八個抗稻瘟病基因在華南秈型雜交水稻中的分布

汪文娟周繼勇汪聰穎蘇菁封金奇陳炳馮愛卿楊健源陳深朱小源,*

(1廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州510640；2廣東省農業技術推廣總站，廣州510520；*通訊聯系人，E-mail:zhuxy@gdppri.com)

八個抗稻瘟病基因在華南秈型雜交水稻中的分布

汪文娟1周繼勇2汪聰穎1蘇菁1封金奇1陳炳1馮愛卿1楊健源1陳深1朱小源1,*

(1廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州510640；2廣東省農業技術推廣總站，廣州510520；*通訊聯系人，E-mail:zhuxy@gdppri.com)

【目的】已克隆的稻瘟病抗性基因Pi1、Pik-p、Pik-h、Pi2、Pi9、Piz-t、Pita、Pii對不同稻區的稻瘟病菌表現較廣譜的抗性，被廣泛應用于水稻抗瘟性育種。為了明確上述抗性基因在華南稻區雜交稻組合中的分布及其組合的抗病有效性,【方法】利用上述8個抗病基因的功能標記，對華南328個雜交稻組合進行了抗瘟基因型分子檢測。【結果】抗性基因Pita和Pii分布頻率最高，在測試組合中檢出率分別為84.76%與67.68%；其次是Pi2與Pik-p，分別為22.87%與13.72%；檢出頻率較低的是Pi1、Piz-t和Pik-h，分別為5.18%、3.35%與2.13%，檢測的品種都不攜帶抗性基因Pi9。在單個雜交稻組合中，檢出的抗瘟基因數量最多是4個。抗病性評價結果表明，雜交稻組合中檢出的抗病基因數量越多，其表現為抗病品種的頻率就越高；含4個抗病基因的雜交稻組合中，抗病品種所占比率達91.67%。含有不同抗瘟基因的組合表現出不同水平的抗瘟性，其中Pi2與Pi1對華南稻區稻瘟病的抗病性貢獻最大，其他抗病基因的貢獻大小依次是Pik-h、Pik-p、Pita、Pii與Piz-t?！窘Y論】本研究為華南稻區雜交稻抗病品種基因型的合理布局以及抗瘟基因的應用提供了科學依據。

雜交稻組合；抗病基因；稻瘟??；基因型分析；分子標記

水稻(Oryza sativa)是世界上重要的糧食作物，全球半數以上的人口以稻米作為主食[1]。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是威脅水稻糧食生產的最具毀滅性的病害之一[2]，發病輕時導致減產，嚴重時局部田塊甚至顆粒無收[3]。稻瘟病也是華南水稻生產中最重要的病害，近年來在華南發生日益嚴重，如華南稻區的天優998、五優308、天優368等主栽品種的抗性相繼衰退或喪失，在部分稻區發生了稻瘟病大面積流行或暴發，對糧食的生產安全造成了嚴重影響[4,5]。目前，選育和種植抗病水稻品種是防治稻瘟病最經濟、環保及有效的措施[6]。因此，摸清主栽品種與新選育的抗病品種的抗瘟基因型，是抗病品種科學應用的首要前提。

20世紀60年代中期，日本率先對水稻稻瘟病的抗病基因開展了系統的研究。隨后，源自不同水稻品種的90多個主效抗稻瘟病基因被鑒定[7]。近年來，國內研究者對已鑒定的部分抗稻瘟病基因進行了抗性有效性評價。李進斌等[8]分析了22個抗瘟基因在云南省3個稻區的抗性情況，發現Pi9和Piz5在云南稻區具有較好的抗性；楊健源等[9]的研究表明，華南稻區目前有效的抗性基因主要為Pi1、Pi2、Pita等；并且發現目前華南秈稻區育種者利用的抗瘟基因多為Pi1與Pi2[10,11]；張國民等[12]分析了24個抗瘟基因在我國寒地稻區的抗性情況，發現Pi9對該稻區的稻瘟病菌表現出廣譜抗性。然而，我國大部分稻區水稻品種的抗瘟基因型仍不清晰，有待分析與研究；該方面研究滯后的原因，主要是缺乏基因型快速有效的檢測技術。迄今，已經成功克隆出Pib、Pi9、Pi2、Piz-t、Pik、Pik-p、Pik-h、Pi1、Pita、Pii、Pi50和Pi64等26個稻瘟病抗性基因[13,14]。利用基因序列信息，發展特異性功能標記，可快速檢測品種的抗稻瘟病基因型[15,16]，這對全面了解我國水稻抗稻瘟病的基因型及其合理布局與輪換有著重要意義。

