黃鱔PLA2基因的克隆及表達分析

張燕萍，鐘 杰，周秋白，郭 楓，張 俊，鐘潮明，王自蕊

(1.江西農業大學動物科學技術學院，南昌 330045；2.江西省水產科學研究所，南昌 330039)

黃鱔PLA2基因的克隆及表達分析

張燕萍1，2，鐘 杰1，周秋白1，郭 楓1，張 俊1，鐘潮明1，王自蕊1

(1.江西農業大學動物科學技術學院，南昌 330045；2.江西省水產科學研究所，南昌 330039)

利用同源克隆技術和RACE技術克隆黃鱔(Monopterusalbus)磷脂酶A2(PLA2)基因的cDNA全長；并采用熒光定量RT-PCR法檢測PLA2基因在黃鱔各組織中的表達量情況。結果顯示：黃鱔PLA2基因全長cDNA大小為2 606 bp(GenBank登錄號：KX852397)，其中開放閱讀框2 205 bp，編碼736個氨基酸，預測分子大小為83.623 kD，理論等電點5.84；5′和3′非編碼區長度分別為208 bp和193 bp。該蛋白序列沒有信號肽和跨膜結構。氨基酸序列比對和系統樹分析顯示，黃鱔PLA2基因的結構十分保守，黃鱔與大黃魚和金頭鯛的PLA2基因親緣關系最近，與鼠類和蟾蜍的親緣關系較遠。RT-PCR分析表明，PLA2基因在組織中的表達具有組織特異性，在消化器官前腸組織中的表達最高，在性腺及肌肉組織中表達很少。

磷脂酶A2；黃鱔(Monopterusalbus)；克隆；組織表達

磷脂作為細胞膜的重要組成成分[1]，對維持細胞膜功能發揮重要作用。大量研究表明，磷脂在魚蝦胚胎發育、幼體早期發育階段、以及維持魚蝦類正常的生理活動中發揮重要的功能作用[2-3]。在仔稚魚微顆粒飼料中添加磷脂，尤其是磷脂酰膽堿(PC)，可顯著增強仔稚魚的攝食活動，提高脂蛋白合成、脂肪吸收和轉運以及抗應激能力，促進仔稚魚生長等[4-6]。目前，研究者對蛋白酶和淀粉酶在仔稚魚蛋白質和碳水化合物消化代謝過程的作用機制等進行了大量研究。然而，有關幼魚飼料中磷脂消化酶的報道卻很少[7-10]。

磷脂酶A2(Phosphlipase A2, PLA2)是一種重要的代謝和調節酶類，是水解天然磷脂的催化酶，廣泛存在于哺乳動物胰腺、蜂毒和蛇毒中。根據磷脂酶對磷脂水解部位的不同可將磷脂酶分為A1、A2、C和D 4種類型[11]。由于PLA2能特意性水解磷脂sn-2位的脂肪酸，產生溶血磷脂和游離脂肪酸，溶血磷脂和游離的脂肪酸分別在高等動物膜磷脂更新[12]、炎癥反應[13]以及抗菌[14]過程中發揮重要作用，使得PLA2的研究越來越受到關注。PLA2在水產飼料中得到廣泛應用，在魚類飼料中添加PLA2可以幫助分解飼料中的磷脂物質，以便于動物的吸收利用；給仔稚魚飼喂含PLA2的飼料，可明顯提高仔稚魚的脂肪消化能力；將磷脂酶直接飼喂動物或將含磷脂酶的飼料喂養，可以改善飼料利用效率和促進動物生長[15]。迄今為止，已從多種魚類中克隆到PLA2基因的cDNA全長或部分序列，并對其在仔稚魚生長發育過程的表達情況進行了研究。如大黃魚(登錄號：KKF13860.1)、金頭鯛(登錄號: AGV13281.1)、尼羅羅非魚(登錄號: XP_003445168.2)、青鳉(登錄號: BAQ59082.1)、斑馬魚(登錄號: AAA53229.1)等。然而，目前有關黃鱔PLA2基因的研究卻還未見報道。因此，本研究以我國重要經濟魚類黃鱔(MonopterusalbusZuiew)為研究對象，采用RACE技術克隆鑒定黃鱔PLA2基因的cDNA全長序列，進行序列比對分析，并采用實時熒光定量技術分析PLA2基因在黃鱔各組織器官中的表達情況，以期為進一步研究PLA2生物學功能及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用黃鱔及受精卵和仔魚取自于江西農業大學黃鱔繁殖基地。RNA提取試劑Trizol購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T載體、RT-PCR試劑盒、Taq酶、dNTP、3′/5′-RACE試劑盒等購自大連寶生生物公司；Power SYBR Green PCR Master Mix購自賽默飛世爾科技公司。

