梯度逆流色譜分離純化雪菊中的3, 5-二咖啡酰奎寧酸和奧卡寧

王 丹 于金倩 鄭振佳 宋祥云 王岱杰 王 曉*

(1. 山東農業大學食品科學與工程學院， 泰安 271018；2. 山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東省分析測試中心，濟南 250014)

梯度逆流色譜分離純化雪菊中的3, 5-二咖啡酰奎寧酸和奧卡寧

王 丹1, 2于金倩2鄭振佳1宋祥云2王岱杰2王 曉2*

(1. 山東農業大學食品科學與工程學院， 泰安 271018；2. 山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東省分析測試中心，濟南 250014)

采用梯度逆流色譜技術快速分離純化雪菊中的3, 5-二咖啡酰奎寧酸和奧卡寧，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶8∶2∶8, 2∶8∶4∶6 ; v/v)為溶劑系統，上相為固定相，下相為流動相，轉速800 r/min，流速5.0 mL/min，檢測波長254 nm。所得餾分通過電噴霧電離(ESI)質譜和核磁共振譜(NMR)鑒定化合物的結構。從200 mg粗提物中一次分離得到兩個主要化合物：3, 5-二咖啡酰奎寧酸(11.2 mg)和奧卡寧(10.7 mg)，且3, 5-二咖啡酰奎寧酸為首次從雪菊中分離得到；經高效液相色譜法分析，其純度分別為92.82%和97.55%。研究結果表明，應用梯度逆流色譜分離雪菊中的生物活性成分快速高效。

雪菊 逆流色譜 梯度洗脫 3, 5-二咖啡酰奎寧酸 奧卡寧

雪菊(Coreopsistinctoria)是菊科金雞菊屬一年生草本植物，主要分布于新疆和田地區海拔2300～3000 m的昆侖山區，具有治療燥熱、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒的作用[1]，現今已經作為一種茶飲普及。現代藥理研究表明雪菊主要有抗炎、降脂[2]、降壓[3]、降糖[4，5]、抗氧化[6-8]、抗病毒等活性[1]。雪菊中有效成分的提取、分離研究多集中于黃酮類化合物[9，10]和苯丙素類化合物[11，12]。傳統的分離方法包括大孔吸附樹脂、反相色譜柱、葡萄糖凝膠LH-20和聚酰胺柱色譜法[9,13]等。這些方法制備時間長、溶劑消耗大，且會產生死吸附，導致樣品損失。高速逆流色譜(HSCCC)是沒有固態載體的液-液分配色譜，根據樣品在兩相溶劑中分配系數的不同實現樣品的分離，具有分離速度快、樣品吸附低、分離重現性好等優點，已被廣泛應用于天然藥物成分的分離純化[14]。

梯度洗脫可以使很寬極性范圍內的混合組分實現一次性色譜分離[15]，本研究采用高速逆流色譜儀運用梯度洗脫的方式從雪菊乙酸乙酯粗提物中成功分離得到3, 5-二咖啡酰奎寧酸和奧卡寧(結構式如圖1)，建立了高效、方便和快速分離方法，為其他食品中活性成分的分離提供了有效參考。

圖1 雪菊中兩種化合物的化學結構

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TBE 300C高速逆流色譜儀(上海同田生物技術有限公司)；Waters2695高效液相色譜系統(配有PDA檢測器，美國Waters公司)。

石油醚、乙酸乙酯和甲醇等均為分析純(天津市四友精細化學品有限公司)；水為去離子水；高效液相色譜用甲醇為色譜純(OCEANPAK ALEXATIVE CHEMICAL. , Ltd)；水為娃哈哈純凈水。

雪菊藥材購買于山東舜元藥業有限公司。

1.2 樣品制備

取雪菊藥材500g粉碎，過40目篩，加80%乙醇90℃回流提取兩次(10倍量，2 h；5倍量，1 h)。抽濾后合并濾液，減壓濃縮得乙醇提取物，加500mL水復溶，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，經減壓濃縮得乙酸乙酯粗提物13.2 g，用于進一步分離研究。

1.3 兩相溶劑系統和樣品溶液的制備

HSCCC的溶劑系統為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(體系1為2∶8∶2∶8，v/v；體系2為2∶8∶4∶6，v/v)，分別按比例置于分液漏斗中，震蕩后充分靜置使其分層。分取上下相，上相作為固定相，下相作為流動相，超聲除去上下相中的氣泡，待用。

