黑龍江省豬場潛在腸出血性大腸桿菌分離鑒定及其遺傳相關性分析

孫奇，姜成剛

（1.黑龍江省獸藥飼料監察所，哈爾濱 150069；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，哈爾濱 150069）

黑龍江省豬場潛在腸出血性大腸桿菌分離鑒定及其遺傳相關性分析

孫奇1，姜成剛2*

（1.黑龍江省獸藥飼料監察所，哈爾濱 150069；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，哈爾濱 150069）

腸出血性大腸桿菌感染是由腸出血性大腸埃希桿菌（EHEC）引起的腸道傳染病。EHEC為出血性腸炎的病原，主要有大腸埃希桿菌O157 ? H7，是1982年新發現的一種致腹瀉大腸埃希桿菌。此外，其他血清型如O5、O26、O91、O111和O113大腸桿菌也對人類公共衛生造成嚴重威脅。黑龍江省養豬業發達，試驗在黑龍江省5個規模化豬場采集發生腹瀉的仔豬糞便樣品，進行腸出血性大腸桿菌分離鑒定及其遺傳相關性分析。

腸出血性大腸桿菌；仔豬；腹瀉；血清型

腸出血性大腸桿菌是重要食源性病原之一，可以引起嚴重的胃腸道疾病，包括致死性感染，在世界范圍內均有發病的報道[1]。EHEC不僅產生潛在細胞毒性，而且還獲得緊密方式粘附與腸粘膜上[2]。往往通過菌株攜帶的毒力因子而進行命名，因此菌株都攜帶溶血素毒力基因（大多數產生一個EHEC特異溶血素編碼的質粒，hlyA基因編碼），攜帶一種志賀菌株（stx1或stx2），許多菌株還產生致密素，97 ku粘附蛋白，由eaeA基因編碼[3-5]。雖然在世界各地大腸桿菌O157為主要EHEC血清表型，其他血清型如O5、O26、O91、O111和O113大腸桿菌也對人類公共衛生造成嚴重威脅[6]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2016年黑龍江省5個規模化豬場仔豬發生腹瀉，采集肛門拭子120份，至含15%甘油生理鹽水中，-20℃保存備用。

1.2 細菌分離鑒定

通過大腸桿菌顯色培養基（青島海博生物技術有限公司）分離純化菌株，并應用大腸桿菌生化試紙條API 20 E（法國梅里埃）及大腸桿菌特異性16SRNA基因PCR進行鑒定[7]。

1.3 毒力因子檢測

設計stx1、stx2、eaeA和ehxA基因引物，并送至上海invitrogen生物技術有限公司合成引物[8-10]。應用北京全式金生物技術有限公司Easy Pure Ge?nomic DNA Kit提取細菌DNA，2×EasyTaq PCR Su?per Mix試劑盒對目的片段進行擴增。反應體系：DNA模板4 μL，上游引物1 μL（10 mmo·L-1），下游引物1 μL（10 mmo·L-1），2×EasyTaq PCR Su?per Mix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，總體系25 μL。基因擴增反應條件根據文獻報道進行。取PCR擴增產物6 μL，點樣于1%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg·mL-1溴化乙錠），以DNA Marker DL2000作為標準分子量參照，在120 V的電場強度下，于1×TAE緩沖液中電泳30 min，結束后于凝膠成像系統觀察并拍照。

1.4 分離株血清型鑒定

在中國獸醫藥品監察所購買大腸桿菌O抗原陽性血清，按照使用說明書，利用玻板、試管凝集試驗測定O抗原類型。

1.5 藥物敏感性實驗

采用紙片擴散法（K-B）進行分離菌的藥物敏感性試驗。將菌液稀釋至0.5個麥氏單位，用滅菌棉簽蘸取菌液，均勻涂布于普通瓊脂平板表面，待平板表面干燥后，用小鑷子夾取抗生素紙片，按一定距離分別貼于平板上，置37℃恒溫培養24 h取出，用卡尺測量抑菌圈的直徑，根據NCCLS標準，判定其對各種藥物的敏感性[11]。分別選取四環素、環丙沙星、氨芐青霉素、哌拉西林、氯霉素、頭孢呋辛、鏈霉素、丁胺卡那霉素、頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、磺胺合劑共計12種藥敏紙片進行試驗。