我們利用Pi1、Pik-p、Pik-h、Pi2、Pi9、Piz-t、Pita、Pii等8個抗病基因功能性分子標記，對華南稻區328個雜交水稻組合進行了抗瘟基因型檢測，旨在摸清該稻區雜交稻組合的基因型，為華南稻區抗病品種的合理布局及進一步選育新型的抗瘟雜交稻組合提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用材料包括328個近5年推廣及新參試的華南秈型雜交稻組合，其種子由廣東省省級水稻品種區域試驗主持單位提供。

水稻種子經0.5%強氯精消毒5 min，25℃清水浸泡24 h，濾干種子，置于35℃培養箱中催芽24 h。萌芽的種子以4行×6列的間隔穴播于盛有栽培泥土的瓷盤里（規格30 cm×20 cm×5 cm），每天澆水1～2次。待秧苗長至1葉1心期，每盆施0.5 g硫酸銨，每間隔3 d施用一次，共施3次。待植株長至2.5～3.0葉齡，進行標樣的采集。

1.2 病原菌材料、培養及接種調查

1.2.1 菌株來源

室內抗譜測定選用的50～64個菌株為單孢分離菌株，均采自主栽品種。這些菌株來源于廣東、廣西、福建等地，主要是根據當年或上一年稻瘟病菌生理小種的致病性測定情況挑選出的代表性菌株，對稻瘟病單基因系的致病性上具有豐富的多樣性；所有菌株均保存于廣東省農業科學院植物保護研究所。

1.2.2 菌株活化、繁殖及產孢

將保存的菌株轉移至酵母固體培養基，放于生化培養箱中，活化培養7 d以上；然后將菌絲體轉移到高溫高壓濕熱滅菌的玉米培養基上繁殖，在生化培養箱中培養約13 d。產孢：先用滅菌過的無菌水洗去玉米粒表面的菌絲，再將玉米粒置于已消毒的搪瓷盤中（25 cm×19 cm×2 cm）鋪開，并在上面覆蓋一層濕紗布，然后在日光燈下光照培養3～4 d進行產孢。以上菌株的活化、繁殖及產孢均在25℃下進行。

1.2.3 接種調查

用無菌水將附在玉米粒上的分生孢子洗下，用2層塑料細紗網隔去玉米殘渣，在100倍顯微鏡下鏡檢，選取濃度為5×105個/mL的孢子懸浮液進行人工噴霧接種；接種后的稻苗置于自制的相對濕度達95%以上的培養箱中暗培養24 h，溫度控制在25℃左右。之后轉至玻璃溫室中，接種7 d后進行調查。病級調查按照國際水稻所稻瘟病圃苗瘟分級標準進行：0～3級為抗，4～9級為感?？剐灶l率(%)為無毒的菌株數目與總測定菌株數目之比。

1.2.4 抗病性綜合評價

依據田間病圃鑒定與室內抗譜測定，綜合評價雜交稻組合的抗性。田間病圃分別設在廣東稻區的曲江、從化、龍川、陽江、信宜等5個自然病區。室內抗譜測定選用的菌株來源于廣東、廣西、福建等地，稻瘟病菌株均為單孢分離菌株，接種菌株數為50～64個。依據雜交稻組合在病區的穗瘟病級以及室內抗譜測定的數據，對組合做出綜合抗性評判，抗性級別由高至低排序為：高抗、抗、中抗、中感、感、高感等6個級別。調查與評價方法參照朱小源等[17]和馮愛卿等[18]的方法。

1.3 標樣采集及DNA提取

每個品種采集2個單株的葉片，混合收集于2.0 mL的離心管中，經液氮速凍后，置于-80℃的冰箱內儲藏備用。

首先將裝有水稻葉片的離心管放在液氮中浸泡約5 min，隨后用快速組織破碎儀磨碎葉片，再用百泰克生物技術(北京)有限公司的新型快速植物基因組DNA提取試劑盒，提取水稻葉片總DNA。

