響應面法優化酶輔助提取廢棄煙葉中煙堿

吳映捷,呂新美,閆兵兵,胡 鯤,楊先樂

上海海洋大學 水產與生命學院,國家水生動物病原庫,上海 201306

響應面法優化酶輔助提取廢棄煙葉中煙堿

吳映捷,呂新美,閆兵兵,胡 鯤,楊先樂*

上海海洋大學 水產與生命學院,國家水生動物病原庫,上海 201306

為了從廢棄煙葉高效提取煙堿，本文利用響應面法對在廢棄煙葉中煙堿的提取條件進行優化。以煙堿的得率為評價指標，設計酶解時間、酶解溫度，pH值及提取時間4因素3水平的實驗模型，采用Design Expert 8.0.6分析軟件對煙堿的提取條件進行優化研究。優選出最佳提取工藝為：酶解時間2.0 h，酶解溫度48.50℃，酶用量2.10%，pH4.00。測定煙堿的得率為3.320%，與預測值3.32836%偏差較小，為廢棄煙葉的煙堿提取提供理論依據。

煙堿;廢棄煙葉;響應面法

煙草(Nicotiana tabacum L)是最廣泛種植的經濟作物之一。我國有世界最大的煙草生產和消費國量，煙草年產量占到世界總產量的40%左右，煙堿（Nicotine，Nic）是煙草中最主要的生物堿[1]。臨床醫學上有重要使用價值，嚴家川的研究發現其可以激活α7煙堿型膽堿能受體及減少促炎癥細胞因子合成及釋放，減輕炎癥反應，改善疾病預后。給Alzheimer's癥患者使用煙堿透皮貼劑可以使患者認知功能得到改善[2]。凌麗研究表明煙堿具有強抗炎作用，可以不依賴迷走神經完整性獨立發揮作用[3]。張敏恒等經過研究表明煙堿也是農用殺蟲劑的重要成分，對昆蟲具有拒食、忌避、細胞凋亡和生殖毒性等作用可用于魚類寄生蟲防治，還能改善水質，清塘、療效徹底的特點，無耐藥性且殘留低，且原料廣，成本低，使用方便[4]。

現有的煙堿提取方法有溶劑萃取法[5]、蒸餾法[6]、離子交換法及超臨界CO2提取法等[7-9]。對于生物堿類化合物，一般根據極性和水溶性選擇提取方法，煙堿可溶于水，一般選擇水作為提取溶劑。陳小東等采用單寧酸作沉淀劑，超聲提取法來提取廢次煙葉中煙堿。用水做為提取溶劑，用單寧酸來行沉淀反應，煙堿的提取率達1.06%[10]。曾淼洋等用減壓內部沸騰法提取，實驗乙醇濃度為70%，提取溫度為50℃及操作壓強為0.019 MPa時，內部沸騰過程4 min完成，煙堿提取率1.15%[11]。黃飛也以微波輔助的方法提取煙堿，觀察了浸泡時間、微波功率、固液比、微波時間等條件對煙堿提取率的影響。微波輔助提取法提取煙堿最佳條件是：功率為800 W，輻射時間是7 min，浸泡時間為4 h，固液比1:7，該優化條件下，煙堿提取率能達到98.68%[12]。陳麗金用微波輔助的方法提取煙堿，發現微波對煙堿的提取有促進的作用。微波輔助提取的最佳工藝條件是微波功率為300 W，波時間為1 min，液固比為25:1，此工藝比未經微波處理的提法的提取率增加約11倍[13]。現在用于工業生產的主要為溶劑萃取法和蒸餾法，但是這些方法效率低下，而離子交換法和超臨界CO2提取法雖然得率較高但是成本又難以控制，現有技術在提取效率和生產成本上難以達到平衡。酶解輔助提取法是指在傳統溶劑法的基礎上，利用生物酶降解細胞間質中的成分，破壞植物細胞壁結構，通過降低細胞的滲透阻力促進有效成分的溶出[14]。具有工藝簡單、得率高的優點，可以用于工業大量生產。依據單因素提取實驗結果，選取對提取有影響的酶解溫度、酶解時間、酶用量和pH值四個因素，以煙堿得率為指標，采用中心組合設計－響應面法確定最佳提取工藝，并且具有試驗次數少、精度高的優點，以期為廢棄煙葉提取工業化提取提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

廢棄煙葉由江西省贛州市漁業局提供，去掉老化病變部分，洗凈，烘干，粉碎，過篩備用。實驗中所用試劑均為分析純。煙堿標準品購于美國Sigma公司（純度≧98%），纖維素酶，諾維信公司，酶活力為20000 U/g。

