丹皮酚對皮質下缺血性血管性癡呆小鼠認知功能的保護作用及機制

王浩+李中春++王百辰++張震中

[摘要] 目的 探討丹皮酚對皮質下缺血性血管性癡呆（subcortical ischemic vascular dementia， SIVD）小鼠的認知功能的作用及機制。 方法 小鼠隨機分為假手術組、模型組、丹皮酚低劑量與高劑量組，以永久性結扎小鼠單側頸總動脈建立皮質下缺血性血管性癡呆模型，假手術組只分離右頸總動脈，不進行血管結扎。期間每天給予生理鹽水或丹皮酚（20、40 mg/kg），以開放場實驗、水迷宮等方法檢測小鼠行為學變化，以分光光度計法檢測海馬組織勻漿膽堿乙酰轉移酶（ChAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性。 結果 與假手術組比較，手術組小鼠的運動量沒有改變（P>0.05）。與模型組比較，其中丹皮酚高劑量（40 mg/kg）能明顯延長SIVD小鼠在中心區活動中的探索時間，并改善SIVD小鼠學習記憶能力下降，表現為丹皮酚（40 mg/kg ）治療后小鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期縮短，穿越原平臺時間以及穿臺次數均增多（P<0.05）。此外，與模型組比較，丹皮酚（40 mg/kg）治療還能降低SIVD小鼠海馬組織AChE活性，升高ChAT活性（P<0.05）。而與模型組比較，丹皮酚（20 mg/kg）治療則各指標沒有顯著性差異（P>0.05）。 結論 丹皮酚對SIVD小鼠認知功能下降具有保護作用，其機制可能與增加膽堿遞質合成，減少膽堿遞質分解有關。

[關鍵詞] 海馬；皮質下缺血性血管性癡呆；丹皮酚；膽堿乙酰轉移酶；乙酰膽堿酯酶

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）35-0031-05

Protective effect and mechanism of paeonol on cognitive function in the mice with subcortical ischemic vascular dementia

WANG Hao LI Zhongchun WANG Baichen ZHANG Zhenzhong

Department of Neurology， Tongde Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310012， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of paeonol on cognitive function in the mice with subcortical ischemic vascular dementia（SIVD）. Methods The mice were randomly divided into sham operation group， model group， paeonol low dose group and paeonol high dose group. The model of subcortical ischemic vascular dementia was established by permanent ligation of unilateral common carotid arteries in mice. In the sham operation group， only the right common carotid artery was isolated and no vascular ligation was performed. During the period， the mice were daily given normal saline or paeonol（20， 40 mg/kg）. The behavioral changes of mice were detected by open field test and water maze. The activities of homogenate choline acetyltransferase（ChAT） and acetylcholinesterase（AChE） in hippocampus tissue were detected by spectrophotometer. Results Compared with the sham operation group， there was no change in the exercise amount of the mice in the operation group （P>0.05）. Compared with the model group， paeonol （40 mg/kg） could significantly prolong the exploration time of SIVD mice in the central area， and improve the decreasing learning and memory ability of SIVD mice. It shown that the escape latency of Morris water maze was reduced in the mice after paeonol treatment （40 mg/kg）， and the crossing platform time and the number of crossing were increased （P<0.05）. In addition， compared with the model group， paeonol（40 mg/kg） could decrease AChE activity and increase ChAT activity in hippocampus of SIVD mice（P<0.05）. Compared with the model group， there was no significant difference in all indicators in paeonol （20 mg/kg） treatment（P>0.05）. Conclusion Paeonol has a protective effect on the decline of cognitive function in SIVD mice. The mechanism may be related to the increase of synthesis of cholinergic neurotransmitters and the decrease of decomposition of cholinergic transmitter.