1.4 抗病基因Pi2、Pi9、Pita等8個基因特異性分子標記與檢測

1.4.1 抗病基因Pi2、Pi9、Pita等8個基因特異性分子標記

本研究中Pik-p、Pik-h與Pi1基因特異性分子標記是Zhai等[19]與Hua等[20]開發的Pik簇復等位基因間特異性分子標記。首先，基于日本晴參考序列與Pik簇等位基因序列間的較大差異，開發了K1標記，用于區分水稻品種含有的K型(Kusabue/K60)與N型(日本晴)兩種基因型[19,21]；其次，通過對Pik-m/Pik-p/Pik/Pi1及日本晴的感病等位基因編碼區進行序列比對，找出各等位基因特異的SNP，利用dCAPS Finder 2.0軟件(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)[22]，針對包含該SNP位點的序列,在其兩翼設計引物，開發出能區分Pik簇復等位基因Pik-p、Pik-h與Pi1的dCAPS標記。Pii特異性CAPS標記是Takagi等[23]根據Pii供體品種Hitomeborn與日本晴中pii感病等位基因序列比對，發現在PvuⅡ酶切位點處存在SNP多態性而開發的Pii-CAPS標記。Pi2、Pi9與Piz-t特異性分子標記依據華麗霞等[24]設計的標記。Pita基因特異性標記是通過將Pita全基因序列與日本晴的感病等位基因進行比對，找出特異的SNP，開發出能特異性地檢測Pita基因的dCAPS標記(未發表資料)。各標記的具體信息見表1。

1.4.2 抗病基因Pi2、Pi9、Pita等8個基因特異性分子標記的檢測

利用開發的Pi2、Pi9、Pita等8個基因特異性分子標記，對328個華南稻區雜交稻組合分別進行PCR擴增，并利用相應的限制性內切酶對PCR產物進行酶切，檢測各雜交稻組合的基因型。分子標記PCR擴增：反應總體積為20μL，其中包括水稻基因組DNA（20～30 ng/μL）1 μL，10× PCR緩沖液10 μL，各1 μL正反向引物（10 μmol/L），ddH2O 7 μL。PCR程序如下：94℃下預變性3 min；94℃下變性30 s，55℃～60℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，35個循環；72℃延伸5 min。PCR儀上擴增結束后，以各單管的PCR產物為模板，利用相應的限制性內切酶對PCR產物進行酶切，酶切體系為10 μL，其中，包括PCR產物10 μL，10×酶切緩沖液1 μL，限制性內切酶0.3 μL，ddH2O 3.7 μL。各單管酶切混合液，在相應內切酶最適宜的酶切溫度下(一般是37℃)酶切3 h，產物加入載樣緩沖液后，在6%～8%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測，電泳條件為120 V，2.5～3.0 h。

表1 各基因特異標記檢測引物Table 1.Specific marker detecting primers for each gene.

圖1 基于特異性SNP分子標記的水稻品種抗瘟基因檢測Fig.1.Detection of R genes in rice cultivars with specific SNP markers.

2 結果與分析

2.1 雜交稻組合的抗瘟基因型及其分布

本研究先利用能區別Pik位點K型/N型結構的引物K1，對328個雜交稻組合進行了抗瘟基因檢測，結果在211個雜交稻組合中檢測到含有K型的Pik等位基因簇；再利用Pik等位基因簇的Pik-p、Pik-h與Pi1的特異性SNP標記，對這211個K型品種進行Pik-p、Pik-h與Pi1基因型分析。結果發現，其中有45個品種含有Pik-p，有17個品種含有Pi1，有7個品種含有Pik-h。此外，利用Pi2、Pi9、Piz-t、Pita及Pii基因特異性SNP標記，分別對該328個雜交稻組合進行了抗瘟基因型檢測。結果表明，在這些雜交稻組合中絕大部分能檢測到Pi2、Pi9、Piz-t、Pita及Pii等抗病基因及其感病等位基因，部分基因特異性分子標記的檢測結果如圖1所示。

在檢測的雜交稻組合中，抗性基因Pita和Pii分布頻率最高，在測試組合中的檢出率分別為84.76%與67.68%；其次是抗性基因Pi2和Pik-p，分別為22.87%與13.72%。在這些雜交稻組合中，檢出頻率較低的抗性基因是Pi1、Piz-t與Pik-h，分別為5.18%、3.35%與2.13%。檢測的328個雜交稻組合都不攜帶抗性基因Pi9（圖2）。

2.2 雜交稻組合聚合的抗瘟基因數量分析

對328個雜交稻組合檢出的抗瘟基因數量進行分析，裕優132、恒豐優華占、吉豐優華占與金稻優618等12個雜交稻組合檢出了4個抗瘟基因，是檢出抗瘟基因數量最多的雜交稻組合，占總檢測組合的比率是3.66%。這12個組合中除都檢出了Pi2、Pii、Pita基因外，其中有5個組合檢出了Pi1基因，有7個組合檢出了Pik-p基因。天優613、天優173、永豐優9802與榮優華占等76個雜交稻組合檢出了3個抗瘟基因，占總檢測組合的比率是23.17%。在這76個雜交稻組合中，絕大多數品種都檢出了抗瘟基因Pii與Pita；檢出的另一個基因為Pi2、Piz-t、Pi1、Pik-p、Pik-h之一?；浟純?78、華兩優78、珍豐優9822與美優9802等155個雜交稻組合檢出了2個抗瘟基因，占總檢測組合的比率為47.25%；其中，大多數組合檢出的抗瘟基因是Pii與Pita。另外，部分雜交稻組合只檢測出1個抗瘟基因，其比率為20.73%，還有5.18%的組合未檢測到該8個抗瘟基因中的任何一個（圖3）。

