雷公藤單萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表達分析

胡添源　蘇平　張逸風　關紅雨　周家偉　童宇茹　高偉　黃璐琦

[摘要] 該研究克隆得到1條雷公藤單萜合酶基因TwMS。其完整開放閱讀框為1 797 bp，編碼579個氨基酸，相對分子質量為69.75 kDa、理論等電點為5.37。生物信息學分析表明，TwMS具有單萜合酶的特征結構域，屬于萜類合酶TPSb亞家族。實時熒光定量PCR檢測顯示，經茉莉酸甲酯（MeJA）誘導后，TwMS的相對表達量顯著上調，并在24 h達到最高。此外，該研究在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達TwMS蛋白，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

[關鍵詞] 雷公藤； 單萜合酶； 生物信息學分析； 基因表達分析； 蛋白表達

Cloning and protein expression analysis of monoterpene synthase gene TwMS in Tripterygium wilfordii

HU Tianyuan1， SU Ping2， ZHANG Yifeng1，2， GUAN Hongyu 1，2， ZHOU Jiawei1 ，

TONG Yuru1，2， GAO Wei1*， HUANG Luqi2

（1.Key Laboratory of Collateral Diseases， School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University，

Beijing 100069， China；

2.State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， Chinese

Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] In this study， we cloned a monoterpene synthases， TwMS from Tripterygium wilfordii suspension cells. TwMS gene contained a 1 797 bp open reading frame （ORF）， encoding a polypeptide of 579 amino acids， which deduced isoelectric point （pI） was 6.10 and the calculated molecular weight was 69.75 kDa. Bioinformation analysis showed that the sequence of TwMS was consistent with the feature of monoterpene synthases. Differential expression analysis revealed that the relative expression level of TwMS increased significantly after being induced by methyl jasmonate （MeJA）. The highest expression level occurred at 24 h. TwMS protein was successfully expressed in Escherichia coli BL21 （DE3）， which laid the foundation for identifying the function of T. wilfordii monoterpene synthases.

[Key words] Tripterygium wilfordii； monoterpene synthases； bioinformatics analysis； mRNA expression analysis； protein expression

中藥雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.來源于衛矛科植物雷公藤的根或根的木質部，具有祛風除濕、通絡止痛、活血消腫，殺蟲解毒等功效。現代研究表明，雷公藤的藥用活性成分萜類物質具有顯著的抗炎、抗腫瘤、調節免疫等藥理活性[1]，其主要活性成分包括二萜類成分雷公藤甲素和三萜類成分雷公藤紅素等。其中雷公藤甲素可有效抑制腫瘤細胞生長，對胰腺癌的治療效果顯著[23]，此外，雷公藤甲素還具有神經營養活性，是治療帕金森和老年癡呆等疾病的重要活性分子[45]。雷公藤紅素除了具有神經保護作用和抗遺傳性疾病等作用外，近年來還被報導是一種瘦素增敏劑，可以起到減肥的作用[6]。

單萜化合物是由2個異戊二烯結構單元組成的鏈狀或環狀化合物，廣泛存在于植物揮發油和樹脂中[7]。 單萜化合物多具有較強的香氣和生物活性，在植物種群競爭、吸引昆蟲傳粉、防御植食性動物和控制病蟲害發生等方面發揮著重要作用[810]。植物單萜由質體內的4磷酸2甲基赤蘚糖 （2CmethylDerythritol4phosphate，MEP）途徑合成，其前體物質為牻牛兒基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）。單萜合酶 （monoterpenesynthases，monoTPS）是單萜生物合成的關鍵酶，單萜合酶基因的表達是植物生長發育過程中所必須的，具有明顯的時空表達規律，其基因家族的不同成員往往在組織或器官的特定發育階段表達，以合成植物通訊和生物防御所需的化感物質[1112]。單萜合酶基因的表達對環境的影響極為敏感，生物脅迫等外在壓力可激活單萜合酶基因表達生成相應的單萜化合物，以對付食草動物、病蟲害和病原菌等，很多單萜是植物防御系統的重要組成部分[10，13]，對植物的生長發育具有重要意義。

本研究首次克隆得到1條雷公藤的單萜合酶基因，并對其進行了生物信息學分析、茉莉酸甲酯（MeJA）誘導表達分析，以及IPTG 誘導蛋白表達分析等研究，為深入研究雷公藤單萜合酶基因功能以及對雷公藤植物生長發育的調控機制奠定了基礎。