取200 mg乙酸乙酯粗提物，加入上述體系1中上下相各5 mL，超聲溶解，用于HSCCC分離。

1.4 分配系數KD的測定

取少量樣品置于10 mL試管中，加入5 mL的下相，取5 μL下相溶液利用高效液相色譜(HPLC)測定色譜峰面積A1；取溶有樣品的下相2 mL加入等量的上相，劇烈振蕩1 min，使樣品充分溶解，靜置分層，再取5 μL下相溶液用HPLC進行檢測，其峰面積為A2，分配系數KD=(A1-A2)/A2。

1.5 分離和鑒定

1.5.1 HSCCC分離

將體系1中已超聲脫氣的固定相以20 mL/min的流速注入高速逆流色譜儀的螺旋管，待上相充滿整個螺旋管后，緩慢調節主機轉速至800 r/min，順時針旋轉，待轉速穩定后，以5.0 mL/min的流速泵入流動相，同時開啟檢測器和記錄儀，檢測波長為254 nm；當有流動相從出口流出，即螺旋管中的上下相達到平衡時，將樣品溶液從進樣圈注入到色譜儀中，流動相以5.0 mL/min的流速泵入(0～70 min以體系1的下相為流動相，70～250 min以體系2的下相為流動相)，根據色譜圖收集各色譜峰餾分。

1.5.2 HPLC分析和結構鑒定

雪菊乙酸乙酯粗提物和HSCCC所分離得到的各組分均用HPLC進行分析。色譜柱：RIGOL Compass C18(250×4.0 mm，5 μm)。檢測波長：254 nm。流動相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序為0～25 min，30%A～35%A；25～26 min，35%A～40%A；26～36 min，40%A～47%A；36～37 min，47%A～64%A；37～42 min，64%A～73%A；42～55 min，73%A～100%A；55～65 min，100%A。流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。HSCCC分離后各組分的化學結構根據ESI-MS和NMR進行鑒定。

2 結果與討論

2.1 HSCCC分離條件的優化

溶劑體系的選擇是HSCCC分離中的關鍵環節，溶劑體系合適與否是由目標化合物在其中的KD來衡量的。本實驗利用TLC初步確定目標組分在不同溶劑系統中的分配情況，通過HPLC測定了目標化合物在乙酸乙酯-正丁醇-水和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水等溶劑體系中的KD。結果表明，當采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水為兩相溶劑體系時，可實現目標化合物的分離。目標化合物在不同比例的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系中的KD見表1。

由表1可看出石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水的體積比為4∶6∶4∶6時，兩種化合物的KD差異較小，各組分會很快被洗脫出來，很難實現分離；體積比為3∶7∶3∶7和2∶8∶3∶7時，兩種化合物的KD差異較大，能保證各組分間具有較好的分離度，但同時B在固定相中的分配較多，若采用這兩種溶劑體系會使整體的分離時間過長，B有可能不出峰，影響分離效率，因此不適合雪菊粗提物中各物質的分離純化。在其他實驗參數相同的條件下，分別應用體積比為2∶8∶2∶8(體系1)與2∶8∶4∶6(體系2)的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水的體系對雪菊粗提物進行分離純化。結果表明體系1中目標組分A的分配系數較為理想，體系2中目標組分B的分配系數較為理想。

表1 兩種化合物在不同溶劑體系中的KD值

2.2 HSCCC分離純化的結果

分別單獨嘗試使用體系1和體系2進行高速逆流色譜分離，結果表明體系1的A分離效果較好，但300min時B仍未洗脫出來；體系2的A和B很快在130 min內洗脫出來，但A的純度較低。為了節省溶劑，縮短洗脫時間，又能分離出高純度的化合物，實驗采用如下梯度洗脫方法：0～70 min以體系1的下相為流動相，70～250 min以體系2的下相為流動相進行梯度逆流色譜分離，在260 min內A和B完全洗脫出來，其HSCCC分離譜圖見圖2。

本實驗使用梯度逆流色譜從200mg粗提物中一次性分離得到11.2 mg A和10.7 mg B，經HPLC分析，其純度分別為92.82%和97.55%。

圖2 雪菊中3, 5-二咖啡酰奎寧酸和奧卡寧的HSCCC色譜圖

2.3 HPLC條件的優化

本實驗在HPLC分析雪菊乙酸乙酯粗提物過程中，嘗試了用不同比例的乙腈-水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水作為流動相，結果表明：當采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相在65min內進行梯度洗脫，粗提物中的主要組分可以得到良好分離。