2.3 檢出的抗瘟基因數量、類型與雜交稻組合的抗病相關性分析

為了探明雜交稻組合的抗瘟基因類型或數量與品種抗病性間的相關性，本研究對328個雜交稻組合進行了稻瘟病抗譜測定及田間病圃鑒定，結合兩組數據對這些組合進行了抗瘟性綜合評價。在選取的328個雜交稻組合中，高感、感、中感、中抗、抗、高抗的組合所占比例分別為17.07%、16.46%、16.16%、16.77%、16.77%、16.77%，各抗性水平的雜交稻分布較均衡（圖4）。隨著雜交稻組合檢出的抗病基因數量的增多，為抗病品種的比率也隨之上升；其中，在含有4個抗病基因的雜交稻組合中，抗病品種比率達91.67%，在含有3個、2個與1個抗病基因的雜交稻組合中，抗病品種比率分別為76.32%、45.6%與35.29%。上述結果表明，一個品種（組合）中含有的抗病基因數量越多，其抗性品種的出現頻率可以得到相應提升。

根據稻瘟病抗性綜合評價的結果，進一步分析含Pi1、Pik-p、Pik-h、Pi2、Pi9、Piz-t、Pita、Pii等不同的抗性基因對提升水稻品種（組合）抗性頻率的貢獻。結果顯示，不同的抗性基因對提升水稻品種的抗病性貢獻表現出顯著差異；其中，攜帶了抗性基因Pi2的雜交稻組合，表現為抗病品種的頻率為93.33%；其次是Pi1、Pik-h和Pik-p，分別為88.24%、71.43%和60.0%；在攜帶Pita、Pii與Piz-t基因的雜交稻組合中，表現為抗病品種的頻率分別為55.03%、49.55%與27.27%。上述結果表明，Pi2與Pi1在華南秈稻區表現出良好的抗瘟性，對該稻區稻瘟病的抗瘟性貢獻最大，其他抗瘟基因的抗病性貢獻大小依次是Pik-h、Pik-p、Pita、Pii與Piz-t。

3 討論

了解病原菌的無毒基因以及品種抗病基因的構成是利用抗病品種控制稻瘟病的基礎。單基因系的建立便于人們利用單基因鑒別系統鑒定稻瘟病菌無毒基因型，隨著越來越多的抗稻瘟病基因被克隆，為利用特異性標記分析品種抗病基因型奠定了技術基礎。國內學者利用抗稻瘟病單基因系對我國秈稻區稻瘟病菌的致病性進行了測定，研究表明華南稻瘟病菌與主效抗瘟基因的互作表現出豐富的多樣性，但亦可把互作歸類為幾個主成份類型，即分別以Pi1、Pi2、Pita2、Pish、Piz、Pi9、Pik-h、Pik-p、Pii等9個基因與病原互作的9個互作類型[9,25]。本研究以上述基因為主要檢測對象，試圖探明上述基因在華南雜交稻的分布以及與抗病性間的相關性，為本地區抗病品種基因型的合理布局提供科學依據。

近年來，國內外學者對水稻品種的抗瘟基因型相繼開展了研究。時克等[26]利用基因自身的功能標記檢測了58個水稻品種的Pita和Pib基因情況及其分布狀況；何重等[15]利用Pi-ta和Pi-b功能標記，對40個粳稻品種和665個粳稻新品系進行了基因型檢測，明確了抗性基因Pi-ta和Pi-b在江蘇粳稻品種中具有一定的分布，其中Pi-b的分布頻率較高。馬軍韜等[27]對6個主要水稻品種含有的抗瘟基因型進行了分析，共檢測到11個抗瘟基