1 材料

1.1 雷公藤懸浮細胞

實驗所用材料來源于本實驗室繼代保存的懸浮細胞。培養方法：在含有 0.5 mg·L-1 2，4D （2，4二氯苯氧乙酸） +0.1 mg·L-1 KT （激動素） + 0.5 mg·L-1 IBA （吲哚丁酸） 的MS 液體培養基中，于25 ℃，120 r·min-1黑暗條件下振蕩培養。

1.2 菌株

實驗中使用的 Escherichia coli trans 5α及E.coli BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 試劑及儀器

2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASYT3 Cloning Kit 購自北京全式金生物技術有限公司；RNA 純化試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒、Fast Quant RT Kit （With gDNase） 購自天根生化科技（北京）有限公司； KAPA SYBR FAST Universal 2×qPCR MasterMix 購自 KAPA Biosystems 公司；Dnase I，Phusion HF PCR Master Mix，BamHⅠ 限制性內切酶，PstⅠ 限制性內切酶及 T4 DNA 連接酶購自NEB（北京）有限公司； IPTG 為 Sigma 品牌，購自泰科蘭博生物科技有限公司；其他化學試劑為國產分析純。PCR 擴增儀型號為 ABIverity；實時定量 PCR 儀型號為 ABI 7300 系統；蛋白電泳儀型號為BIORAD Mini PROTEAN Tetra System；蛋白掃描儀型號為 UMAX PowerLOOK 21OOXLUSB；引物合成及測序服務由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

2 方法

2.1 雷公藤總RNA提取

取培養 10 d的雷公藤懸浮細胞，加入 MeJA誘導子，使之終濃度為 50 μmol·L-1。分別于誘導后 0，4，12，48，72 h 后取材，液氮速凍后置于-80 ℃ 冰箱保存。利用 CTAB 法提取雷公藤懸浮細胞總 RNA，并用 DNase （NEB） 和 RNA 純化試劑盒去除基因組污染，將純化的 RNA用液氮速凍后置于-80 ℃ 冰箱保存。

2.2 雷公藤單萜合酶基因克隆與測序

參考雷公藤懸浮細胞轉錄組數據結合NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） BLAST，獲得雷公藤單萜合酶TwMS基因序列和開放閱讀框（open reading frame，ORF），設計cDNA克隆引物（表1）。利用FastQuant RT Kit （With gDNase）將純化得到的雷公藤懸浮細胞總RNA反轉錄成cDNA，將各時間點的cDNA取出少量混合，作為單萜合酶全長基因克隆的模板。根據 Phusion HF PCR Master Mix 說明書配制PCR體系：cDNA 2 μL，2×Phusion HF PCR Master Mix 25 μL，正反向引物各2.5 μL （10 μmol·L-1），ddH2O 補足到50 μL。反應程序： 98 ℃ 30 s； 98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，重復 35 個循環；72 ℃ 5min。 將 PCR產物切膠回收后連接 pEASYT3 載體，轉化至大腸桿菌 trans5α克隆感受態細胞中，通過菌液PCR挑選陽性克隆進行測序驗證。

2.3 TwMS基因序列的生物信息學分析

將測序得到序列通過InterPro在線軟件（http：// www.ebi.ac.uk /Tools/InterProScan）進行結構域分析，PRABIGERLAND（https：//npsaprabi.ibcp.fr/）進行二級結構預測，TargetP1.1 server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進行信號肽分析，ExPAS ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）預測蛋白相對分子質量和理論等電點，TRMHMM server v2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）進行跨膜域分析，Psort（http：//psort.hgc.jp/）及Wolfpsort（http：//wolfpsort.org/）分析亞細胞定位，SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/） 進行二級結構分析和結構域的三維同源建模。根據NCBI BLAST結果下載同源序列，分別使用DNAMAN軟件和MEGA 5.0軟件進行多重序列比對和系統進化樹的構建。

2.4 TwMS基因的表達分析

以反轉錄得到的MeJA 誘導不同時間的cDNA為模板，選取βactin 作為看家基因，檢測雷公藤懸浮細胞中單萜合酶TwMS基因表達量的變化，設計實時熒光定量引物（表2）。反應體系如下：2×SYBR green Mix 10 μL，ROX 校正染料 0.4 μL，正反向引各 0.4 μL （10 μmol·L-1），ddH2O補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環。每個循環后采集熒光信號，65～95 ℃ 做溶解曲線分析。反應結束后分析擴增曲線和溶解曲線。每個樣品做技術重復3次，并通過2-ΔΔCT法[14]分析TwMS基因的相對表達量。

