復方血栓通膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠bFGF的影響

復方血栓通膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠bFGF的影響

李植燦 姚慶陽

目的觀察復方血栓通膠囊對腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）表達的影響。方法建立大鼠腦缺血再灌注模型，于梗塞前和再灌注前5 min灌胃給藥，于再灌注后3 d行神經功能缺損評分，采用免疫組織化學法檢測大鼠缺血區腦組織bFGF表達情況，TTC染色檢測腦梗死體積。結果與缺血再灌注組相比，復方血栓通膠囊治療組大鼠腦組織bFGF的表達升高（P＜0．05）；大鼠神經功能缺損評分及腦梗塞體積減少（P＜0．05）。結論bFGF是腦缺血再灌注損傷的保護性因子，復方血栓通膠囊促進缺血再灌注損傷后腦組織中bFGF的表達而發揮腦保護作用。

復方血栓通膠囊；腦缺血；再灌注損傷；堿性成纖維細胞生長因子

堿性成纖維細胞生長因子是一種重要的神經營養因子，能保護神經細胞、促進神經生長、修復受損神經細胞，對腦缺血損傷的神經功能恢復有很好的改善作用。本研究通過建立腦缺血再灌注大鼠模型，并給予復方血栓通膠囊作為干預藥物，探討復方血栓通膠囊對bFGF的表達的影響及意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要實驗藥物及試劑

健康雄性SD大鼠60只，體質量280～320 g（南京君科生物工程有限公司購買）；復方血栓通膠囊（廣東眾生藥業藥業有限公司）；S-P免疫組化染色試劑盒及AEC試劑盒（上海經科化學科技有限公司）；氯化三苯四氮唑（TTC）染色液（美國Amresco公司）；兔抗大鼠bFGF多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術公司）。

1.2 實驗動物分組及模型制備

60只大鼠隨機分為缺血再灌注組（n=24）、復方血栓通治療組（n=24）及假手術組（n=12）。腦缺血再灌注組和復方血栓通治療組又分為免疫組化組（n=12）及測體積組（n=12）。復方血栓通膠囊用PBS緩沖液配制成混懸液。復方血栓通治療組于梗塞前和再灌注前5 min復方血栓通膠囊混懸液（1 g/kg）灌胃給藥。缺血再灌注組給予等量PBS緩沖液。復方血栓通治療組和缺血再灌注組參考改良Longa線栓法[1]制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，假手術組大鼠僅暴露頸總動脈但不插入線栓，血流阻斷2 h后拔出線栓，形成再灌注。

1.3 神經功能缺損評分

3 d后在大鼠處死前參照Longa[1]法進行神經功能評定：0分：無神經功能缺損癥狀；1分：輕微神經功能缺損，左側前肢不能伸展；2分：中度局灶性神經功能缺損，行走時向左側轉圈；3分：重度局灶性神經功能缺損，行走時向左側傾倒；4分：不能行走，或者意識喪失。其中評分0分和4分均被剔除，同時按要求及時補充大鼠入組，保證每組大鼠只數不變。

1.4 免疫組化法檢測bFGF表達

腦缺血再灌注后3 d，將大鼠用10%水合氯醛深度麻醉，斷頭取腦，置入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，從視交叉吻合端至尾端冠狀連續切片，片厚4 μm，切片經常規脫水、浸蠟、包埋后做成石蠟切片，嚴格按照試劑盒說明書操作，進行bFGF免疫組化染色。bFGF陽性反應物質主要分布在細胞漿，偶見核表達，顯色為紅褐色。使用顯微照相，連續拍照6個高倍視野（×400），分別計數免疫反應陽性的細胞數。

1.5 梗死體積（TTC法）的檢測

測體積組斷頭取腦后，將腦放入-20℃的冰箱速凍10 min，取出大腦后連續冠狀面切片6片，片厚2 mm，將腦片放入盛1%TTC溶液中恒溫避光孵育30 min。腦梗死灶成白色，而正常腦組織為紅色。用數碼相機拍照，利用病理圖象分析儀計算出每個腦片的梗死面積和腦梗塞側半球面積，并計算出體積，V=t（A1+A2+…An）-（A1+An）t/2，其中t為切片厚度，A為梗死面積。為了減小實驗操作誤差，我們以相對梗死體積表示，V%=梗死體積/缺血半球體積×100%。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行分析處理，計量資料以（均數±標準差）表示，采用t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分

假手術組無神經功能缺損癥狀，復方血栓通膠囊治療組和缺血再灌注組表現不同程度神經功能缺損癥狀，兩組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 腦梗死體積

缺血再灌注組和復方血栓通膠囊治療組均可見腦梗死病灶，兩組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 腦缺血組織bFGF表達情況

假手術組偶見少量bFGF陽性細胞的表達，缺血再灌注組及復方血栓通膠囊治療組可見大量bFGF陽性表達，細胞漿染成褐色、紅褐色。與假手術組比較，缺血再灌注組及復方血栓通膠囊治療組bFGF陽性細胞顯著增加（P＜0.05）。與缺血再灌注組相比，復方血栓通膠囊治療組bFGF陽性細胞數增加更加顯著，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1及圖1、2、3。