因，Pi1基因出現頻率最高。本研究利用Pi1、Pik-p、Pik-h、Pi2、Pi9、Piz-t、Pita、Pii等8個基因功能性標記，對來自華南稻區不同遺傳背景的328個雜交稻組合進行了基因篩查，發現在這些品種中分布頻率最高的基因是Pita和Pii，這可能是華南稻區選用的育種材料中多含有Pita和Pii基因的緣故。檢出率較低的抗病基因是Pi1、Piz-t和Pik-h，在這些品種中均未檢測到Pi9基因，這一結果與Tian等[28]的研究認為抗病基因Pi9尚未在中國秈稻品種中廣泛應用相符；說明Pi9基因在華南稻區的抗病品種選育及生產上具有重要的應用潛力。本研究亦表明，一個雜交稻組合中檢出的抗病基因數量最多是4個，檢出3個或4個雜交稻組合的的抗瘟性是否一定優于聚合了2個或單個抗性基因的組合，還有待擴大水稻的檢測群體開展進一步的研究。

本研究分析了檢測的8個抗病基因對雜交稻組合的抗病性貢獻，發現Pi2與Pi1對華南稻作區稻瘟病的抗性貢獻最大，這2個抗病基因也是在華南稻區抗病育種工作中應用較多的廣譜抗瘟基因。王豐等[29]將稻瘟病廣譜抗病基因Pi1和香味基因fgr聚合到恢復系R290中，顯著提高了該恢復系的抗瘟性及稻米的香味品質；柳武革等[30]將Pi1、Pi2基因導入到保持系榮豐B中，利用其配組的雜交稻組合表現出優良的稻瘟病抗性和豐產性。近年來，由于自然界中稻瘟病菌的快速變異，生產上已出現了含有廣譜抗病基因Pi2與Pi1的品種抗病性衰退或喪失的事件[4,5,31]。據報道，雜交稻天優998嚴重感病是由于廣東省稻瘟病菌稀有小種ZB3上升為優勢小種所致，該型小種可致使攜帶Pi1及其等位基因的水稻品種嚴重感病[4]；五優308在我國南方多個稻作區嚴重感病，侵染該組合的稻瘟病菌可侵染Pita（Pita2）、Pii、Pish等抗瘟基因[5]。目前，與天優998及五優308抗瘟基因類型相近的雜交稻組合有湘豐優827、雙優228、金昌優3550、深優9521、美優116、五豐優587、五豐優165等，這些組合在上述兩個組合感病的稻區應避免種植；另外，與天優998及五優308不同類型的雜交稻組合有五豐優9802、五優華占、五豐優116、Y兩優187、珍豐優9822、美優9802、天優華占等，這些組合在天優998和五優308感病的稻區可考慮因地制宜地輪換種植。

雖然，本研究分析的抗性基因是目前華南稻區重要的抗瘟基因型,但是，隨著新的抗瘟基因不斷鑒定、引入及應用，今后仍十分有必要拓展對不同類型的抗瘟基因開展深入分析與研究。

[1]Liu J L,Wang X J,Mitchell T,Hu YJ,Liu X L,Dai L Y, Wang G L.Recent progress and understanding of the molecular mechanisms of the rice-Magnaporthe oryzae interaction.Mol Plant Pathol,2010,11(3):419-427.

[2]Ou S H.Rice Disease.2nd edn.Kew:Commonwealth Mycological Institute,1985:109-201.

[3]Miah G,Rafii M Y,Ismail M R,Puteh A B,Rahim H A, Asfaliza R,Latif M A.Blast resistance in rice:A review of conventional breeding to molecular approaches.Mol Biol Rep,2013,40(3):2369-2388.

[4]朱小源,楊健源,陳玉托,楊維新,陳喜勞,曾列先,陳深.引致天優998抗性喪失的稻瘟病菌小種鑒定及其致病性測定.廣東農業科學,2008(12):84-86. Zhu X Y,Yang J Y,Chen Y T,Yang W X,Chen X L, Zeng L X,Chen S.Race identification and pathogenicity test of the blast fungus causing the resistance breakdownof hybrid rice Tianyou 998.Guangdong Agric Sci, 2008(12):84-86.(in Chinese with English abstract)

[5]汪文娟,韋小燕,陳凱玲,陳尉芹,陳珍,楊健源,朱小源.源自雜交稻組合五優308稻瘟病菌致病性分析.廣東農業科學,2015,14:70-73. Wang W J,Wei X Y,Chen K L,Chen W Q,Chen Z, YangJY,ZhuXY.Pathogenicityanalysison Magnaporthe grisea of hybrid combination Wuyou 308. Guangdong Agric Sci,2015,14:70-73.(in Chinese with English abstract)

[6]Fjellstrom R,Conaway-Bormans C A,McClung A M, Marchetti M A,Shank A R,Park W D.Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of threePigenesconferringresistancetomultiple Pyricularia grisea pathotypes.Crop Sci,2004,44: 1790-1798.

[7]Liu W D,Liu J L,Triplett L,Leach J E,Wang G L. Novel insights into rice innate immunity against bacterial and fungal pathogens.Annu Rev Phytopathol,2014,52: 213-241.

