三疣梭子蟹PtCrustin3成熟肽在畢赤酵母中的重組DNA表達

盧希陽,陶 妍

上海海洋大學 食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306

三疣梭子蟹PtCrustin3成熟肽在畢赤酵母中的重組DNA表達

盧希陽,陶 妍*

上海海洋大學 食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306

Crustin抗菌肽是一類由甲殼動物表達的具有抗菌作用的小分子肽，它們在動物抵御病原微生物侵染的免疫系統中發揮了重要作用，被認為是替代抗生素的良好候選者。Crustin的N端含有一個信號序列，與之相連接的C端為成熟肽序列，內含一個WAP（Whey acidic protein）結構域，為Crustin的活性區域；根據信號肽與WAP結構域之間的結構差異，可以將Crustin分為三種類型。本文以三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）I型Crustin的一個同工型“PtCrustin3”的成熟肽（mPtCrustin3）為研究對象，通過RT-PCR從鰓中克隆到編碼mPtCrustin3的cDNA，并通過巢式PCR對其添加EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點以及6×His標簽。以pPICZαA為真核表達載體，成功構建了重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3，電轉入畢赤酵母X-33，在29℃、250 r/m的條件下，經1.0%甲醇誘導表達96 h后，獲得的表達產物經Tricine-SDS-PAGE分析，證明分子量約為11.6 kD的重組體mPtCrustin3在畢赤酵母X-33中被成功表達。

三疣梭子蟹;RT-PCR;PtCrustin3成熟肽;畢赤酵母;重組表達

Relf等[1]首次從普通濱蟹（Carcinus maenas）血細胞中分離到Crustin抗菌肽，其分子量為11.5 kD、富含脯氨酸和半胱氨酸。Crustin的N端含有一個信號序列，與之相連接的C端為成熟肽序列，內含一個WAP（Whey acidic protein）結構域，該結構域包含8個保守的半胱氨酸殘基，形成一個含有4個二硫鍵的緊密包裹結構，是Crustin的主要功能域[2]。Smith等[3]根據Crustin信號肽與WAP結構域之間的結構差異，將Crustin分為三種類型。I型Crustin：主要存在于蟹類、螯蝦和龍蝦等甲殼動物中，在信號肽與WAP結構域之間存在一個序列長度多變、富含半胱氨酸殘基的結構域；II型Crustin：主要存在于對蝦中，在信號肽與WAP結構域之間不僅富含半胱氨酸，還富含甘氨酸；III型Crustin：在信號肽與WAP結構域之間既沒有半胱氨酸殘基也沒有甘氨酸殘基，故被稱為SWD(Single-whey domain)蛋白，亦或Antileukoproteinase-like蛋白或者Chelonianin-like蛋白。抑菌實驗表明，Crustins除了對微球菌屬、氣球菌屬、動性球菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、棒狀桿菌屬和芽孢桿菌屬等革蘭氏陽性菌有抑菌活性外[1,4?6]，還對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等革蘭氏陰性菌有不同程度的抑菌活性[7]。

2013年，Cui等[7]從三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的鰓和眼柄中分離到編碼I型Crustin的三種同工型基因（PtCrustin1、PtCrustin2、PtCrustin3），并對其中的PtCrustin3成熟肽基因進行了大腸桿菌原核表達，獲得的重組體PtCrustin3成熟肽顯示了一定的抑菌作用。然而，原核表達系統存在無翻譯后折疊修飾功能、易在細胞內形成包涵體等眾所周知的缺點[8]，且不適合大規模制備。相比之下，畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統能高效表達外源蛋白、表達穩定性高，并具有翻譯后修飾功能，有利于獲得具生物學活性的重組蛋白，并適合擴大制備[9]。據此，本研究以三疣梭子蟹I型Crustin的PtCrustin3成熟肽（mPtCrustin3）為研究對象，旨在初步建立基于畢赤酵母表達系統的mPtCrustin3的重組DNA表達方法，為進一步擴大制備和對其生物學功能的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

