三種常見殺菌劑對白僵菌純化以及生產中作用研究

王雪+馬軍+蘭瑩+趙東鵬+張躍華+趙晨晨

摘 要：為篩選出適合白僵菌生產中使用的高效殺菌劑。以3種常見的殺菌劑作為試劑，采用抑菌圈法和生長速率法，研究3種殺菌劑對白僵菌生產中常見雜菌的抑制效果及其對白僵菌菌絲生長的影響。結果表明：在最高稀釋濃度條件下，脫氫乙酸鈉抑制3種雜菌效果最好的同時，對白僵菌的抑制率也為最大。二氯異氰尿酸鈉對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制效果優于富馬酸二甲酯，但對枯草芽胞桿菌的抑制效果較差，且對白僵菌影響較小，可作為白僵菌殺菌劑。

關鍵詞：白僵菌；殺菌劑；雜菌；抑制試驗

中圖分類號：S482.2 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170532001

白僵菌屬蟲草菌科（Cordycip-itaceae），蟲草屬（Cordyceps）[1]，是一類重要的昆蟲致病真菌，被廣泛應用于農林害蟲防治[2]。其菌落初期多呈現為白色，而后變為淡黃色或淡紅色，背面無色、淡黃至粉紅色[3]。在分生孢子梗或菌絲上聚合成在低倍鏡下即可看到的球形、卵形的孢子頭[4]。在白僵菌生物農藥與傳統化學農藥相比中，白僵菌生物農藥具有不產生抗性、專一性強無化學農藥殘留、和使用安全等無可比擬的優勢[5]。但因生產由于大量細菌及放線菌，如大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus 金葡菌）、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）等與白僵菌的生長條件相近，常導致白僵菌生產過程中嚴重污染，影響生產效率。在白僵菌生產過程中，需要即能有效分離又不抑制白僵菌生長的分離培養基，并能保證分離和培養過程中白僵菌的生長不受非目標菌的影響。該研究通過抑菌圈與生長速率法，測試了3種常見殺菌劑對白僵菌生產中常見雜菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果，同時結合3種殺菌劑對白僵菌菌絲的影響結果，篩選出抑制效果較好的藥物，以期為解決白僵菌生產中的實際問題提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試藥劑

脫氫乙酸鈉（DHA-S）、富馬酸二甲酯（DMF）、二氯異氰尿酸鈉（SDIC）。

1.1.2 供試菌株

卵孢白僵菌（鹽城市神微生物菌種科技有限公司提供）。

1.1.3 供試試劑

依據藥劑推薦的最佳濃度范圍進行不同濃度梯度的設置，調整至3種藥劑的稀釋倍數相同。DHA-S、DMF、SDIC配比稀釋濃度均分別為0.2mg/mL、0.4 mg/mL、

0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL。

1.1.4 培養基的配方

PDA培養基瓊脂20.0g/L、馬鈴薯200g/L、葡萄糖20.0g/L；牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、氯化鈉10.0 g/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備卵孢白僵菌懸液

稱取0.5g卵孢白僵菌粉劑，在無菌工作條件下，放入裝有100mL無菌水的錐形瓶中，封口并震蕩3～5min，使其均勻分散，制成菌懸液。

1.2.2 白僵菌的分離與純化

無菌移液管移取0.1mL制好的白僵菌菌懸液，取無菌三角玻棒，把上述菌懸液在PDA平板表面涂抹均勻。將制備的帶菌平板倒置于28℃恒溫箱中培養2d。無菌條件下取培養的菌株，用接種環挑取少量菌絲于PDA培養皿，于28℃培養箱內靜置培養2d。在無菌工作條件下，接種于PDA試管斜面培養基，置于28℃培養箱內靜置培養2d。后置于4℃冰箱內保存備用。

1.2.3 抑菌圈法測3種殺菌劑對白僵菌有害雜菌的抑制效果

取4℃冰箱保存的3種斜面雜菌菌株，在無菌條件下，分別加入20mL無菌水，充分振搖稀釋后分別置于已滅菌的50mL三角瓶內，得到3種菌懸液，涂布培養，用滅菌鑷子夾取直徑為6mm消毒濾紙片投入不同藥液中浸藥3min，對照組將濾紙片放于無菌水中浸泡3min，每組3次重復；然后將帶不同濃度藥的濾紙片分別放置牛肉膏蛋白胨培養皿中央，并做好標記。置于28℃恒溫培養箱內培養，24h后采用十字劃線法測量抑制圈直徑并記錄。