[8]李進斌,李成云,陳艷,雷財林,凌忠專.二十二個抗稻瘟病基因在云南的利用價值評價.植物保護學報, 2005,32(2):113-119. Li J B,Li C Y,Chen Y,Lei C L,Ling Z Z.Evaluation of twenty-two blast resistance genes in Yunnan using monogenetic rice lines.Acta Phytophyl Sin,2005,32(2): 113-119.(in Chinese with English abstract)

[9]楊健源,陳深,曾列先,李亦龍,陳珍,朱小源.稻瘟病主效抗性基因對廣東省秈稻稻瘟病菌的抗性評價.中國水稻科學,2008,22(2):190-196. Yang J Y,Chen S,Zeng L X,Li Y L,Chen Z,Zhu X Y. Evaluation on resistance of major rice blast resistance genes to Magnaporthe grisea isolates collected from indica rice in Guangdong Province,China.Chin J Rice Sci,2008,22(2):190-196.(in Chinese with English abstract)

[10]柳武革,王豐,金素娟,朱小源,李金華,劉振榮,廖亦龍,朱滿山,黃慧君,符福鴻,劉宜柏.利用分子標記輔助選擇聚合Pi-1和Pi-2基因改良兩系不育系稻瘟病抗性.作物學報,2008,34(7):1128-1136. Liu W G,Wang F,Jin S J,Zhu X Y,Li J H,Liu Z R, Liao Y L,Zhu M S,Huang H J,Fu F H,Liu Y B. Improvement of rice blast resistance in TGMS Line by pyramidingofPi-1andPi-2throughmolecular marker-assisted selection.Acta Agron Sin,2008,34(7): 1128-1136.(in Chinese with English abstract)

[11]李進波,夏明元,戚華雄.水稻抗稻瘟病基因Pi1和Pi2聚合系的獲得及其抗性評價.安徽農業科學,2015, 43(5):12-14,31. Li J B,Xia M Y,Qi H X.Development and evaluation of disease resistance of pyramided lines with blast resistance genes Pi1 and Pi2 in rice.J Anhui Agric Sci,2015,43(5): 12-14,31.(in Chinese with English abstract)

[12]張國民,馬軍韜,肖佳雷,劉迎雪,辛愛華,任洋,張麗艷,劉東風.已知抗瘟基因在黑龍江省寒地稻區的評價與利用.植物病理學報,2011,41(1):72-79. Zhang G M,Ma J T,Xiao J L,Liu Y X,Xin A H,Ren Y, Zhang L Y,Liu D F.Evaluation and utilization of value of twenty-four blast resistance genes in north cold region, Heilongjiang.Acta Phytopathol Sin,2011,41(1):72-79. (in Chinese with English abstract)

[13]Ma J,Lei C L,Xu X T,Hao K,Wang J,Cheng Z,Ma X, Ma J,Zhang X,Guo X,Wu F,Lin Q,Wang C,Zhai H, Wan J.Pi64,encoding a novel CC-NBS-LRR protein, confers resistance to leaf and neck blast in rice.Mol Plant Microbe Interact,2015,28(5):558-568.

[14]Su J,Wang W J,Han J L,Chen S,Wang C Y,Zeng L X, Feng A Q,Yang J Y,Zhou B,Zhu X Y.Functional divergence of duplicated genes results in a novel blast resistance gene Pi50 at the Pi2/9 locus.Theor Appl Genet, 2015,128(11):2213-2225.

[15]何重,陳濤,張亞東,朱鎮,趙慶勇,周麗慧,于新,王才林.江蘇部分粳稻品種和品系中稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的基因型分析.江蘇農業學報,2014,30(5): 921-927. He C,Chen T,Zhang Y D,Zhu Z,Zhao Q Y,Zhou L H, Yu X,Wang C L.Genotypic analysis of blast resistance genes Pi-ta and Pi-b for japonica rice varieties and lines in Jiangsu Province.Jiangsu Agric Sci,2014,30(5): 921-927.(in Chinese with English abstract)

[16]程芳艷,李春光,劉永巍,孫翊軒，孟昭河，徐正進.水稻抗瘟基因Pi-b與Pi-5的分子檢測及外引抗源的利用評價.核農學報,2016,30(1):11-18. Cheng F Y,Li C G,Liu Y W,Sun Y X,Meng Z H,Xu Z J.Molecular detection of blast resistance genes Pi-b and Pi-5 in northeast rice varieties and utilization evaluation of introduced resistant donors.J Nuclear Agric Sci,2016, 30(1):11-18.(in Chinese with English abstract)