三疣梭子蟹（400 g）購自上海蘆潮港海鮮市場。畢赤酵母X-33菌株及表達載體pPICZαA為Invitrogen公司（美國）產品；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存；限制性內切酶EcoRⅠ、XbaⅠ、SacⅠ和T4 DNA連接酶以及克隆質粒pMD-19T simple購自TaKaRa公司(日本)。胰蛋白胨、酵母粉為OXOID公司(英國)產品。博來霉素為Invitrogen公司(美國)產品；DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒、DNA分子量標準、蛋白質分子量標準和PCR反應試劑均購自天根生化科技有限公司(北京)。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。其他試劑為國產或進口分析純。

1.2 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

三疣梭子蟹運至實驗室后，取其眼柄和鰓快速置于液氮中凍結，按照RNAiso Plus說明書提取總RNA。第一鏈cDNA的合成按照Prime Script試劑盒(TaKaRa)操作：總RNA 6 μL、Oligo(dT)Primer (50 μmol/L)1 μL、dNTP Mixture(10 mmol/L each)1 μL、ddH2O 2 μL混勻，65℃保溫5 min，冰上迅速冷卻；依次加入5×Buffer 4 μL、RNase inhibitor(40 U/μL)0.5 μL、Prime Script RTase(200U/)1 μL (200 U)、RNase Free dH2O 4.5 μL，緩慢混勻后42℃保溫30～60 min；95℃保溫5 min，冰上冷卻后得到第一鏈cDNA。

1.3 含限制性酶切位點的mPtCrustin3基因的PCR擴增

圖1 通過PCR擴增目的基因的策略圖Fig.1 Strategic map for PCR amplification of target gene

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

PCR策略如圖1所示，參考PtCrustin3的cDNA序列（GenBank注冊號：JQ728424）設計一對特異性引物F1和R1（表1），以第一鏈cDNA為模板進行第一次PCR，反應體系和條件為：上下游引物(10 mol/L)各0.8 L、10×Buffer 2.0 L、dNTP(2.5 mmol/L)1.6 L、Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)0.2 L、DNA模板0.5 L，加無菌水至20 L；94℃預變性3 min、94℃變性30 s、退火（56.5℃）30 s、72℃延伸1 min，最終72℃延伸5 min，30個循環。以第一次PCR產物為模板，設計含EcoRⅠ酶切位點的前引物F2和含6×His標簽的后引物R2（表1）進行第二次PCR，反應體系和條件同第一次PCR，除了退火溫度改為56℃；再以第二次PCR產物為模板，設計含XbaⅠ酶切位點的后引物R3（表1），采用F2與R3進行第三次PCR，反應體系和條件同第一次PCR，除了退火溫度改為57.9℃。第三次PCR產物經割膠純化后與pMD-19T質粒連接得到重組質粒pMD-19T-mPtCrustin3，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37℃培養過夜，挑1個陽性克隆由上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 Crustin氨基酸序列的多重比對及分子系統樹的構建

使用DNAMAN6.0對Crustin全長氨基酸序列進行多重比對，各序列來自NCBI網站，序列號分別為：PtCrustin3（GenBank登錄號:AFU61580.1）、美洲螯龍蝦（Homarus americanus,GenBank登錄號:ABM92333.1）、眼斑龍蝦（Panulirus argus,GenBank登錄號:AAQ15293.1）、歐洲龍蝦（Homarus gammarus,GenBank登錄號:CAH10349.1）、遠海梭子蟹（Portunus pelagicus1,GenBank登錄號:ABM65762.1;Portunus pelagicus2,GenBank登錄號:AFN37210.1）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii,GenBank登錄號:ACL15396.1）、日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicas,GenBank登錄號:AME17866.1）、紫螯青蟹（Scylla tranquebarica1,GenBank登錄號:AGU01540.1;Scylla tranquebarica2,GenBank登錄號:AFI56572.1）、挪威海螯蝦（Nephrops norvegicus,GenBank登錄號:CCE46014.1）、日本仿長額蝦（Pandalopsis japonica1,GenBank登錄號:AFN80342.1;Pandalopsis japonica2,GenBank登錄號:AGU01543.1）。分子系統樹根據上述生物Crustin全長的氨基酸序列構建，采用MEGA6.0鄰位相聯法，各結點的置信度由自引導值估計，重復次數為1000。