1.2 取樣方法

基因克隆取樣使用人工飼養體質量約50 g的黃鱔肝臟。尾靜脈放血剖開腹部暴露，剪取肝組織約50～100 mg，立即裝入經DEPC處理、高溫高壓滅菌后的1.5 mL離心管內，投入液氮速凍，-70 ℃冰箱保存備用。基因表達使用的黃鱔組織為腦(N)、肝臟(G)、脾臟(P)、前腸(Q)、中腸(Z)、后腸(H)、腎臟(S)、性腺(S)和肌肉(J)。每個組織6個重復，取樣后立即提取RNA用于基因表達分析。

1.3 引物設計與合成

根據NCBI Genbank數據庫中其他脊椎動物PLA2基因的cDNA序列的保守序列設計克隆黃鱔PLA2基因保守部分的簡并引物，擴增中間片段序列，進而根據測定后的序列設計用于RACE擴增、熒光定量PCR等的引物(表1)。引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 黃鱔PLA2基因克隆與定量分析所用引物Tab.1 Primers used to amplify and express the rice field eel PLA2 gene

1.4 總RNA 提取

總RNA的提取根據Trizol reagent試劑盒說明書操作。總RNA的濃度和純度用紫外分光光度計進行檢測，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和A260/A280比率確定RNA的完整性。

1.5 黃鱔PLA2全長擴增與序列分析

用黃鱔肝臟的總RNA作為模板，根據Smart-RCAE試劑盒說明書逆轉錄合成PLA2基因5′端和3′端的第一鏈cDNA。克隆獲得部分序列后進行3′-RACE和5′-RACE擴增將PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌細胞，選取陽性克隆的菌液送上海生物工程有限公司進行測序。將測序結果采用DNAMAN5.0軟件拼接序列，獲得PLA2基因序列的cDNA全長。

1.6 實時熒光定量 PCR

根據黃鱔PLA2基因的開放閱讀框(ORF)設計qRT-PCR引物PLA2-QF和PLA2-QR，以18 s(登錄號：EU120033.1)為內參(表1)，按照Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific)試劑盒說明書反應體系、用CFX384多重實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)進行熒光定量PCR。循環程序為，95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，63 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，40個循環。18 s的表達量被作為樣品間的參考基因。每樣品重復3次，結果計算采用Livak的2-ΔΔCt方法[16]。

1.7 數據分析

利用在線ORF finder tool軟件預測黃鱔PLA2基因的ORF和相應的氨基酸序列，用DNASTAR軟件對不同物種的PLA2序列進行同源性分析，用SignalP 4.1在線分析PLA2基因的信號肽，并用Mega 4.0的鄰位相鄰法構建蛋白的系統進化樹[17-18]，ExPASy在線軟件預測蛋白質功能位點。數據用平均數±標準差表示，并用Origin 8.0作圖，統計分析采用SPSS 16.0，在單因素方差分析(One-way ANOVA)基礎上采用Duncan’s多重比較法，顯著水平取值P<0.05。