[17]朱小源,楊健源,劉景梅,司徒志謀,康金平,胡學應,朱敏記,羅森輝,楊祁云,林佩珍,曾列先,姜先芽,陳深.廣東水稻品種抗稻瘟病性分析與利用策略.廣東農業科學,2006(5):34-37. Zhu X Y,Yang J Y,Liu J M,Situ Z M,Kang J P,Hu X Y,Zhu M J,Luo S H,Yang Q Y,Lin P Z,Zeng L X, Jiang X Y,Chen S.Evaluation on resistance of rice varieties in Guangdong to rice blast and strategy for its utilization.Guangdong Agric Sci,2006(5):34-37.(in Chinese with English abstract)

[18]馮愛卿,楊健源,陳深,曾列先,楊祁云,蘇菁,汪文娟,朱小源.水稻資源對稻瘟病質量抗性及數量抗性評價.廣東農業科學,2015,42(12):27-32. Feng A Q,Yang J Y,Chen S,Zeng L X,Yang Q Y,Su J, Wang W J,Zhu X Y.Evaluation on qualitative and quantitative resistance of rice germplasm to Magnaporthe oryzae.2015.Guangdong Agric Sci,2015,42(12):27-32. (in Chinese)

[19]Zhai C,Lin F,Dong Z Q,He X,Yuan B,Zeng X,Wang L,Pan Q.The isolation and characterization of Pik,a rice blastresistancegenewhichemergedafterrice domestication.New Phytol,2011,189(1):321-334.

[20]Hua L X,Wu J Z,Chen C X,Wu W H,He X Y,Lin F, Wang L,Ashikawa I,Matsumoto T,Wang L,Pan Q H. The isolation of Pi1,an allele at the Pik locus which confers broad spectrum resistance to rice blast.Theor Appl Genet,2012,125:1047-1055.

[21]Yuan B,Zhai C,Wang W J,Zeng X S,Xu X K,Hu H Q, Lin F,Wang L,Pan Q H.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes.Theor Appl Genet, 2011,122:1017-2108.

[22]Neff M M,Turk E,Kalishman M.Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. Trends Genet,2002,18(12):613-615.

[23]Takagi H,Uemura A,Yaegashi H,Tamiru M,Abe A, MitsuokaC,UtsushiH,NatsumeS,KanzakiH, Matsumura H,Saitoh H,Yoshida K,Cano L M,Kamoun SO,TerauchiR.MutMap-Gap:Whole-genome sequencing of mutant F2progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii.New Phytol,2013,200(1):276-283.

[24]華麗霞,汪文娟,陳深,汪聰穎,曾烈先,楊健源,朱小源,蘇菁.抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特異性分子標記的開發.中國水稻科學,2015,29(3):305-310. Hua L X,Wang W J,Shen C,Wang C Y,Zeng L X, Yang J Y,Zhu X Y,Su J.Development of specific DNA markers for detecting the rice blast resistance gene alleles Pi2/9/z-t.Chin J Rice Sci,2015,9(3):305-310.(in Chinese with English abstract)

[25]朱小源,楊祁云,楊健源,雷財林,王久林,凌忠專.抗稻瘟病單基因系對秈稻稻瘟病菌小種鑒別力分析.植物病理學報,2004,34(4):361-368. Zhu X Y,Yang Q Y,Yang J Y,Lei C L,Wang J L,Ling Z Z.Differentiation ability of monogenic lines to Magnaporthe grisea in indica rice.Acta Phytopathol Sin, 2004,34(4):361-368.(in Chinese with English abstract)

[26]時克,雷財林,程治軍,許興濤,王久林,萬建民.稻瘟病抗性基因Pita和Pib在我國水稻主栽品種中的分布.植物遺傳資源學報,2009,10(1):21-26. Shi K,Lei C L,Cheng Z J,Xu X T,Wang J L,Wan J M. Distribution of two blast resistance genes Pita and Pib in major rice cultivars in China.J Plant Genet Res,2009, 10(1):21-26.(in Chinese with English abstract)

[27]馬軍韜,張國民,辛愛華,張麗艷,鄧凌韋,任洋.水稻品種抗稻瘟病分析及基因聚合抗性改良.植物保護學報,2016,43(2):177-183. Ma J T,Zhang G M,Xin A H,Zhang L Y,Deng L W, Ren Y.Resistance analysis and improvement of rice varieties by gene pyramiding.Acta Phytophyl Sin,2016, 43(2):177-183.(in Chinese with English abstract)

[28]Tian D G,Chen Z J,Chen Z Q,Zhou Y C,Wang Z H, WangF,ChenSB.Allele-specificmarker-based assessment revealed that the rice blast resistance genes Pi2 and Pi9 have not been widely deployed in Chinese indicaricecultivars.Rice,2016,9(1):19.doi: 10.1186/s12284-016-0091-8.