1.6 菌株遺傳進化分析

采用基因間重復單位EIRC-PCR方法，合成引物EIRC2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'，PCR反應體系，總體積25 μL中10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，引物2 μL（10 pmol），TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA模板2.5 μL，雙蒸水15.5 μL；以TE代替模板做空白對照。PCR反應條件：94℃預變性2 min（第1個循環），然后94℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸4.5 min，以此進行35個循環，72℃延伸1min后結束反應[12]。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳1 h，凝膠成像儀觀察拍照，記錄結果。對于EIRC-PCR電泳指紋，用Quantity One軟件采用非加權配對算術平均法（UpGMA）聚類，生成分離菌株遺傳進化樹形圖。

2 試驗結果

2.1 菌株的分離

將肛門拭子接種到大腸桿菌顯色培養基，37℃培養24 h，挑取典型大腸桿菌藍綠色菌落接種到液體LB培養基純培養，經過生化反應和16SRNA PCR鑒定，共分離豬源大腸桿菌78株。

2.2 菌株毒力因子鑒定

毒力因子PCR檢測結果表明，有34株大腸桿菌攜帶ehxA基因，占總數的43.6%；有2株同時攜帶ehxA和eaeA基因；有1株同時攜帶ehxA、eaeA和stx1基因。

2.3 菌株血清型鑒定

經中國獸醫藥品監察大腸桿菌陽性血清凝集實驗結果表明，除2株未能鑒定出血清型，其余菌株分布于9種血清型中，優勢血清型為O92（9株）、O4（7株）和O26（5株），分別占總數的26.5%、20.6%和14.7%。同時2株攜帶ehxA和eaeA基因菌株血清型分別為O26和O92，1株，同時攜帶ehxA、eaeA和stx1基因血清型為O26。

2.4 菌株藥物敏感性

藥物敏感性試驗結果表明，臨床分離株對四環素耐藥性最高達100%，余下依次為環丙沙星為94.5%，氨芐青霉素為93.6%，哌拉西林為90.2%，氯霉素為82.6%，頭孢呋辛為78.6%，鏈霉素為66.7%，丁胺卡那霉素為57.2%，頭孢他啶為42.9%，慶大霉素為33.4%，妥布霉素為19.1%，磺胺合劑為18.3%。該豬場34株攜帶ehxA大腸桿菌均有不同程度的耐藥，而且均表現多重耐藥，最小3耐，最多11耐，平均達7耐。攜帶ehxA毒力基因大腸桿菌中，耐藥性均在6耐以上，其中O26血清型均在8耐以上，其中攜帶ehxA、eaeA和stx1 3種毒力基因的大腸桿菌為11耐，僅對妥布霉素敏感。

2.5 菌株遺傳進化分析結果

應用EIRC2引物對分離菌株DNA進行擴增，瓊脂糖電泳顯示在7 500 bp以下呈現大小不等的擴增片段，根據菌株條帶分子大小和個數的不同，應用Quantity One軟件，聚類方法采用UP? GAMA進行分析。從遺傳距離生成的樹形圖（附圖）可知，在相似性系數0.49時78株人腸桿菌明顯分成A、B、C、D、E、F、G、H，8個基因型，主要基因型為D型，19株菌，占分型菌株的24.4%；其次基因型為H型，16株菌，占分型菌株的20.5%；最少基因型為基因A型只有2株菌。34株攜帶ehxA毒力因子大腸桿菌分不在7個不同群，B群2株、C群3株、D群8株、E群8株、F群3株、G群4株、H群6株。同時攜帶ehxA和eaeA2株菌分別在H群和D群，同時攜帶ehxA、eaeA和stx1菌株在H群。

附圖 豬源大腸桿菌遺傳進化分析

3 討論

本研究報道了5個大型豬場發生腹瀉，對流行大腸桿菌特性進行分析，以往致豬腹瀉大腸桿菌常為K88、K99、F41、F18及987P[13]。而本研究關注點為致腹瀉大腸桿菌攜帶ehxA、eaeA及stx1和stx2的情況，以評價對人類潛在威脅，本研究表明，在黑龍江省發生仔豬腹瀉大型豬場中，分離大腸桿菌攜帶ehxA占43.6%，ehxA毒力基因以往研究表明在牛腹瀉病例中攜帶較高，在牛STEC菌株中溶血素毒力基因攜帶率為46.7%～70.0%，在豬源大腸桿菌中相關報道較少[14-15]。溶血素毒力基因廣泛分布在STEC菌株中，雖然該毒力基因引起腹瀉的機理還不是十分清楚，但這個基因與志賀毒素存在某些協同作用，其也常常用來判定產志賀毒素大腸桿菌的診斷標記物[16]。