1.5 重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3的構建及電轉化畢赤酵母X-33

采用EcoRⅠ和XbaⅠ對測序無誤的pMD-19T-mPtCrustin3進行雙酶切，將獲得的目的片段mPtCrustin3與經相同酶處理過的表達載體pPICZαA混合，在T4 DNA連接酶作用下，16℃反應過夜；轉化感受態細胞DH5α后，37℃培養過夜；通過菌落PCR、雙酶切和DNA測序鑒定重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3。采用SacⅠ對其酶切后，以1:8(V/V)與畢赤酵母X-33感受態細胞混合，轉入預冷的0.2 cm電轉杯中，冰浴5 min，1.5 kV、25 F、200 Ω，電擊5 ms，立即加入1 mL預冷的1 mol/L的山梨醇，離心后菌體涂布于含100 μg/mL博來霉素的YPDS平板(1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%D(+)葡萄糖、1 mol/L山梨醇、2%瓊脂)，30℃培養72 h至單克隆產生。

1.6 甲醇利用快速型酵母轉化子的篩選和鑒定

挑取10個單菌落分別接種至MM平板(1.34%YNB、0.4 mg/L生物素、5 mL/L甲醇、15 g/L瓊脂)和MD平板（1.34%YNB（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids）、0.4 mg/L生物素、20 g/L葡萄糖、15 g/L瓊脂）上，篩選甲醇利用快速型轉化子。對篩選到的酵母轉化子提取基因組DNA，以此為模板，采用pPICZαA的通用引物5'AOX1和3'AOX1進行PCR鑒定。

1.7 mPtCrustin3的誘導表達及Tricine-SDS-PAGE

挑取經鑒定無誤的酵母轉化子接種于25 mL BMGY培養基(1.34%YNB、0.4 mg/L生物素、1%甘油、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液,pH 6.0)中，29℃、250 r/min培養至OD600為3.0-6.0；離心（5000 r/min）收集菌體，重懸于100 mL BMMY培養基(配方同BMGY培養基，除了1%甲醇取代甘油)中，調OD600至1.0，30℃、250 r/min培養96 h，每隔24 h補加甲醇至總體積的1.0%；收集發酵培養液用作Tricine-SDS-PAGE分析，濃縮膠濃度4%，夾層膠濃度10%，分離膠濃度16.5%，超低分子量蛋白標準由中科瑞泰(北京)生物科技有限公司提供。

2 結果

2.1 通過PCR擴增含酶切位點的mPtCrustin3基因

第一次PCR擴增到一個557 bp長度的片段(圖2-A)，該片段應編碼PtCrustin3前體肽（由N端的信號肽和C端的成熟肽組成），并含部分5’和3’非編碼區；以此片段為模板，第二次PCR擴增到一個306 bp的片段（圖2-B），該片段應編碼PtCrustin3的成熟肽（mPtCrustin3），其5’端和3’端應分別含EcoRⅠ酶切位點和6×His標簽；以此片段為模板，第三次PCR擴增到一個315 bp的片段(圖2C)，該片段的3’端應含XbaⅠ酶切位點。最后一次PCR產物經克隆進pMD-19T質粒和DNA測序，證明兩個限制性酶切位點和6×His標簽被成功添加(圖3)；推斷的氨基酸序列表明該基因編碼102個氨基酸殘基，除去N端的2個額外殘基（E,F）和C端的的6個組氨酸殘基外，其余94個殘基組成了mPtCrustin3區域，且10個高度保守的半胱氨酸殘基位于該區域內。

圖2 目的基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of target gene

圖3 編碼mPtCrustin3的cDNA及其推斷的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of mPtCrustin3

2.2 不同來源Crustin之間氨基酸序列的比較

圖4 不同來源Crustin氨基酸序列的多重比較Fig.4 Multiple comparison of Crustin amino acid sequence from different species

對不同來源Crustin一級結構的多重比對結果如圖4所示，不同來源的Crustin氨基酸序列中顯示了14個高度保守的氨基酸殘基（黑色陰影），它們均位于成熟肽區域中，其中11個高度保守的殘基位于WAP結構域區域，內有8個半胱氨酸殘基在空間上可以形成4對二硫鍵，被認為與Crustin的穩定和抗菌活性有關，由此證明了WAP結構域的重要性。在被比較的甲殼類動物中，與PtCrustin3同源性最高的是遠海梭子蟹同工型1（76%），其次是眼斑龍蝦（53%）；其余來源的Crustin與PtCrustin3之間的氨基酸同源性在37～44%（表2）。