2 結果

2.1 黃鱔PLA2基因全長cDNA的克隆

以黃鱔肝臟組織總cDNA為模板，通過簡并引物進行巢式PCR，獲得370 bp 擴增片段；通過5′和3′ RACE-PCR擴增，分別獲得長度為1 876 bp和530 bp的擴增片段(圖1)。用軟件DNAMAN拼接得到黃鱔PLA2基因全長cDNA序列為2 606 bp(登錄號：KX852397)，包含一個2 205 bp的開放閱

讀框、5′和3′末端的非編碼區分別為208 bp 和193 bp。其ORF編碼1個有736個氨基酸組成的多肽，起始密碼子為ATG和終止密碼子為TAA，3′末端含有1個典型的加尾信號AATAAA和15 bp的Poly(A)尾(圖2)。預測分子質量約為83.623 kD，理論等電點5.84。

圖1 同源片段、5′RACE、3′RACE電泳圖Fig.1 Homologous fragment, 5′RACE, 3′RACE electrophoresis DL5000 Marker：100，250，500，750，1000，1500， 2000，3000，5000

2.2 黃鱔PLA2氨基酸序列分析

序列分析結果表明該蛋白沒有信號肽和跨膜結構，包含3個Ca2+結合、1個PLA2活化位點、9個半胱氨酸位點、1個C2結構域和cPLA2_Grp-IVA結構域。黃鱔PLA2基因和已知其它物種的PLA2氨基酸序列比對結果表明(圖3)，黃鱔PLA2推導的氨基酸序列與深裂眶鋸雀鯛(Stegastespartitus，XP_008293739.1)、大黃魚(Larimichthyscrocea, KKF13860.1)、金頭鯛(Sparusaurata, AGV 13281.1)、青鳉(Oryziaslatipes, BAQ59082.1)和斑馬魚(Daniorerio, NP_571370.1)的PLA2具有較高的同源性，相似性為92%～78%，其中與深裂眶鋸雀鯛PLA2蛋白的相似性最高達92%，其次是大黃魚91%。

2.3 黃鱔PLA2系統進化樹

利用MEGA4.0軟件對黃鱔和其他物種的PLA2氨基酸序列按鄰接法構建系統發育樹(圖4)，結果顯示：魚類的PLA2基因聚類為獨立的分支，其中黃鱔的PLA2基因與大黃魚、金頭鯛的親緣關系最近，與鼠和爪蟾的親緣關系較遠。

圖2 黃鱔PLA2基因cDNA序列及所推導的氨基酸序列Fig.2 cDNA and deduced amino acid sequences of PLA2 of M.albus 起始密碼子ATG、終止密碼子TAA、多聚腺苷酸信號AATAAA都以下劃線 顯示，3個跨膜蛋白結構域用框標注。

圖3 不同魚類PLA2的氨基酸序列比對分析Fig.3 Alignment of the known PLA2′ s amino acid sequences from fish specis RxRH 和GxSGS序列用雙下劃線標注

圖4 基于黃鱔和其他物種PLA2氨基酸序列的 NJ系統進化樹Fig.4 Construction of Neighbor-joining phylogenetic tree based on PLA2 amino acids of M.albus and othe species深裂眶鋸雀鯛:XP_008293739.1;大黃魚:KKF13860.1;金頭鯛:AGV13281.1;青鳉:BAQ59082.1;底鳉:JAR83022.1;斑馬魚:NP_571370.1;尼羅羅非魚:XP_003445168.2;非 洲爪蟾:NP_001080867.1;褐家鼠:NP_598235.2.黃鱔 PLA2基因用黑框標定

2.4 PLA2基因在黃鱔各組織的表達

使用qRT-PCR技術檢測PLA2基因在黃鱔腦、肝臟、前腸、中腸、后腸、性腺、脾臟、腎臟以及肌肉等成體組織中的表達情況，結果(圖5)顯示，PLA2基因在黃鱔被檢測的成體組織中均表達，但在消化系統的前腸組織中高豐度表達，其表達量顯著高于中腸組織(P<0.05)，極顯著高于其他組織(P<0.01)，在性腺及肌肉組織中表達量很少。后腸表達量明顯低于前腸和中腸(P<0.001)。