1.2.4 生長速率法測3種殺菌劑對白僵菌的抑制效果

取4℃冰箱保存的斜面白僵菌菌株，在無菌工作條件下，轉接到含有不同濃度梯度的3種殺菌劑的固體培養基上。以不含藥劑的PDA培養皿作為對照，每組3次重復；觀察菌絲生長情況，采用十字交叉法進行各組菌絲直徑的確定。按以下公式計算菌絲生長抑制率[6]：

（1）

2 結果分析

2.1 3種殺菌劑對白僵菌有害雜菌大腸桿菌的抑制效果

對白僵菌有害雜菌大腸桿菌的抑制試驗結果表明：對大腸桿菌抑制效果最佳的為DHA-S，在其測試濃度范圍內，6組處理濃度的效果都很明顯，抑菌圈直徑范圍在21.7～42.0mm內；SDIC的效果次之，抑菌圈直徑變化范圍為13.1～34.2mm；而DMF效果最低，抑菌圈直徑在7.57～ 17.8mm范圍內。且不同濃度藥品間差異較大（見圖1）。

2.2 3種殺菌劑對白僵菌有害雜菌金黃色葡萄球菌的抑制效果

對金黃色葡萄球菌的抑制試驗結果表明：DHA-S對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑范圍為27.2～41.6mm；DMF抑菌圈直徑最小為17.0 mm，1.0 mg/mL濃度的抑菌圈直徑為29.9mm，而在1.2mg/mL濃度的抑菌圈直徑為24.5mm，抑制效果與1.0mg/mL濃度液比抑制效果較差；而SDIC對金黃色葡萄球菌的抑制效果較差，抑菌圈直徑范圍在8.5～22.7mm內。每種殺菌劑6組處理濃度的抑菌圈直徑形成較大差異（見圖2）。

2.3 3種殺菌劑對白僵菌有害雜菌枯草芽孢桿菌的抑制效果

對枯草芽孢桿菌的抑制試驗結果表明：3種殺菌劑的6組處理濃度的效果都很明顯，其中對枯草芽孢桿菌抑制效果最佳的為DHA-S，其抑菌圈直徑范圍為21.7～ 42.5mm；SDIC效果次之，抑菌圈直徑范圍在7.9～20.3mm，且0.6mg/ml濃度與0.8mg/mL濃度形成較大差異；而DMF效果最低，抑菌圈直徑范圍為7.6～16.2mm（見圖3）。

2.4 3種殺菌劑對白僵菌菌絲生長的抑制效果

對白僵菌菌絲生長的影響試驗結果表明：3種殺菌劑對白僵菌菌絲生長有明顯的抑制，就其抑制效果而言，在1.2mg/ml濃度條件下，DHA-S對白僵菌菌絲生長的抑制效果最強，高到100%，DMF對白僵菌菌絲生長的抑制效果最弱為53.56%，SDIC可達到62.45%（見圖4）。

圖4 對白僵菌菌絲的生長抑制率

3 結論分析

實驗結果表明：DHA-S抑制效果最好，但DHA-S對白僵菌菌落的生長有較大的影響，不符合在生產中即能抑制雜菌生長又對白僵菌菌絲生長無抑制效果或抑制效果較弱的要求。SDIC和DMF對有害雜菌有一定的抑制作用，且不會對白僵菌生長產生不良影響，都可以作為白僵菌生產中的抑菌劑。同時SDIC和DMF對雜菌的抑制效果不同，因此可以根據生產中雜菌污染情況選擇性地使用符合要求的藥劑。

參考文獻

[1]呂思行，劉吉平，湯歷，等.兩廣地區家蠶白僵菌的SSRs遺傳多樣性[J]. 昆蟲學報， 2012，55（10）.

[2]Feng MG. Production， formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control： current status[J]. Biocontrol Science & Technology， 1994， 4（1）：3-34.

[3]許壽濤.殺蚜球孢白僵菌孢子乳懸劑的改進、中試及田間應用效果評價[D]. 浙江大學， 2002.

[4]赫英偉.白僵菌的研究概況[J].黑龍江農業科學， 2010（4）：

145-147.

[5]張英財，農向群，張澤華，等. 18種化學農藥與綠僵菌相容性研究[J].中國生物防治學報.2012，28（2）.

[6]楊華，徐金柱，秦長生，等.3種真菌抗生素對綠僵菌和6種非目標真菌的生長影響分析[J].廣東林業科技， 2014，30（6）：34-39.