根據1.5.2所述條件，對雪菊粗提物及HSCCC分離所得2個餾分進行檢測分析，所得HPLC譜圖見圖3。

圖3 雪菊粗提物及兩個餾分的HPLC譜圖

2.4 HSCCC分離得到化合物的結構鑒定

化合物A：ESI-MS，m/z517 [M+H]+；1H-NMR ( DMSO-d6，400 MHz ) δ：1.92～1.98( 2H, m, 2 X H2), 2.10～2.15 (2H, m, 2 X H6), 3.83 (1H, s, H4), 5.13 (1H, d, J =3.6 Hz, H3), 5.22 (1H, d, J = 8.0 Hz, H5), 6.17 (1H, d, J = 15.6 Hz, H8 ), 6.26 (1H, d,J = 16.0 Hz, H8 ), 6.77 (1H, d, J = 4.0 Hz, H5 ), 6.79 (1H, d, J = 4.4 Hz, H5), 7.01(2H, d, J = 8.0 Hz, H6 , H6 ), 7.07 (2H, d, J = 7.6 Hz , H2 , H2 ), 7.44 (1H, s, H7), 7.49 (1H, d, J = 14.4 Hz, H7); 13C NMR( DMSO-d6，400 MHz ) δ：35.1 (C6), 36.0 (C2), 67.9(C3), 71.0 (C4), 71.3 (C5), 72.9 (C1), 114.6 (C8), 115.2 (C2, C2),115.83(C8),116.2 (C5), 116.3 (C5), 121.6 (C6), 121.8 (C6), 126.0 (C1), 126.1 (C1),145.2 (C7), 145.6 (C7), 146.0 (C3 , C3), 148.7 (C4), 148.8 (C4), 166.0 (C9 ),166.5 (C9), 175.7 (C7)，與文獻[16]中報道的3, 5-二咖啡酰奎寧酸波譜數據基本一致，故鑒定化合物A為3 , 5-二咖啡酰奎寧酸(3, 5-dicaffeoylquinic acid)。

化合物B：ESI-MS，m/z287 [M+H]+；1H-NMR( DMSO-d6，400 MHz) δ：7. 69( 1H，s，H-6′) ，7. 67 ( 1H，s，H-α) ，7. 66 ( 1H，s，H-β) ，7. 28( 1H，s，H-2) ，7. 21 ( 1H，d，J=8. 0 Hz ，H-6 ) ，6. 82 ( 1H，d，J=8. 0 Hz ，H-5) ， 6. 44( 1H，d，J = 8. 8 Hz ，H-5') ；13C-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ：192.42 (C=O)，153.99 (C-2')，153.19 (C-4')，149.41(C-4), 146.13 (C-3), 144.96 (C-β), 132.93(C-3'), 126.70(C-1), 122.79 (C-6), 121.73 (C-6'), 117.8 (C-α), 116.26 (C-1'), 114.33 (C-5), 113.80 (C-2)，108.18 (C-5')，與文獻[17，18]中報道的奧卡寧波譜數據基本一致，故鑒定化合物B為奧卡寧( okanin)。

3 結論

HSCCC在天然產物分離純化方面具有獨特的優勢，它相對于傳統的固-液柱色譜技術，具有適用范圍廣、操作靈活、高效、快速等優點；而且由于被分離物質與液態固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分離手段。

本研究采用梯度逆流色譜法對雪菊中的活性成分進行分離純化，并建立了雪菊乙酸乙酯提取物中2種單體化合物的分離純化方法。經過溶劑體系的選擇，最終應用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水作為兩相溶劑體系進行梯度洗脫分離得到了3, 5-二咖啡酰奎寧酸和奧卡寧，為進一步研究其在雪菊中的藥理作用奠定了基礎。

[1] 李冬明. 昆侖雪菊的藥學研究進展[J]. 浙江中醫雜志, 2012, 47(10): 776-777.

[2] 梁淑紅, 龐市賓, 劉曉燕, 等. 金雞菊提取物降血脂作用的研究[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010(8): 234-235.

[3] 梁淑紅, 哈木拉提, 龐市賓, 等. 金雞菊提取物降血壓化學成分實驗研究[J]. 時珍國醫國藥, 2012, 21(7): 1619-1621.

[4] 張淑鵬, 李琳琳, 王麗鳳, 等. 昆侖雪菊提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J]. 現代生物醫學進展, 2011, 11(6):1055-1058.