2.5 TwMS 的蛋白表達分析

2.5.1 TwMS 表達載體構建 選擇重組蛋白表達載體pMALc2X，對載體和基因序列的限制性酶切位點進行分析，選取BamH Ⅰ 和 Pst Ⅰ作為載體構建的連接位點。在雷公藤單萜合酶基因TwMS的ORF兩端設計添加限制性酶切位點的引物（表3），使用NEB Phusion HF PCR Master Mix進行PCR擴增，產物經切膠回收后，將回收得到已添加酶切位點的目的片段與載體分別進行雙酶切，反應體系：Cutsmart buffer 5 μL，BamH Ⅰ 1 μL，Pst Ⅰ 1 μL，載體或片段5 μL，ddH2O補足至50 μL。反應條件為37 ℃，1 h。反應結束后將酶切產物進行切膠純化，回收產物測濃度后按照NEB T4 DNA 連接酶說明書配制反應體系，并于16 ℃，連接過夜。將連接產物轉化至大腸桿菌 trans5α克隆感受態細胞中，涂布在含有100 mg·L-1Amp的LB固體培養基上過夜培養，選取單克隆進行菌液PCR驗證，并將陽性結果送公司測序驗證。將測序結果正確的菌液擴大培養，保菌、提取質粒，得到的重組質粒即為構建成功的pMALc2XTwMS。

2.5.2 IPTG誘導蛋白表達 將重組質粒pMALc2XTwMS與空載體pMALc2X分別轉化到大腸桿菌 BL21（DE3）表達感受態細胞中，挑取陽性單克隆于2 mL LB+100 mg·L-1Amp的液體培養基中，37 ℃ 250 r·min-1培養至A600為 0.6～1.0，取1 mL離心收集菌體，棄上清，用新的培養基重懸，轉移至50 mL 的LB+100 mg·L-1Amp液體培養基中，37 ℃ 250 r·min-1搖到A600約 0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropylbetaDthiogalactopyranoside，IPTG）至終濃度 1 mmol·L-1，20 ℃，200 r·min-1誘導12 h。將誘導完的菌液4 ℃，3 000 r·min-1離心20 min收集菌體，用新制的TrisHCl 緩沖液（50 mmol·L-1 Tris/HCl （pH 7.5），500 mmol·L-1 KCl，1 mmol·L-1 MnCl2，5 mmol·L-1 dithiothreitol，0.05% NaHSO3，10% glycerol）清洗2次，最后用5 mL TrisHCl 緩沖液重懸菌體。將重懸菌液置于冰中，超聲破碎5 min（功率30%，超聲5 s，暫停5 s），重復破碎1次后4 ℃，12 000 r·min-1離心 30 min，分離上清與沉淀，取上清再離心20 min，再次取上清，即為蛋白粗提物。

以含有空載體pMALc2X的大腸桿菌BL21（DE3）表達的蛋白粗提物為對照，與上述含有重組質粒大腸桿菌BL21（DE3）表達的蛋白粗提物上清共同進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳檢測。

3 結果與分析

3.1 雷公藤TwMS全長 cDNA 的獲得

設計特異性引物以雷公藤懸浮細胞cDNA為模板進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 800 bp附近有明亮單一的條帶（圖1），與預期目的條帶大小一致。測序結果表明，TwMS的ORF大小為1 797 bp，編碼579個氨基酸。

3.2 同源性比對及系統進化分析

將得到序列在NCBI上進行 BLAST，發現TwMS與其他植物的單萜合酶具有較高的同源性，與毛果楊Populus trichocarpa、葡萄Vitis vinifera、冬青櫟Quercus ilex、黑楊Populus nigra、蓖麻Ricinus communis等植物單萜合酶的相似度均大于50%。通過Editseq軟件將TwMS序列翻譯成氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進行多重序列比對。比對結果顯示， TwMS基因含有多個萜類合酶基因的高度保守結構域，包括富含天冬氨酸的底物結合基序DDxxD，N末端精氨酸富集基序RRx8W，C末端NSE/DTE基序以及DDxxD上游35個氨基酸處的高度保守域RxR基序（圖2），符合被子植物單萜合酶序列特征[15]。