3 討論

bFGF是一種活性蛋白多肽物質，是細胞的有絲分裂原，可促進多種細胞的有絲分裂，并可促進新生血管生成、生長和發育[2]。腦缺血再再灌注損傷后機體可啟動一個復雜的神經保護網絡，bFGF作為一種重要的神經營養因子，可通過與其相應受體結合發揮神經保護作用[3]。Kawamata等[4]在大鼠腦缺血模型中，經側腦室注入bFGF，發現缺血2 h給藥，可以明顯縮小腦梗死范圍，減少神經元缺失；缺血24 h給藥雖不能降低腦梗死范圍，卻仍能促進神經功能的恢復。本實驗在腦缺血再灌注損傷后，bFGF蛋白的表達明顯上調，與假手術組有顯著性差異，與國內外相關研究基本一致。

表1 神經功能缺損評分、腦梗死體積及bFGF表達的比較 （

表1 神經功能缺損評分、腦梗死體積及bFGF表達的比較 （

注：與假手術組相比較，aP＜0．05；與缺血再灌注組相比較，bP＜0．05

圖1 假手術組大鼠皮層bFGF染色（×400）可見少量陽性細胞數

圖2 缺血再灌注組大鼠皮層bFGF染色（×400）可見大量陽性細胞數

圖3 復方血栓通膠囊治療組大鼠皮層bFGF染色（×400）大量陽性細胞數

復方血栓通膠囊的主要藥用成分為三七總皂苷，并輔以丹參、黃芪、玄參，具有抑制血栓形成、溶栓、擴張血管、保護血管內皮、改善微循環等作用[5]。藥理研究證明：復方血栓通膠囊具有增加凝血酶、促進血塊溶解、縮短凝血時間、抗血栓、促進纖溶、提高缺氧耐受力、增加血流量、增加血管灌流量等作用，是治療血管性疾病的良好藥物[6]。本實驗發現，腦缺血再灌注損傷后予復方血栓通膠囊干預后，大鼠腦梗死體積及神經功能缺損較少，bFGF的表達顯著增高，說明bFGF在復方血栓通膠囊治療腦缺血再灌注損傷表達增高，提示bFGF對缺血腦組織起到保護作用。

[1] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al． Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]． Stroke，1989，20（1）：84-91．

[2] Hughes SE，Crossman D，Hall PA． Expression of basic and acidic fibroblast growth factors and their receptor in normal and atherosclerotic human arteries[J]． Cardiovasc Res，1993，27（7）：1-14．

[3] 聞公靈，婁季宇，白寵英． bFGF對腦缺血再灌注大鼠ICAM-1表達及腦組織含水量的影響[J]． 中國實用神經疾病雜志，2010，13（17）：10-12．

[4] Kawamata T，Dietrich WD，Schallert T，et al． Intracisternal basic fibroblast growth factor enhances functional recovery and up-regulates the expression of a molecular marker of neuronal sprouting following focal cerebral infarction[J]． Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（15）：8179-8184．

[5] 王妮娜，曾曉聰． 復方血栓通膠囊與甲鈷胺聯合治療糖尿病周圍神經病變的療效觀察[J]． 臨床合理用藥，2012，5（5C）：72-73．

[6] 包興旺． 復方血栓通膠囊治療視網膜靜脈阻塞51例[J]． 浙江中醫雜志，2013，48（1）：75．

The Effect of Compound Xueshuantong Capsule on the Expression of bFGF in Brain of Rats With Focal Cerebral Ischemia Reperfusion

LI Zhican YAO Qingyang Department of Neurology, Quanzhou First Hospital Af fi liated to Fujian Medical University, Quanzhou Fujian 362000, China

ObjectiveTo investigate the effects of compound Xueshuantong capsule on the expression of bFGF in the brain after focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsThe establishment of rat cerebral ischemia reperfusion model in pre infarction and reperfusion 5 min before intragastric administration, 3 d after reperfusion, the neurological deficit score, immunohistochemical method to detect the expression of brain tissue in ischemic area of rats bFGF, TTC staining to detect the infarct volume.ResultsCompared with the ischemia-reperfusion group, the expression of bFGF was increased signi fi cantly in compound Xueshuantong treatment group (P＜ 0.05). The infarct size and the scores of neurologicalde fi cit in Xueshuantong capsule treatment group were decreased (P＜ 0.05).ConclusionbFGF is a protective factor in cerebral ischemia reperfusion injury. Xueshuantong capsule could protect the brain injury through increasing the expression of bFGF in brain tissue of rats with cerebral ischema reperfuson.

compound Xueshuantong capsule; cerebral ischemia; reperfusion injury; bFGF

R277．7

A

1674-9316（2017）09-0076-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．09．045

福建醫科大學附屬泉州市第一醫院神經內科，福建 泉州362000