HH-4S數顯恒溫水浴鍋(上海貝凱生物化工設備有限公司)；UV751型紫外－可見光分光光度計（瑞利儀器分析有限公司產品）、AB104-S電子分析天平

1.2 實驗方法

1.2.1 煙堿含量的測定 將煙堿標準液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL注入60 mL分液漏斗中，加檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液2 mL于分液漏斗、再加入2 mL甲基橙溶液，將分液漏斗中的溶液混合均勻，加入三氯甲烷5 mL，萃取時間2 min，靜置分層，取三氯甲烷的分層加入比色皿中，測波長在420 nm處吸光度。煙堿溶液吸光度作縱坐標，煙堿量為橫坐標繪標準曲線。煙葉中總煙堿含量按照《YC/T160-2002煙草及煙草制品總植物堿的測定連續流動法》測其中總煙堿含量[15]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 最佳酶解時間的篩選 稱取過篩后的煙葉10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，選擇了酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h作為考察因素，固定酶解溫度選定為50℃，酶用量1.5%，pH值5，所得提取液過濾，放冷，得供試品溶液，測定，計算煙堿提取量；

1.2.2.2 最佳酶解溫度的篩選 稱取過篩后的煙葉10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，選擇了酶解溫度40、45、50、55、60、65℃作為考察因素，固定酶解時間1.0 h，酶用量1.5%，pH值5，所得提取液過濾，放冷，得供試品溶液，測定，計算煙堿提取量；

1.2.2.3 最佳酶用量的篩選 稱取過篩后的煙葉10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，選擇了酶用量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%作為考察因素，固定酶解時間1.0 h，酶解溫度50℃，pH值5，所得提取液過濾，放冷，得供試品溶液，測定，計算煙堿提取量；

1.2.2.4 最佳pH值的篩選 稱取過篩后的煙葉10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，選擇了pH值3.5、4、4.5、5、5.5、6作為考察因素。固定酶解時間1.0 h，酶解溫度50℃，酶用量1.5%，所得提取液過濾，放冷，得供試品溶液，測定，計算煙堿提取量。

1.2.2.5 煙堿含量的測定

煙堿的得率（mg/g）=C×V×n/m

C為根據煙堿標準曲線公式計算出的所測樣品中煙堿濃度（mg/mL），V為提取液定容體積（mL），n為稀釋倍數，m為煙葉的質量（g）。

2 響應面實驗設計

2.1 標準曲線分析

以吸光度為縱坐標，煙堿提取量為橫坐標作圖，作出回歸方程y=0.117x-0.031，R2=0.9927。

2.2 煙堿提取單因素實驗

2.2.1 酶解時間對煙堿得率的影響

圖1 煙堿提取量的標準曲線Fig.1 Standard curve of Nicotine amount

圖2 酶解時間對提取效果的影響Fig.2 Effect of enzyme time on yield of Nicotine

由圖2可知，煙堿的得率隨酶解時間的增加而升高，酶解時間2 h后，隨著酶解時間的延長，煙堿得率增勢趨于平緩。原因為隨著時間增長，酶活力可以得到充分發揮，酶解反應進行得較完全，提取液中煙堿含量便不再明顯增加。

2.2.2 酶解溫度對煙堿得率的影響

煙堿的提取率隨酶解溫度升高而增加，當溫度為50℃時，到達峰值，酶解溫度繼續升高，煙堿的提取率開始減少。隨著溫度的升高，底物分子的熱能增加，酶解反應的速率增加，提取率增大，但當溫度繼續升高，導致酶活性降低，酶解反應受抑制，因此溫度升高得率降低。

2.2.3 酶用量對煙堿得率的影響

圖3 酶解溫度對提取效果的影響Fig.3 Effect of enzyme temperature on yield of Nicotine

圖4 酶用量對提取效果的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on yield of Nicotine

煙堿的提取率隨酶用量的增加不斷升高，當酶用量到2%時，酶量再增加，煙堿的提取率沒有明顯變化。這可能是由于當酶用量低于最佳值時，酶解進行得不完全，煙堿釋放出的量較少，提取率低，當達到最佳值時，酶解反應則較徹底，此時如再繼續增加酶用量，酶解反應進行的程度沒有太大的變化。

2.2.4 pH值對煙堿得率的影響

圖5 pH值對提取效果的影響Fig.5 Effect of pH on yield of Nicotine

試驗結果表明，煙堿得率隨著酶解pH值的增大先增大后減小。原因可能是纖維素酶受到pH值的影響較大。

2.3 響應面優化實驗分析

2.3.1 響應面實驗因素水平的選擇 在單因素實驗的基礎上對A（酶解時間）、B（酶解溫度）、C（酶用量）和D（pH值）為考察因素，進行響應面試驗，使用Design-expert 8.0.6 trial軟件，以煙堿含量為指標，設計4因素3水平（共29個試驗點、5個中心點）的響應面試驗，每組試驗重復3次，取其平均值，其因素水平如表1所示。

表1 Response surface試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in Response surface test

2.3.2 建立模型方程與顯著性檢驗 對結果進行多元化回歸擬合分析得到4個因素與煙堿得率之間二次回歸模擬方程

得率=3.24+0.050A-0.38B-0.025C-0.075D-0.021AB+0.028AC+0.038A D+0.012BC+0.16BD-0.13C D-0.021A2-0.67B2-0.044C2-0.42D2

二次回歸模擬方程其中一次項和二次項都有顯著性影響因素，所以實驗各因子對響應值的影響并不是線性關系。

表2 Response surface中心組合方案及響應值Table 2 Response surface central combination project and response values