大腸桿菌通常存在于動物和人類的腸道內。目前，大腸桿菌通常用來檢測飲用水是否安全的一項重要指標。有幾種途徑可以造成大腸桿菌對水源的污染，包括人類、養殖場、野生動物、水禽及寵物[17-18]。確定水源污染大腸桿菌來源途徑，對于建立正確風險評估機制和預防措施都十分重要。

在哺乳動物腸道內大部分大腸桿菌都是共生無害的，而某些菌株可以引起人類發生疾病。大腸桿菌可以產生志賀毒素（stx1和stx2），為產志賀毒素大腸桿菌（STEC），可以引起人類血性腹瀉以及潛在致命性疾病，包括溶血性尿毒血癥HUS和出血性腸炎，許多STEC菌株攜帶一個大的毒力質粒（60～121 kb），編碼各種毒力因子，包括溶血素毒力基因（由ehxA基因編碼）[19-20]。

一些致病性STEC菌株同樣攜帶位于染色體上的毒力島，簡稱腸道上皮細胞損傷位點（LEE），這些菌株通常稱為腸溶血性大腸桿菌（EHEC），LEE區域包含一個編碼Ⅲ型分泌系統編碼的基因和一個轉運蛋白，這些蛋白對于大腸桿菌的粘附及致病變作用是必需的，如致密素（由eae基因編碼），LEE對于大腸桿菌初級階段的感染起到重要作用，從病人分離菌株大多數發生HUS綜合征的STEC株往往都LEE陽性，然而這個區域引起人類疾病不是必需的，在發生HUS綜合征的病人分離菌株也存在缺少LEE毒力島的STEC菌株[19,21-22]。由于LEE區域基因遺傳保守型，檢測eae基因可以用來表明整個LEE區域的存在[23]。

本研究中分離的菌種共分布在17種血清型中，攜帶毒力因子的血清型主要為O92、O4和O26，其中血清型O26與其他哺乳類動物和人類大腸桿菌強致病性菌株相一致，存在不同種屬動物之間及動物與人類之間傳播的可能。由于抗生素濫用，豬源性細菌耐藥性也十分嚴重，本研究分離菌株呈現多重耐藥性，攜帶三毒力因子（ehxA、eaeA和stx1）菌株為11耐，超級細菌的出現正是攜帶超強毒力因子與超強耐藥基因的強強聯合的產物。

應用EIRC方法對分離菌株進行基因進化分析，結果表明攜帶毒力基因的菌株主要在H群和D群。攜帶毒力基因的質粒可以通過轉接和轉化等方式在菌株中互相傳播，使無致病力菌株或低致病力菌株變為強致病力菌株，耐藥性也可以通過耐藥質粒進行傳播，使致病菌的耐藥性進一步增強，如果不加以控制，動物源性的超級細菌就會慢慢產生，勢必對人類公共衛生安全造成巨大威脅[24]。

4 小結

綜上所述，攜帶ehxA毒力基因的豬源大腸桿菌可以引起仔豬腹瀉，ehxA可以編碼于噬菌體，導致其在大腸桿菌中持續傳播，在發生腹瀉豬大量分離到EHEC菌株。暗示豬也是EHEC一個重要宿主，也大大增加從養殖場傳播給人類潛在致病性，應該引起獸醫工作者足夠重視[25-32]。

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Isolation Identification and Genetic Correlation Analysis of Escherichia coliIsolated from Swine Farms in Heilongjiang Province

SUN Qi1,JIANG Chengang2*

（1.Heilongjiang Provincial Veterinary Medicine Feed Monitoring Institute,Harbin 150069,China；
2.Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China）

Enterohemorrhagic Escherichia coli infection is a kind of intestinal infectious disease caused by EH?EC.EHEC is the causative agent of hemorrhagic enteritis,mainly Escherichia coli O157:H7,was a new discovery in 1982 caused by diarrhea Escherichia coli.In addition,other serotypes such as O5,O26,O91,O111,and O113 also posed a serious threat to human health.The test collected fecal samples of diarrhea piglets,isolation and identification of Escherichia coli and analysis of the genetic correlations in Heilongjiang Province 5farms.

Escherichia coli;piglet;diarrhea;serotype

S828；S852.61+2

A

1001-0084（2017）03-0042-05

2017-02-14

孫奇（1989-），男，吉林長春人，助理畜牧師，研究方向為獸藥及飼料檢驗檢測。

*通訊作者：副研究員，E-mail:jcg5168@163.com。