圖5 RT-PCR 檢測黃鱔 PLA2 的組織特異性表達 Fig.5 Tissue specific expression of PLA2 mRNA in M.albus用單因素方差分析數據,每個柱子上面的不同字母表示顯著差異(P<0.05).組織:腦(N),肝臟(G),脾臟(P),前腸(Q),中腸(Z),后腸(H),腎臟(S),性腺(X),肌肉(J)

3 討論

PLA2是一系列參與磷脂代謝的酶，按照是否依賴鈣離子分為依賴鈣離子的分泌型sPLA2(相對分子質量14×103)、胞漿型cPLA2(相對分子質量85×103)及非鈣依賴型iPLA2[14]。本研究采用同源克隆和RACE技術克隆到黃鱔PLA2基因的全長cDNA 序列，其分子質量為83.623 kD，理論等電點5.84，通過分子大小可以確定本研究克隆到的PLA2屬于胞漿型的。氨基酸序列分析表明它具有3個Ca2+結合位點、1個PLA2活化位點和9個半胱氨酸殘基，具有明顯的PLA2結構特征。與已報道的脊椎動物PLA2氨基酸序列比對，發現克隆到的黃鱔PLA2基因與其他魚類cPLA2基因相似度較高(78%～92%)。系統進化樹分析表明，黃鱔PLA2基因與其他魚類親緣關系較近，與蟾蜍和鼠類親緣關系較遠，符合生物進化規律。本研究還發現，黃鱔PLA2基因與其他物種一樣，其蛋白質含有脂質結合的Ca2+依賴的C2結構域和起催化作用的cPLA2_Grp-IVA結構域[19-20]，C2 結構域與內膜結合是由神經酰胺-1-磷酸的作用決定的，哺乳動物的C2 結構域包含一段可以調節神經酰胺-1-磷酸特異性的精氨酸、精氨酸和組氨酸高度保守序列(RxRH)[21]。將多種魚類的cPLA2基因進行比對，發現只有斑馬魚的cPLA2基因存在RxRH，青鳉、金頭鯛、大黃魚、尼羅羅非魚等魚類的保守序列為精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和組氨酸(RTKH)[22]，而黃鱔的卻是精氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和組氨酸(RTEH)。黃鱔PLA2基因的C2結構域與其他物種存在差異，這表明黃鱔PLA2與膜結合的調節機制可能與其他魚類及哺乳動物不太相同。另外，脂肪酸的保守序列甘氨酸、絲氨酸、甘氨酸和絲氨酸(GxSGS)是區別cPLA2與其他類型PLA2的標志[23]，該保守序列存在于黃鱔和其他魚類的PLA2基因中，且與其他物種高度保守。

多數研究者認為魚類磷脂分解代謝機制與哺乳動物是一致的，均是在腸道內由胰腺分泌的PLA2水解產生溶血磷脂和游離的脂肪酸，再被腸細胞吸收[24]。Fujikawa等[25]對發現的PLA2的新亞型 PLA2-IB基因在真鯛成體消化器官中的組織分布做了詳細研究，表明DE-1 PLA2在消化器官胰腺中表達，DE-2 PLA2不僅在胰腺、胃、幽門盲囊上皮細胞、腸上皮細胞等消化器官中表達，還在非消化器官如心臟、肌纖維以及卵母細胞中表達。Renaud等[26]在哺乳動物、爬行動物、節肢動物的胰腺、胃、腸、脾、心、肝、腦等組織中分離提純到cPLA2，這些研究表明，cPLA2廣泛存在動物各種組織中。本研究發現PLA2基因在黃鱔成體組織中具有器官表達特異性，其在所有檢測組織中均表達，但各組織的表達水平存在差異，該基因主要在成體黃鱔的消化系統腸道組織中表達，在黃鱔前腸組織中表達量最高，其次是中腸，而在性腺和肌肉組織中表達量最低。這表明黃鱔PLA2基因在組織中的表達方式與磷脂消化代謝途徑相一致，磷脂是在腸道中分解代謝的，黃鱔PLA2在前腸、中腸、后腸的表達水平逐漸降低，這表明磷脂主要在黃鱔的前腸中分解代謝，后腸主要是吸收磷脂的水解產物，其表達水平相對較低。在黃鱔腦、肝臟和脾臟組織中較高表達，可能與與其活躍的代謝功能相關，即與特定組織的重要代謝途徑有關，其具體原因還有待于進一步研究。