表2 不同來源Crustin之間氨基酸序列的同源性Table 2 Homology of the Crustin amino acid sequences among different species

2.3 基于Crustin氨基酸序列的分子系統樹分析

由圖5可見，根據不同Crustin氨基酸序列構建的分子系統樹可分為1個大的分支和1個小分支。三疣梭子蟹PtCrustin3和遠海梭子蟹同工型1位于大分支下面的1個小分支，由自引導值100支持，證明它們之間的親緣關系最近,該分子系統樹的分析結果與氨基酸序列多重比對的結果基本一致。

圖5 基于Crustin氨基酸序列的分子系統樹Fig.5 Molecular phylogenetic tree based on Crustin amino acid sequence

2.4 構建重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3及其鑒定

將上述經測序驗證的mPtCrustin3片段與表達載體pPICZαA連接以獲得重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3(圖6)。轉化感受態細胞DH5α后，使用載體上的引物5’AOX1和3’AOX1進行菌落PCR鑒定，由圖7A可見，在約835 bp處有明顯條帶，與理論值相符；另一方面，采用EcoRⅠ和XbaⅠ對重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3進行雙酶切驗證，由圖7B泳道3可見，僅顯示了1個大分子量的條帶（切下目的片段后剩下的載體片段），卻未見315 bp目的片段的條帶（可能由于濃度太低）；但未酶切的陰性對照（泳道4）顯示了一個更大分子量的條帶，初步證明重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3已構建成功。此外，DNA測序結果也證明mPtCrustin3與pPICZαA正確連接，未發生基因變異。

圖6 重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3的構建Fig.6 Construction of recombinant expression vector pPICZαA-mPtCrustin3

圖7 pPICZαA-mPtCrustin3的菌落PCR（A）和雙酶切鑒定（B）Fig.7 Identification of pPICZαA-mPtCrustin3 by colony PCR(A)and restriction endonuclease digestion(B)

2.5 酵母轉化子的篩選及其鑒定

將重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3電轉入畢赤酵母X-33細胞后，經含100 μg/mL博來霉素的YPDS平板、MM和MD平板篩選后，獲得10株甲醇利用快速型酵母轉化子；選擇2株經YPD液體培養基過夜培養后，提取其酵母基因組DNA為模板，使用載體上的通用引物5’AOX1和3’AOX1進行PCR驗證，如圖8所示，2株樣品均在2200 bp和835 bp處有明顯條帶，前者為畢赤酵母X-33中因存在醇氧化酶基因AOX1自身的引物結合位點而擴增的條帶，后者為含目的基因的擴增條帶，與理論值相符。由此證明pPICZαA-mPtCrustin3成功嵌合進畢赤酵母基因組DNA。

圖8 酵母轉化子的PCR鑒定Fig.8 PCR identification of yeast transformants

2.6 重組體mPtCrustin3的誘導表達及Tricine-SDS-PAGE分析

對上述篩選到的1號酵母轉化子采用BMM培養基、1%甲醇誘導表達96 h后，離心取上清用作Tricine-SDS-PAGE分析，由圖9可見，與陰性對照（含pPICZαA空質粒的酵母轉化子）相比，該酵母轉化子在小于14.4 kD處有明顯的條帶，接近理論分子量位置（11.6 kD），證明重組體mPtCrustin3被成功表達。

圖9 培養液上清的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.9 Tricine-SDS-PAGE analysis for supernatants from culture solutions