[29]王豐,柳武革,劉振榮,朱小源,李金華,廖亦龍,朱滿山,黃慧君,楊健源.利用分子標記輔助選擇聚合Pi-1和fgr基因改良水稻恢復系.雜交水稻,2010(S1): 237-244. Wang F,Liu W G,Liu Z R,Zhu X Y,Li J H,Liao Y L, Zhu M S,Huang H J,Yang J Y.Pyramiding Pi1 and fgr genes to improve rice restorer lines by molecular marker-assistedselection.HybridRice,2010(S1): 237-244.(in Chinese with English abstract)

[30]柳武革,王豐,劉振榮,朱小源,李金華,黃慧君,廖亦龍,朱滿山,付崇允,陳建偉.利用分子標記技術聚合Pi-1和Pi-2基因改良三系不育系榮豐A的稻瘟病抗性.分子植物育種,2012,10(5):575-582. Liu W G,Wang F,Liu Z R,Zhu X Y,Li J H,Huang H J, Liao Y L,Zhu M S,Fu C Y,Chen J W.Improvement of rice blast resistance in CMS line Rongfeng A by pyramidingPi-1andPi-2withmolecularmarker techniques.Mol Plant Breeding,2012,10(5):575-582. (in Chinese with English abstract)

[31]汪文娟,蘇菁,張杰,李亦龍,陳深,曾列先,楊健源,朱小源.源于粵晶絲苗2號穗瘟的稻瘟病菌致病性分析.廣東農業科學,2012,23:59-61. Wang W J,Su J,Zhang J,Li Y L,Chen S,Zeng L X, Yang J Y,Zhu X Y.Pathogenicity analysis of the rice blastfungusisolatedfromtheblastpaniclesof Yuejingsimiao 2.Guangdong Agric Sci,2012,23:59-61. (in Chinese)

Distribution of Eight Rice Blast Resistance Genes in indica Hybrid Rice in China

WANG Wenjuan1,ZHOU Jiyong2,WANG Congying1,SU Jing1,FENG Jinqi1,CHEN Bing1,FENG Aiqing1, YANG Jianyuan1,CHEN Shen1,ZHU Xiaoyuan1,*

(1Plant Protection Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection,Guangzhou 510640,China;2Guangdong Agricultural Technology Extension Station,Guangzhou 510520,China;*Corresponding author,E-mail: zhuxy@gdppri.com)

【Objective】The cloned rice blast resistant genes,Pi1,Pik-p,Pik-h,Pi2,Pi9,Piz-t,Pita and Pii,which showed broad-spectrum blast resistance in different rice growing regions,have been widely used in rice breeding for blast resistance.To clarify the distribution of these genes in hybrid rice in South China,【Method】the genotypes of resistance genes Pi1,Pik-p,Pik-h,Pi2,Pi9,Piz-t,Pita and Pii in 328 hybrid rice combinations were detected with functional markers.【Result】The distribution frequency of Pita and Pii was the highest,reaching 84.76%and 67.68%in the tested rice combinations,respectively;followed by Pi2 and Pik-p with the proportion of 22.87%and 13.72%, respectively;Pi1,Piz-t and Pik-h had the lowest distribution frequency,accounting for 5.18%,3.35%and 2.13%of total; all of these varieties didn’t carry resistance gene Pi9.The number of blast resistance genes detected in hybrid rice combinations were at most four.The resistance evaluation showed that the frequency of resistant varieties rose with increasing number of resistance genes in hybrid combinations.In a hybrid combinations with four resistance genes,the distribution frequency of resistant varieties was 91.67%.Blast resistance contribution assay of the eight resistance genes revealed that Pi2 and Pi1 displayed the greatest resistance contribution in the local rice in South China,followed by Pik-h,Pik-p,Pita,Pii and Piz-t.【Conclusion】This study provided a scientific basis for the rational distribution of resistant varieties with different genotypes in South China.

hybrid rice combinations;resistance gene;rice blast;genotype analysis;molecular marker

S435.111.4+1;S511.034

：A

：1001-7216(2017)03-0299-08

2016-07-26;修改稿收到日期：2016-11-05。

國家重點研發計劃項目（2016YFD0300700）；廣東省科技計劃資助項目(2015B020231003；2016B090918116;2016A050502030)；國家水稻產業技術體系資助項目(CARS-01-24)。