[5] 張燕, 李琳琳, 王麗鳳, 等. 新疆昆侖雪菊5種提取物對α-葡萄糖苷酶活性的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(7): 166-169.

[6] 明婷, 孫玉華, 胡夢穎, 等. 金雞菊提取物降壓及體內抗氧化作用的研究[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012, 18(10): 249-252.

[7] 曹燕, 龐市賓, 徐磊, 等. 金雞菊提取物體外抗氧化活性[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(12): 144-147.

[8] 魯曉翔. 黃酮類化合物抗氧化作用機制研究進展[J]. 食品研究與開發, 2012, 33(3): 220-224.

[9] 趙軍, 孫玉華, 徐芳, 等. 昆侖雪菊黃酮類成分研究[J]. 天然產物研究與開發. 2013, 25: 50-52.

[10] 馬超, 賀翠, 王燕芳, 等. 響應曲面法優化昆侖雪菊皂苷提取[J]. 中國釀造雜志, 2013, 32(9): 109-112.

[11] Woo J H, Jeong H S, Chang Y D, et al. Antioxidant Activities of Fractions Obtained from Flowers ofCoreopsistinctoriaNutt. [J]. Korean J Hortic Sci, 2010, 28: 115-119.

[12] Dias T, Bronze M R, Houghton P J, et al. The flavonoid-rich fraction ofCoreopsistinctoriapromotes glucose tolerance regain through pancreatic function recovery in streptozotocin-induced glucose-intolerant rats[J]. Ethnopharmacology, 2010, 132(2): 483-490.

[13] 張發強. 雪菊化學成分的提取分離與結構鑒定[D] . 吉林大學, 2014.

[14] Zheng Z J, Wang M L, Wang D J, et al. Preparative separation of alkaloids fromNelumbonuciferaleaves by conventional and pH-zone-firefining counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography B, 2010, 878: 1647-1651.

[15] Wang X, Zheng Z J, Guo X F, et al. Preparative separation of gingerols fromZingiberof ficinale by high-speed counter-current chromatography using stepwise elution[J]. Food Chemistry, 2011,125: 1476-1480.

[16] Clifford W Beninger，Mamdouh M Abou-Zaid，Adrienne L E Kistner，et al.A Flavanone and Two Phenolic Acids fromChrysanthemummorifoliumwith Phytotoxic and Insect Growth Regulating Activity [J]. Journal of Chemical Ecology. 2004, 30(3): 589-606.

[17] 崔慶玲, 倪慧, 潘英妮. 維藥兩色金雞菊花化學成分的分離與鑒定[J]. 沈陽藥科大學學報, 2015 , 32(1): 14-17.

[18] 賀翠. 雪菊黃酮類化合物的提取、分離鑒定及其活性研究[D]. 塔里木大學, 2014.

Separation and purification of 3, 5-dicaffeoyl quinic acid and okanin fromcoreopsistinctoriaby high-speed counter-current chromatography using stepwise elution.

Wang Dan1, 2, Yu Jinqian2, Zheng Zhenjia1, Song Xiangyun2, Wang Daijie2, Wang Xiao2*

(1. School of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University, Tai＇an 271018, China; 2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

The extraction conditions were as follows:solvent system: petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (2: 8: 2: 8，2: 8: 4: 6; v/v), rotation speed: 800 r / min , flow speed:5.0 mL/min, detection wavelength:254 nm.The obtained fractions were identified by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS),1H-nuclear magnetic resonance(NMR) and13C-NMR. Two main compounds, 3, 5-dicaffeoyl quinic acid (11.2 mg) and okanin (10.7 mg) were separated from 200 mg crude extract, whose purities were 92.82% and 97.55% and analyzed by HPLC. And 3, 5-dicaffeoyl quinic acid was separated fromCoreopsistinctoriafirstly. Experimental results indicate that the method is rapid and highly efficient.

coreopsistinctoria; counter-current chromatography; stepwise elution; 3, 5-dicaffeoyl quinic acid; okanin

山東省科技發展計劃(2014GZX219003, ZR2016YL006)；國家自然科學基金青年基金(21506119)

王丹，女，1989年出生，碩士研究生，研究方向為天然產物分離純化。

＊通訊作者：王曉，男，1971年出生，研究員，研究方向為天然產物分離純化，E-mail: wangx@sdas.org 。

10.3936/j.issn.1001-232x.2017.02.005

2016-11-23