3 討論

迄今為止，僅Cui等[7]報道了三疣梭子蟹PtCrustin3成熟肽在大腸桿菌中的重組DNA表達，并且是以融合蛋白的形式表達的，顯然不利于目的蛋白的獲取。鑒于此，本研究擬通過構建畢赤酵母表達系統，以期實現三疣梭子蟹mPtCrustin3的真核重組表達，所選的宿主菌為野生型畢赤酵母X-33，其對外源蛋白具有較好的分泌和適應能力[10]，有利于獲得目的蛋白。由本研究結果可知，基本上已實現上述目標，但在進一步的研究中還有待于對有些方面進行改變和完善。例如，圖9中1號泳道的目的條帶下方還顯示了1個淡條帶，其原因分析如下：載體pPICZαA中α因子信號肽的N端存在Kex2和Ste13兩個切割位點，若在Kex2位點處被切割的話，目的片段5’端的EcoR I與Kex2位點之間的序列會導致重組體mPtCrustin3的N端額外引入6個氨基酸殘基；另一方面，雖然Ste13位點被切割的效率不高，但若在該位點被切割的話，可能導致重組體mPtCrustin3的N端引入2個或4個額外的氨基酸殘基，由此獲得分子量不同的目的蛋白。上述兩種情況均不能獲得天然的N末端，該結果是否會對重組體mPtCrustin3的空間結構以及生物學活性產生影響還有待于進一步的研究。進一步的研究將聚焦于選擇合適的限制性內切酶，以期獲得具有天然N末端的重組體mPtCrustin3。

因本研究中目的蛋白在畢赤酵母中的表達量較低，故圖9顯示的是對發酵液上清進行濃縮處理后的電泳結果。關于表達量低的原因可能與使用的是天然cDNA有關，經分析，編碼mPtCrustin3的94個氨基酸殘基的天然密碼子中有7個密碼子對于畢赤酵母而言屬于低頻密碼子。已有研究表明，對密碼子進行優化可提高目的蛋白在畢赤酵母中的表達量[11?14]，因此在后續研究中將根據畢赤酵母的密碼子偏愛性，對目的基因進行優化合成，以期提高目的蛋白的表達量。

4 結論

本研究通過RT-PCR從三疣梭子蟹鰓中克隆到編碼PtCrustin3成熟肽的基因mPtCrustin3，經巢式PCR獲得含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點及6×His標簽的目的基因，經與pPICZαA連接成功構建重組表達載體pPICZαA-mPtCrustin3，轉化至畢赤酵母X-33后，在29℃、250 r/m下，經1%甲醇誘導培養96 h后，成功表達重組體mPtCrustin3。本研究為進一步研究三疣梭子蟹PtCrustin3的功能及其應用奠定了良好基礎。

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Recombinant DNAExpression of PtCrustin3 Mature Peptide from Portunus trituberculatus in Pichia pastoris

LU Xi-yang,TAO Yan*
Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation/College of Food Science and Technology/Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China

Crustins are series of small molecular antimicrobial peptides expressed mainly in crustaceans.They play important roles in the animal immune system against pathogenic microorganism infection,thus,they are considered to be good candidates to replace antibiotics.The N-terminal of Crustin contains a signal sequence and its C-terminal contains a mature peptide sequence including the WAP(whey acidic protein)domain.The mature peptide is responsible for bioactivity of Crustin.According to structural differences of the region between signal peptide and WAP domain,Crustin can be divided into three types.The present study focused on the mPtCrustin3,the mature peptide of an isoform for Crustin typeI from Portunustri tuberculatus.The cDNA encoding mPtCrustin3 was cloned from gill of P.tuberculatus by RT-PCR.EcoR I site, and XbaⅠsite and 6×His tag were added to 5’and 3’of this cDNA,respectively,by nested PCR.This target fragment was ligated to pPICZ α A vector to construct a recombinant expression vector pPICZ α A-mPtCrustin3.Then the pPICZαA-mPtCrustin3 was transformed into competent Pichia pastoris X-33 cells.Recombinant mPtCrustin3 was induced with 1.0%(V/V)methanol at 29℃,250 r/m for 96 h.Tricine-SDS-PAGE analysis demonstrated that the expressed product was the recombinant mPtCrustin3 with molecular weight of about 11.6 kD.

Portunus trituberculatus;RT-PCR;Ptcrustin3 mature peptide;Pichia pastoris;recombinant expression

TQ465.6

:A

:1000-2324(2017)02-0303-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2017.02.029

2016-06-01

:2016-07-12

上海市教育委員會產學研項目(15CXY30);農業部都市農業(南方)重點實驗室開放基金(UA201307)

盧希陽(1989-),男,碩士研究生,研究方向:水產生物分子生物學.E-mail:125119453@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:ytao@shou.edu.cn