[Key words] Hippocampus； Subcortical ischemic vascular dementia （SIVD）； Paeonol； Choline acetyltransferase （ChAT）； Acetylcholinesterase （AChE）

血管性癡呆（vascular dementia，VD） 是由各種腦血管因素造成腦組織損害繼而引起的獲得性智能障礙綜合征，是一種慢性進行性疾病，發病率僅次于阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）[1]。其中，皮質下缺血性血管性癡呆（subcortical ischemic vascular dementia， SIVD）是VD中的一種常見亞型，占全部VD的50%以上，臨床表現為腦皮質下多發性的腔隙性腦梗死及缺血性病變[2]。目前SIVD的確切發病機制尚不清楚，臨床上膽堿酯酶抑制劑、血管擴張藥等通不同的作用機制發揮一定程度的保護作用，但是尚無特效治療藥物[3，4]。既往實驗證明，丹皮酚制劑具有一定的神經保護作用[5-9]。本文采用永久性結扎右頸總動脈（right unilateral common carotid arteries occlusion，rUCCAO）方法建立小鼠SIVD模型來探討丹皮酚對SIVD小鼠認知功能的保護作用，并初步探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組

C57BL/6 小鼠，體重22～28 g，購自浙江省實驗動物中心[合格證0002868，許可證號SCXK（浙）2003-0001]，共40只。小鼠飼養在（22±1）℃、12 h明暗循環的環境下，自由飲食攝水。行為學實驗均安排在10：00～17：00進行。小鼠隨機分為假手術（Sham）組、皮質下缺血性血管性癡呆（SIVD）組、丹皮酚（Pae）低、高劑量治療組，每組10只。

1.2藥品與試劑

丹皮酚注射液（10 mg/支） 購自上海第一生化藥業公司。乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿乙酰轉移酶（ChAT）以及蛋白定量檢測試劑盒購自南京建成生物公司。

1.3 動物模型的建立

參照文獻[4，10]，使用水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，頸部皮膚消毒后，做皮膚正中切口，鈍性分離出小鼠右頸總動脈，采用手術縫線永久性結扎右頸總動脈，隨后逐層縫合小鼠頸部的肌肉皮膚。將小鼠術后放入保溫箱中直至其蘇醒，術后常規對小鼠進行抗感染治療。假手術組只分離右頸總動脈，不進行血管結扎。丹皮酚低劑量與高劑量治療組小鼠從術后第1天分別開始腹腔注射丹皮酚注射液（20或40 mg/kg），每天1次，共注射28 d；而模型組與假手術組小鼠分別注射等容量的生理鹽水。手術后第29天對小鼠進行開放場行為學檢測，術后第30天開始進行水迷宮實驗。

1.4開放場實驗

用于檢測小鼠進入開闊環境后的自發活動和探索能力的變化。在實驗手術后第29 天時把小鼠放進自發活動監測箱中，實時記錄小鼠10 min活動的情況，采用視頻跟蹤分析系統進行錄象，并同時跟蹤測定小鼠的活動距離、中心區的活動時間。實驗完成后，采用自發活動視頻分析軟件系統分析小鼠活動的各項參數。

1.5水迷宮實驗

用于測量小鼠學習記憶能力，迷宮上方安置帶有顯示系統的攝象機，同步記錄小鼠運動軌跡，數據采集和分析軟件記錄相關數據及圖象結果。整個實驗過程分為定位航行實驗和空間搜索實驗兩部分。

1.5.1 定位航行實驗 術后第30天開始對各組小鼠進行Morris水迷宮實驗。實驗歷時5 d，實驗前小鼠自由游泳2 min，進行適應性訓練。正式實驗每天訓練1次，每次120 s，記錄每只小鼠尋找并跳上平臺所需要的時間即逃避潛伏期（Escape latency）。如果在120 s內小鼠沒有尋找到平臺，由實驗者將其引導至平臺，逃避潛伏期記為120 s。每次訓練完迅速擦干小鼠，置于加熱器旁，防止小鼠低體溫。每只小鼠隨機從不同象限分別放入水中，每天每個象限均放入1次，用于計算每天逃避潛伏期。