將TwMS與其他15個不同來源的單萜合酶氨基酸序列進行比對，通過軟件 MEGA 5.0相鄰連接法構建系統進化樹（圖3）。在萜類合酶7個亞家族（TPSag）中，單萜合酶分布于b，d，f，g 4個亞家族[1516]。裸子植物單萜合酶歸屬于TPSd亞家族，均包含一個RRx8W基序，譜系分化小；被子植物單萜合酶進化較快，分化較大，其中TPSg 亞家族單萜合酶缺少RRx8W基序，催化產物形成非環狀、易揮發單萜[17]；大多數被子植物單萜合酶屬于TPSb 亞家族，包含1個RRx8W基序；而TPSf亞家族是比較古老的分枝，主要成員包括仙女扇單萜合酶和擬南芥單萜合酶TPS04。進化樹分析表明，雷公藤單萜合酶TwMS與被子植物黑楊P. nigra親緣關系最近，歸屬于被子植物單萜合酶TPSb亞家族，與TPSf亞家族親緣關系較遠。

3.3 理化性質與 3 D 結構預測

TwMS蛋白的相對分子質量為69.75 kDa、理論等電點為5.37，為親水性蛋白。信號肽分析顯示無信號肽，跨膜域分析結果表明其為非膜蛋白，無分泌蛋白。亞細胞定位預測結果顯示TwMS可能定位在內質網或質膜上。結構域分析表明，TwMS在62～270 aa 處含有萜環化酶/異戊烯基轉移酶結構域，65～245 aa處編碼N末端結構域，276～540 aa處含有1個金屬結合結構域。TwMS蛋白的二級結構預測結果顯示：無規則卷曲和α螺旋結構是其主要結構原件，無規則卷曲占49.41%，α螺旋結構占39.36%，剩余11.22%是長鏈結構。蛋白三維結構以4Slimonene synthase 2ong.1.A [18]為同源建模模板，建模范圍為 56～596位氨基酸殘基，序列同源性為44.80%（圖4）。

3.4 MeJA 誘導TwMS基因表達分析

利用MeJA對雷公藤懸浮細胞進行誘導，利用實時熒光定量 PCR 檢測以及 2-ΔΔCt 分析對TwMS基因進行相對定量表達分析表明，雷公藤單萜合酶基因TwMS對MeJA的誘導非常敏感，誘導后12 h，MeJA 處理組中基因的表達量上升到0 h的670倍，并于24 h達到最高誘導水平，處理組基因表達水平是同期對照組的1 172.3倍，240 h時TwMS基因的表達恢復至正常水平。

3.5 IPTG 誘導 TwMS蛋白表達分析

TwMS蛋白誘導表達的SDSPAGE 掃描結果表明，在 IPTG 誘導大腸桿菌BL21（DE3）表達后，含有pMALc2X空載質粒的菌株在 42 kDa 處表達了MBP 標簽蛋白，含有重組質粒pMALc2XTwMS的菌株在約112 kDa 處有蛋白條帶，而空載體菌株在相同的位置無蛋白表達，說明雷公藤單萜合酶基因PtTPS.terpene synthase. Populus trichocarpa （AII32476）；Vvter1.（-）alphaterpineol synthase. Vitis vinifera （Q6PWU2）；Vvter2.（-）alphaterpineol synthase V. vinifera （NP001268216）；QiMYR. Myrcene synthase. Quercus ilex （Q93X23.1）；PnTPS.monoterpene synthase. P. nigra （AHY21666）；紅色標識表示特征結構域。

4 討論

單萜合酶催化GPP合成種類繁多、功能各異的單萜類化合物，在植物種群競爭、吸引昆蟲傳粉、生物防御等方面發揮著極其重要的作用。本研究首次在重要藥用植物雷公藤中克隆得到單萜合酶，并通過生物信息學分析等手段對該基因進行研究，發現該基因編碼蛋白具有典型的單萜合酶結構域，屬于萜類合酶TPSb亞家族，但由于單萜合酶基因家族

基因種類繁多，通過序列比對、蛋白結構預測等手段較難推測該單萜合酶的具體催化產物，因此命名為Tripterygium wilfordii monoterpene synthases，簡稱TwMS。研究發現，TwMS基因對MeJA的誘導異常敏感，表達量可上調至1 000倍以上，而MeJA等誘導子誘導基因表達水平的上調可有效提高雷公藤萜類成分的產量[19]，由此推測，TwMS基因很可能參與了雷公藤萜類產物的代謝。單萜合酶基因會因環境刺激、生物脅迫等原因迅速表達，由MeJA誘導的敏感程度來看，TwMS基因很有可能在雷公藤的應激或生物防御過程中發揮作用。此外，本研究成功在大腸桿菌中對TwMS基因進行了異源表達，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

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[責任編輯 呂冬梅]