本研究探明了黃鱔PLA2基因的結構及組織表達模式，豐富了魚類PLA2的生物學基礎，為進一步深入研究魚類PLA2生物學功能和作用機制奠定了基礎。

[1] Fagone P, Jackowski S.Phosphatidylcholine and the CDP-choline cycle [J].Biochim Biophys Acta: Mol Cell Biol Lipids, 2013, 1831(3): 523-532.

[2] Fraser A J, Gamble J C, Sargent J R.Changes in lipid content, lipid class composition and fatty acid composition of developing eggs and unfed larvae of cod (Gadusmorhua) [J].Mar Biol, 1988, 99(3): 307-313.

[3] Rainuzzo J R, Reitan K I, J Rgensen L.Comparative study on the fatty acid and lipid composition of four marine fish larvae [J].Comp Biochem Physiol Part B: Comp Biochem, 1992, 103(1): 21-26.

[4] Koven W, Kolkovski S, Hadas E, et al.Advances in the development of microdiets for gilthead seabream,Sparusaurata: a review [J].Aquaculture, 2001, 194: 107-121.

[5] Tocher D R, Bendiksen E, Campbell P J, et al.The role of phospholipids in nutrition and metabolism of teleost fish [J].Aquaculture, 2008, 280(1): 21-34.

[6] Dapr F, Geurden I, Corraze G, et al.Physiological and molecular responses to dietary phospholipids vary between fry and early juvenile stages of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)[J].Aquaculture, 2011, 319(3/4): 377-384.

[7] Ozkizilcik S, Chu F L E, Place A R.Ontogenetic changes of lipolytic enzymes in striped bass (Moronesaxatilis)[J].Comp Biochem Physiol B, 1996, 113: 631-637.

[8] Evans R P, Parrish C C, Zhu P, et al.Changes in phospholipase A2 activity and lipid content during early development of Atlantic halibut (Hippoglossushippoglossus) [J].Mar Biol 1998, 130: 369-376.

[9] Zambonino I J L, Cahu C L.High dietary lipid levels enhance digestive tract maturation and improveDicentrarchuslabraxlarval development [J].J Nutr, 1999, 129: 1195-1200.

[10] Srivastava A S, Kurokawa T, Suzuki T.mRNA expression of pancreatic enzyme precursors and estimation of protein digestibility in first feeding larvae of the Japanese flounder,Paralichthysolivaceus[J].Comp Biochem Physiol A, 2002, 132: 629-635.

[11]張 鷺,張 浩.磷脂酶A2機器功能概述[J].齊齊哈爾醫學院學報,2004,25(2):178-180.

[12] Soupene E, Fyrst H, Kuypers F A.Mammalianacyl-CoA: lysophosphatidy lcholine acyltransferase enzymes [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(1): 88-93.

[13] Burke J E, Dennis E A.Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling [J].J Lipid Res, 2009, 50(Suppl): S237-S242.

[14]楊 磊,孟慶雄.磷脂酶A的研究進展[J].食品與藥品,2007,9(7):57-54.

[15]李維林.利用磷脂酶A2提高動物對飼料的利用率[J].湖北農業科學,2003,(3):92-93.

[16] Livak K J, Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-DeltaDelta C (T)) Method [J].Methods, 2001, 25: 402-408.

[17] Hofmeister W, Devine C A, Rothnagel J A, et al.Frizzled-3a and slit2 genetically interact to modulate midline axon crossing in the telencephalon [J].Mech Dev, 2012, 129(5/8): 109-124.

[18] Adler P.Planar signaling and morphogenesis in Drosophila [J].Dev Cell, 2002, 2(5): 525-553.