該回歸模型檢驗極為顯著，P＜0.0001。失擬項P=0.2661，說明方程的擬合性較好。R2=0.9921說明模型相關度好。校正決定系數R2adg=0.9599說明模型能較好地反映酶解時間，酶解溫度，酶用量，pH與煙堿得率之間的關系。變異系數CV值表達的是每個平均值偏離的狀況，本實驗CV=0.025%＜0.1%，說明實驗的重復性好。從F值的分析結果可以看出，在所選的各因素水平范圍內，對煙堿得率的影響大小的順序為:酶解溫度（F=531.13）、酶解時間(F=9.29)、酶用量(F=2.38)，pH值(F=0.011)。根據表3中P值可知，一次項A、B對煙堿得率的影響極顯著，交互項中AB對煙堿得率的影響極顯著，BD、CD對煙堿得率的有顯著影響，AC對煙堿得率的影響顯著，二次項B2、D2對煙堿得率有極顯著影響,。響應面方程極顯著地表示了Y與A、B、C、D的關系[16]

響應面是響應值對試驗因子所構成三維空間曲面圖，從響應面分析圖上能清楚看出最佳條件及各參數之間的交互作用。兩因素交互作用對煙堿得率影響的響應曲面見圖6。A圖為等高線，B圖為其相對應的響應曲面圖。利用三維圖(圖6)綜合反映了各變量之間的交互關系，響應曲面圖形越陡峭，即其交互作用越顯著，圖形平穩則說明交互作用比較微弱。圖6可知，酶用量和酶解時間交互作用最強，酶解溫度和pH交互作用最弱。酶解時間和酶解溫度對得率的影響最為顯著，在酶解時間1.5 h，酶用量2%時，當酶解時間一定時，煙堿得率隨溫度得增加先升高后降低，當酶解溫度一定時，得率隨溫度的增加先快速升高再趨于平穩。

2.4 最佳工藝條件的確定及驗證

圖6 各兩因素交互作用對煙堿影響Fig.6 The interactive effects of two factors on yield of Nicotine

3 討論與小結

本實驗采用纖維素酶法從廢棄煙葉中提取煙堿，分解纖維素時能起到生物催化作用，能降低反應的活化能，使分解作用完全高效地進行。所以本實驗采用纖維素酶催化提取得到煙堿提取得率高，實際應用時操作簡單、反應得到產物的活性成分保存好、反應安全無毒，不會有溶劑殘留的問題[17]。通過單因素實驗分析和響應面法可于較準確地得出了最佳提取工藝，數據較為可靠，有良好的重復性[18]。在單因素試驗的基礎上，通過響應曲面分析對煙堿的提取工藝進行優化，并得到回歸方程。試驗首先考察了酶解時間、酶解溫度 酶用量、pH等4組單因素水平對煙堿的影響，進行了響應面試驗設計，結果表明，各影響因素對煙堿得率的影響程度大小依次為酶解溫度、酶解時間、酶用量、pH。三維(3d)響應面回歸方程的一個重要組成部分,可以直觀地闡述了兩個變量之間的交互作用,并確定最優水平,酶解溫度和pH交互作用最強，酶解時間和酶用量的交互作用最弱，確定其最佳提取工藝條件并結合實際確定為得出影響煙堿的最佳提取工藝條件為：酶解時間2.00 h，酶解溫度48.50℃，酶用量2.10%，pH值為4。根據優化條件進行三組平行實驗，取平均值為3.320 mg/g，與預測值相差較小。得到回歸方程與實際的情況擬合較好，進一步驗證了該模型的可行性。實驗結果說明該回歸方程可以較好預測實驗結果。因此，選擇響應曲面法來優化煙堿的提取工藝是可行的[18-20]。

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Optimization of Nicotine Extracted from Abandoned Tobacco with Response Surface Method

WU Ying-jie,LV Xin-mei,YAN Bing-bing,HU Kun,YANG Xian-le*
College of Fisheries and Life Science/Shanghai Ocean University,NationalAquaticAnimal Pathogens,Shanghai 201306,China

To optimize the conditions for purification of Nicotine in abandoned Tobacco.Response surface method was used to design the test models with four factors including enzyme time,enzyme temperature,enzyme dosage,ultrasonic time at three levels based on the single factor experiment and the yield of Nicotine was used as the evaluation index to optimize purification process of Nicotine.The optimum extraction condition were as follows:enzymolysis time was 2.00 h, enzymolysis temperature was 48.50℃,cellulose enzyme amount was 2.10%,pH was 4.00.Under this condition,the yield was up to 3.320%,the relative error was smaller compared to the predicted value 3.32836%.The optimum extraction conditions were simple and stable and they were served as a reference for industrial large scale production.

Nicotine;abandoned tobacco;response surface method

S572

:A

:1000-2324(2017)02-0203-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2017.02.008

2016-10-12

:2016-11-05

國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2011AA10A216);公益性行業(農業)科研專項經費(201203085)

吳映捷(1992-),女,在讀碩士生,研究方向為中草藥殺滅寄生蟲作用.E-mail:wuyingjie0615@sina.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:xlyang@shou.edu.cn