty different con?centration positive sample of the two methods,relative standard deviation was between 0.67%～19.6%.The optimized pretreatment method was not only the operation simple,save time and effort,greatly reduce the testing cost,and stable and reliable measurements.The method could improve the mass of the chicken positive screening efficiency.

liquid mass spectrometry;fluoroquinolone;preliminary treatment;positive samples;silkie

S859.79+6；S831

A

1001-0084（2017）03-0006-04

2017-01-24

徐少華（1991-），男，浙江衢州人，助理工程師，主要從事于獸藥殘留檢測工作。