1.5.2 空間搜索實驗 用于測量小鼠的記憶保持能力。實驗第6天撤去平臺，從任意一個入水點將小鼠放入水中，在水中游泳120 s，分別測量在此期間：小鼠在目標象限以及其他象限游泳的時間；穿越目標（原平臺位置）次數。

1.6腦組織ChAT、AChE 活性的測定

待行為學檢測全部結束后，麻醉小鼠后迅速取腦，在冰上分理出海馬組織，用于制作10%的組織勻漿，4℃ 3000 rpm，離心10 min，取此上清液備用。ChAT 的測定是以乙酰輔酶A和膽堿為底物，檢測324 nm處吸光度；AChE 水解乙酰膽堿生成膽堿和乙酸，檢測412 nm 處吸光度，以此分別用于計算ChAT、AChE 活性。操作具體步驟嚴格按照檢測試劑盒的說明書進行。

1.7統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1丹皮酚對rUCCAO誘導的SIVD小鼠開放場實驗的影響

手術后29 d小鼠運動量檢測發現，與假手術組相比，SIVD組小鼠的總活動距離沒有顯著性差異，并且丹皮酚（20、40 mg/kg）給藥對小鼠的總活動距離也沒有影響，因此可以進行其他受運動量影響的認知功能實驗。開放場實驗中，小鼠在中間區域停留時間越長，說明其探索能力越強。通過分析結果顯示，與假手術組相比，SIVD模型組動物在中間區域停留時間明顯降低（P<0.01），而丹皮酚高劑量（40 mg/kg）能明顯逆轉由手術引起的小鼠在中間區域停留時間的降低（P<0.05）。見表1。

2.2 丹皮酚對rUCCAO 誘導的SIVD小鼠Morris水迷宮實驗的影響

2.3.1 定位航行實驗 隨著訓練的增加，各組小鼠的逃避潛伏期（Escape latency）均有程度不同的縮短。與假手術組相比，模型組小鼠的逃避潛伏期顯著增加（P<0.01）；而與SIVD模型組比較，丹皮酚高劑量（40 mg/kg）治療組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異具有顯著性（P<0.05），見表2。

2.3.2 空間搜索實驗 與假手術組相比，SIVD模型組穿越原平臺象限的時間明顯縮短，穿臺次數明顯減少（P<0.01）；而與SIVD模型組比較，丹皮酚高劑量（40 mg/kg ）組穿越原平臺象限的時間明顯延長，穿臺次數明顯增加，差異具有顯著性（P<0.05），見表3。

2.3丹皮酚對rUCCAO 誘導的SIVD小鼠海馬組織中ChAT、AChE活性的影響

與假手術組比較，SIVD模型組小鼠海馬組織勻漿中AChE的活性明顯升高，ChAT的活性明顯下降（P<0.01）。而與SIVD模型組比較，丹皮酚高劑量（40 mg/kg）治療組能夠顯著升高SIVD小鼠海馬組織ChAT活性，并降低SIVD小鼠海馬中AChE活性（P<0.05），見表4。

3 討論

SIVD是一組以小血管病變為主要病因、以皮質下多發性腔隙性梗死和腦白質病變為主要損害的缺血性腦血管病，是引起血管性認知功能障礙最常見的亞型。不同于阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）、路易小體癡呆（Dementiawith Lewy bodies，DLB）及額顳葉癡呆（fronto temporal dementia，FTD），SIVD的臨床及病理實質改變主要集中在大腦白質，表現為認知功能障礙和膠質細胞激活，而不在于神經元[4，11，12]。目前常用的VD實驗動物模型主要是雙側頸總動脈永久結扎模型（2-VO）以及改良的反復缺血再灌注模型等，但這些對于建立小鼠模型，死亡率相對較高、部分有運動系統損傷、認知功能改變差異較大[13，14]。建立易復制的理想的動物模型對探明血管性癡呆發生機制以及后續的療效篩選非常重要。文獻采取永久性結扎右頸總動脈（rUCCAO）方法建立小鼠模型，報道該模型操作相對簡單、死亡率低并且易于重復，對小鼠的運動系統也沒有明顯損傷，因此可以進行后續的行為學檢測[4，11]。研究表明rUCCAO 誘導的慢性缺血會損傷小鼠的空間和非空間學習記憶，可引起模型小鼠水迷宮實驗中學習記憶能力的下降及開放場實驗探索能力的下降等，可以更好的模擬臨床SIVD 病人的認知功能障礙[4，14]。