[19] Uozumi N, Shimizu T.Roles for cytosolic phospholipase A2 as revealed by gene-targeted mice [J].Prostaglandins Other Lipid Mediators, 2002, 68: 59-69.

[20] Hsu Y H, Burke J E, Stephens D L, et al.Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry [J].J Biol Chem, 2008, 283(15): 9820-9827.

[21] Lee L K, Bryant K J, Bouveret R, et al.Selective inhibition of human group II A- secreted phosphorlipase A2 (hGⅡA) signaling reveals arachidonicacid metabolism is associated with colocalization of hGⅡA to vimentin in rheumatoid synoviocytes [J].J Biol Chem, 2013, 288(21): 15269-15279.

[22]馮碩恒,謝奉軍,蔡佐楠,等.胞質型磷脂酶A2基因克隆及其表達量隨大黃魚仔稚魚生長發育的變化[J].動物營養學報,2014,26(9):2883-2891.

[23] Mansfeld J, Gebauer S, Dathe K, et al.Secretory phospholipase A2 fromArabidopsisthaliana: insights into the three-dimensional structure and the amino acids involved in catalysis [J].Biochemistry, 2006, 45(18): 5687-5694.

[24] Henderson R J, Tocher D R.The lipid composition and biochemistry of freshwater fish [J].Prog Lipid Res, 1987, 26(4): 281-347.

[25] Fujinkawa Y, Shimikawa M, Satoh F, et al.Ontogeny of gene expression of group IB phospholipase A2 isoforms in the red sea bream, Pagrus (Chrysophrys) major [J].Comp Biochem Physiol Part A: Mol Integr Physiol, 2012, 161(2): 185-192.

[26] Renaud C, Fernando Z, Baltazar B, et al.Phospholipin, a novel heterodimeric phospholipase A2 from pandinus imperator scorpion venom [J].FEBS Letters, 1999, 460: 447-450.

(責任編輯：張瀟峮)

Cloning and expression analysis of PLA2 fromMonopterusalbus

ZHANG Yan-ping1,2, ZHONG Jie1, ZHOU Qiu-bai1, GUO Feng1, ZHANG Jun1, ZHONG Chao-ming1, WANG Zi-rui1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China;2.JiangxiFisheriesResearchInstitute,Nanchang330039，China)

In the present study, the rapid-amplification of cDNA ends (RACE) was used to the cDNA sequences of cytosolic phospholipase A2 (PLA2) ofMonopterusalbus, and the tissue expression analysis was used by RT-PCR in different tissues.The results indicated that the full length cDNA sequence ofM.albusPLA2 consist of 2 606 bp, containing an open reading frame (ORF) of 205 bp.It contains a 208 bp 5′ untranslated region (UTR) and a 193 bp 3′ terminal UTR.The putative PLA2 is predicted to be a peptide of 735 amino acids, with a calculated molecular weight of 83.623 kD and an isoelectric point of 5.84.The PLA2 has not predicted signal peptide and transmembrane helices.Amino acid alignment and phylogenetic analyses results showed that the PLA2 amino acid sequence ofM.albuswas relatively conserved in fish, PLA2 of rice field eel was more closely related to that ofLarimichthyscroceaandSparusaurata, but had a distant relationship with rats and toad.The RT-PCR analysis showed that the PLA2 presented the tissue specificity to varying degrees.PLA2 mRNA is constitutively expressed in all the examined organs of healthy rice field eel, with the highest level in foregut of intestinal digestive organs, and with the lower level in gland and muscle.

cytosolic phospholipase A2 (PLA2);Monopterusalbus; cloning; tissue expression

2016-09-17；

2016-11-30

國家自然科學基金(31360641)

張燕萍(1979-)，女，博士，助理研究員，主要從事水生動物遺傳育種和漁業資源調查。E-mail: zhangyanpingxie@163.com。鐘杰與第一作者同等貢獻。

周秋白。E-mail: zhouqiubai@163.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)03-0016-09