目前SIVD疾病的發病機制還不清楚，臨床對SIVD的治療主要是對癥治療，中樞膽堿能神經通路損傷和乙酰膽堿（ACh）釋放減少是腦缺血后認知障礙的一個重要促進因素[15，16]。研究表明VD 患者中樞膽堿能神經功能顯著降低，并且中樞神經系統膽堿能的活性與其臨床癥狀是密切相關的[16]。臨床及動物實驗也表明包括多奈哌齊在內的膽堿酯酶抑制劑能夠明顯緩解癡呆的癥狀，改善生活質量[16，17]。膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）催化乙酰輔酶A 和膽堿生成ACh，ChAT活性能間接反映ACh在腦中合成的變化；而AchE 是ACh的水解酶，催化ACh分解成膽堿和乙酸，其活性能間接反映ACh在腦中分解的改變，兩者共同維持著體內ACh的動態平衡[15-18]。通過增加ACh的合成，或者抑制其分解，或者直接作用于膽堿能神經的受體，均可調節膽堿能神經功能，改善膽堿能神經功能下調所造成的認知功能障礙[16-18]。但是膽堿酯酶抑制劑存在較多的胃腸道反應，使其臨床使用受到了一定的限制。如何減輕該類藥的副作用或者研究其他藥物、發現新的治療靶點，對于SIVD的治療具有迫切的現實意義[19]。

隨著傳統中醫藥的創新性用途的不斷開發研究，從祖國傳統中草藥中尋找有效成分用于治療神經退行性疾病及改善認知損害等方面成為研究熱點。丹皮酚是從毛茛科植物牡丹皮和蘿藦科植物徐長卿的全草等中提取的一種呈白色針狀結晶的酚類化合物，眾多體內外研究表明丹皮酚的藥理作用十分廣泛：丹皮酚能夠通過抗氧化應激、抗炎、減輕Ca2+超載、增加側支循環等機制減輕心臟與腦缺血再灌注損傷，并且能緩解AD大鼠、PD小鼠、血管性認知障礙小鼠及焦慮抑郁小鼠的認知功能障礙及神經損傷[5-9，20，21]。但是對于rUCCAO方法建立SIVD小鼠尚無相關報道。

本實驗采用SIVD小鼠模型，用于研究丹皮酚對SIVD小鼠認知功能的影響。在本研究，丹皮酚（40 mg/kg）能明顯逆轉SIVD小鼠在開放場中間區域停留時間的降低，并且在水迷宮實驗中中，與SIVD模型組比較，經過丹皮酚（40 mg/kg）治療后SIVD小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，并且在目標（原平臺）象限中停留的時間及穿臺次數都明顯增多。同時，經丹皮酚（40 mg/kg）治療后，SIVD小鼠腦內ChAT活性升高，AChE活性下降，改善了膽堿能系統的功能，調節了Ach代謝，有利于改善SIVD小鼠的癥狀。而與模型組比較，丹皮酚（20 mg/kg）治療上述各指標均無統計學意義（P>0.05），表明丹皮酚的上述改善SIVD小鼠癥狀的作用與劑量也有一定的關系。當然丹皮酚的最適劑量仍需要進一步實驗研究。

綜上所述，通過本次實驗發現丹皮酚為促進學習記憶、改善認知功能障礙的中藥活性成分，其作用機制可能涉及到改善海馬膽堿能系統的功能。本研究提示丹皮酚在治療皮質下缺血性血管性癡呆方面具有潛在的應用價值，但是其改善認知功能的具體機制仍有待于進一步研究。

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（收稿日期：2016-08-20）